ここでは、ラットの繁殖方法、水泳訓練手順、および訓練後の妊娠中のラットの繁殖後の看護プロトコルを描写するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、妊娠中の母親の運動が子孫に及ぼす影響とその基礎となるメカニズムを研究するための動物モデルを提供します。
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方法論記事
妊娠中のラットのための水泳運動プロトコルとケア方法
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
健康と疾患の発達起源の概念は、糖尿病、心血管疾患、癌などの慢性非感染性疾患に対する初期の環境の影響を強調しています。動物モデルを用いた研究では、栄養不良、栄養過多、肥満、化学物質や低酸素症への曝露などの母体要因が胎児の発育や子孫の健康にどのような影響を与え、低出生体重児、高血圧、脂質異常症、インスリン抵抗性などの問題を引き起こすかが調査されています。生殖年齢の女性の間で太りすぎや肥満の有病率が増加していることを考えると、効果的な介入が重要である。妊娠中の母親の運動は、母親と子供の両方に利益をもたらし、病気のリスクを減らす重要な介入として浮上しています。この研究では、妊娠中のラットを対象とした3つの運動モデル(自発的なホイールランニング、電動トレッドミル、水泳)の違いを比較しています。水泳は、その安全で制御された強度レベルのために最も有益なオプションです。このプロトコルでは、ラットの繁殖方法、妊娠中の水泳トレーニング、および繁殖後の看護プロトコルについて詳しく説明します。このモデルは、さまざまなラットおよびマウス種に適しており、母親の運動が子孫の健康と世代間の健康に対する利点を研究するのに役立ちます。
概要
健康と疾患の発達的起源(DOHaD)の概念は、過去20年間で出現し、初期の発達中の環境の影響が、慢性非感染性疾患(NCD)、特に糖尿病、心血管疾患、および一部の種類の癌に関連する後の病態生理学的プロセスのリスクに影響を与えることを示しました1.胎児の発育の最も可撓性的な段階では、子孫が子宮内環境にさらされるため、遺伝子と環境の相互作用と子宮胎盤の灌流が胎児のリプログラミングの重要な要素です2。これまでの研究では、主に動物モデルを利用して、妊娠中の母親の栄養不足、栄養過多、肥満、出生前の化学物質や低酸素症への曝露など、胎児の発育や子孫の長期的な表現型への影響に対する悪影響を調査してきました3。これにより、低出生体重児とその後の成長が生じ、血圧の上昇、脂質異常症、インスリン抵抗性などの子孫に悪影響が生じました4。生殖年齢の女性の間で太りすぎと肥満の割合が急速に増加しているため、これらの有害な母体障害の世代間感染を防ぐための効果的な介入を確立することが緊急に必要であり、これは人々の健康に重要な影響を及ぼします5,6。
運動は、2型糖尿病、高血圧、およびその他のいくつかの疾患の重要な予防療法として長い間認識されてきました7。妊娠中の運動は、母親に有益な効果をもたらし、子孫に有益な効果を与えるため、母親の子孫への病気の伝染を減らす8。数年にわたる研究により、運動の安全性と、妊娠糖尿病などの一般的な妊娠状態の大幅な減少を含む大きな利点が実証されています9,10。母体と胎児の安全に関しては、運動訓練の実施と授乳後のプロトコルの実施は困難です。
デビッド11他。心血管の健康研究に適用可能な動物運動モデルについて説明しました。一般的に使用される3つのエクササイズモデル、自発的なホイールランニング、電動トレッドミル、水泳には、長所と短所があります。自発的に動く車輪は、ラットの自発運動行動を忠実に模倣しており、ネズミが概日リズムに従って動くことを可能にします。ただし、この種のエクササイズには、強度と持続時間をより正確に制御する必要があります。電動トレッドミルは、運動の強度、量、持続時間を制御できますが、時には電気刺激が必要になるため、動物に身体的および心理的ストレスを引き起こす可能性があります。水泳は、ラットの固有の遊泳能力により、げっ歯類の研究で広く使用されており、電気刺激や足や尾への機械的損傷も回避できます12。出生前運動モデル13,14の研究では、水泳は一般的に使用される運動モダリティです。妊娠が進行し、ラットの腹部が腫れると、トレッドミルやホイールランニングのエクササイズにより、腹部が硬い表面に繰り返し接触することがあります。対照的に、水泳中の水環境は浮力を提供し、妊娠中の動物の運動関連の怪我のリスクを減らします。
このプロトコルは、ラットの繁殖方法、妊娠中の水泳トレーニングの実施方法、およびトレーニング後の妊娠中のラットの繁殖後の看護プロトコルを示しています。この妊娠した遊泳トレーニングモデルは、ラットやマウスの幅広い種に適用できるため、動物ベースのモデルを使用して、母親の運動が子孫の健康に与える有益な効果と世代を超えた運動の利点を調節するメカニズムを研究するための将来の研究に有用なげっ歯類モデルを提供する可能性があります。
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プロトコル
ここに記載されているすべての方法は、北京スポーツ大学の動物倫理委員会によって承認されており、国立衛生研究所(NIH)のガイドライン、中国の動物保護法および機関のガイドラインに準拠して実施されています。
1.ラットの交配と給餌
- 特定の病原体を含まない(SPF)定格の10週齢のWistar雌ラットと11週齢のWistar雄ラットを購入します。
- 適応給餌の実施:Wistarラットに標準的なげっ歯類の食事を自由に給餌し、指定された給餌施設で1週間水道水へのアクセスを提供します。すべてのラットが、22°Cの一定温度と45〜55%の湿度で12時間の明暗サイクルで飼育されていることを確認してください。
- 雌ラットの発情を調べます。
- 清潔なガラス顕微鏡スライド、直径2 mmの綿棒、生理食塩水(0.9%NaCl)、顕微鏡などの機器と材料を準備します。
- 各顕微鏡スライドに日付とラットの識別をラベル付けします。
- 午後6時から7時の間に、ストレスを最小限に抑えるために、雌のラットを優しく拘束します。親指と人差し指で尾の付け根をつかみ、他の指からラットの腰椎に圧力をかけます。
- 尻尾の先を持ち上げ、膣を露出させます。生理食塩水で綿棒を湿らせてから、先端を膣に入れ、先端をそっと転がして膣分泌物を集めます。
- 綿棒の先端をスライド全体に転がし、同じ領域に再適用しないようにします。
- 顕微鏡で塗抹標本を検査し、低倍率対物レンズ(10倍)を使用して細胞の位置を特定し、観察します。
注:発情期には、膣分泌物はより大きな上皮核が消失し、扁平上皮の剥離した角質化上皮細胞に置き換わり、マウンドに蓄積します。 - 各ラットの発情周期の段階を記録します。
- 午後7時から8時の間に、雄と雌のラットを交尾ケージに入れます。
注:雌のラットは、交配のために発情前または発情期にある必要があります。 - 2日目の午前7時から8時の間に、交尾ケージに交尾プラグがないか調べます。交尾ケージの基部に交尾プラグが見つかった場合は、ステップ1.3.4〜1.3.6で説明したのと同じ方法に従って、雌ラットの膣分泌塗抹標本の作成に進みます。
注:交尾プラグは、雄ラットの精嚢と前立腺分泌物と膣分泌物を組み合わせた乳白色または黄色がかったゼラチン状の材料です。 - 雌ラットの妊娠を確認する:交配ケージに交尾栓を見つけた後、膣分泌塗抹標本で精子を観察します。この日を妊娠1日目(GD1)と指定します。
- 妊娠中のラットを別のケージに隔離します。
注:妊娠の初期段階では、妊娠中のラットがその環境でなじみのないオスの化学的手がかりに遭遇したり、なじみのないオスのラットと同棲したりするのを防ぐことが不可欠です。 - ラットの妊娠期間は通常21-23日続きます。GD1からGD20までのラットの体重を測定し、記録します。
- GD20では、妊娠中のラットのケージを清潔なものと交換し、医療用吸収綿(ラットと同様のサイズ)をケージに入れます。7日間の生存に十分な水と餌を供給し、ケージを静かな場所に置きます。
注:ラット分娩後少なくとも1週間はケージを交換しないでください。清潔なケージに切り替えるときは、使用済みの吸収性綿を汚れたケージから新しいケージに移して、ラットが子孫の香りを認識できるようにします。 - 産後21日目 に、子孫を性別で分け、2つのケージに入れます。
注:生後21日の子孫のサイズが小さいため、ケージ内のガラスシャーレに硬い飼料ペレットを入れます。
2. 出生前水泳トレーニングプログラム
- すべての実験雌ラットに対して5日間の適応訓練を実施します。
- 高さ20cm以上の透明なプラスチック容器を用意し、34°C±1°Cで10cmの水を入れます。
- ネズミの尻尾の先をつかんで持ち上げ、ネズミを水の中に置きます。
- 15分間の適応トレーニングでは、5分ごとに水温を注意深く監視し、温水を追加して温度を維持します。
- 訓練後、ラットを34±1°Cのきれいな水に移して毛皮を洗います。次に、ネズミをタオルでケージに移し、ヘアドライヤーを使用して毛皮を乾かします。
注意: 騒音や暑い環境は、ネズミにストレスを与える可能性があります。したがって、温度調節可能で静かなヘアドライヤーを使用することをお勧めします。 - ネズミをそれぞれのケージに戻してください。
- ラットの交配(手順1.3-1.6に従ってください)。
- ステップ1.7の後、妊娠中のラットを座りがちなグループ(SED)と運動グループ(EX)にランダムに割り当てます。
- すべてのトレーニングセッションの前に、毎日ラットの体重を量ります。
注:適応トレーニング中、ラットの体重減少は3 g /日を超えてはなりません。出生前のトレーニング中、ラットの体重は徐々に増加するはずです。ラットが1日あたり3g以上減少した場合は、回復を可能にするために毎日のトレーニング時間を50%減らします。 - GD1からGD20までのEXの出生前水泳トレーニングを週6日、朝8:00から9:00まで実施します。
- 直径50cm、高さ50cm以上の円形の水入りバケツを用意し、34°C±1°Cの温度で40cmの水を入れます。
- GD1からGD5まで、最初は1日20分間の水泳トレーニングを行い、徐々に1日60分に増やします。
- GD6からGD20まで、1日60分間の運動トレーニングを週6日間続けます。
- アフターケアについては、手順2.1.4-2.1.5を参照してください。
- 運動後、EXラットにげっ歯類のヒマワリの種5gを与えて栄養サポートを提供します。
- 毎日のEXトレーニング中に、SEDラットを適応トレーニングと同じ水環境に置きます(ステップ2.1.1)。SEDラットをEXラットと同じ時間を水環境で過ごしさせます。運動後、SEDラットに5gのげっ歯類のヒマワリの種を与えて、栄養サポートとなだめるような感情を提供します。
- 各水泳トレーニングセッションの後、水バケツやタオルを含むすべての機器を紫外線で洗浄および消毒します。
3. 胎児の身体的特徴
- GD20.5の朝、雌ラットに3%イソフルランで麻酔をかけ、CO2 チャンバーで安楽死させます。
- 外科用ナイフを使用して、ラットの下腹部を切開します。切開部が腹部の両側に向かって傾斜し、子宮が完全に露出していることを確認してください。
- 鉗子とハサミを使用して子宮を慎重に開き、胎児と胎盤を露出させます。ハサミによる胎児や胎盤の損傷を避けるために、鉗子を使用して胎児を取り巻く薄い羊膜を穏やかに分離します。
- 滅菌ガーゼを使用して胎児の体をきれいにし、血液と粘液を取り除きます。胎児と胎盤を解剖学的位置ごとに順番に分離し、体重を量ります。
- 肛門と生殖器の間の距離を観察して、胎児の性別を判断します。男性の胎児は女性よりも距離が長いです。将来の参照のために、胎児の性別と量を記録してください。
- 横たわった状態でキャリパーを使用して胎児の長さを測定します。胎児はまだ生きているため、解剖後に丸くなることがありますので、体を広げて測定してください。
注:実験結果の一貫性と測定方法の一貫性を確保するために、同じ実験者が全体を通して同じ基準を維持します。胎児は施設が推奨するガイドラインによって安楽死させ、必要に応じてさらなる分析のために組織サンプルを採取しました。
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結果
ラットの育種方法のセクション(図1)では、繁殖の成功率を高めるために、膣分泌スライドを作成することにより、雌ラットの発情周期を決定します。ラットの発情周期は、発情前、発情、メストラス、および発情筋を含む4〜5日続きます。メストラスまたはディストラスの雌ラットは、オスから距離を置くなどの行動を示します。同時に、発情期のものは交尾を望んでおり、雌ラットの排卵は主に発情期の終わりに起こります。発情前期には、膣塗抹標本サンプルには主に有核上皮細胞が含まれ、時折角質化した細胞が含まれます。発情期には、膣塗抹標本は主に角質化した扁平上皮細胞が山に凝集し、発情期に見られる上皮細胞の拡大した核が消失します。メステストラスでは、膣塗抹標本には主に白血球といくつかの角質化上皮細胞が含まれています。発情期は、白血球が優勢であり、時折、有核化および角質化した上皮細胞を伴います(図1A)。
交尾プラグは、膣と精液の分泌物で構成されるゲル状の物質です。雌ラットは、他の雄ラットが再び交尾するの...
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ディスカッション
本研究は、詳細なラット交配法、遊泳訓練プロトコル、胎児の生理学的指標を評価するための研究方法など、妊娠ラットに対する実行可能な運動プログラムを確立することを目的としています。私たちは、実践を通じて出生前の水泳運動トレーニングモデルを開発し、プロトコルで発生する可能性のある潜在的な問題に対応する解決策を開発しました(表1)。このプロトコルは、それをより実用的にし、研究者が出生前運動モデルを確立するのを支援します。
私たちの研究結果は、私たちが設計したラット妊娠遊泳トレーニングプログラムを使用しても、ラットの正常な妊娠過程を妨げず、妊娠に悪影響を及ぼさないことを示しています。ラットの妊娠転帰に対する出生前運動の影響は、流産率と同腹児数を測定することによって評価されました。この研究では、出生前の運動はこれらの要因に有意な影響を与えなかったと結論付けました15,16。胎児を...
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謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(32071174、32200941、32371183、31771312)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| キャリ | パーMitutoyo測定器(上海)有限公司 | 530-101 N15 | 胎児解剖円形 |
| 水バケツ | Naliya | N / A | ラット水泳 |
| 実験手術器具 | 深センRWDライフテクノロジー株式会社 | SP0001-G | 胎児解剖 |
| ガラス顕微鏡スライド江 | 蘇泰実験装置株式会社 | 80312-3161 | 膣塗抹ガラス |
| トリ皿 | メルクライフテクノロジー | ズBR455751-10EA | 子孫育成 |
| ヘアドライヤー | パナソニック | EH-WNE5H | 水泳後ケア |
| 情報カード | Zhongke。ライフサイエンス | SS3 | ラット交配 |
| イソフルラン | センRWDライフサイエンステクノロジー株式会社 | R510-22-10 | 胎児解剖 |
| 光学顕微鏡 | リンパス | IX71-F22PH | 膣塗抹標本 |
| 配ケージ | Zhongkeライフサイエンス | SS3 | ラット交配 |
| 医療吸収綿 | Hongxiang衛生材料有限公司 | N / A | 妊娠中のラットは出産を見越して |
| げっ歯類麻酔器、ガス麻酔深 | センRWDライフテクノロジー株式会社 | R500IE | 胎児解剖 |
| げっ歯類繁殖飼料北京 | 華富港バイオテクノロジー株式会社 | 、株式会社1032 | のラットの餌やり |
| げっ歯類メンテナンスフィード | 北京華康バイオテクノロジー株式会社 | 1022 | の飼育 |
| げっ歯類のヒマワリの種 | ジョリー | JP241 | 補助食品 |
| 防音綿 | クフ医療機器 | N / A | 妊娠中のラットは出産を期待 |
| 滅菌綿棒(直径2ミリメートル) | クフ医療機器 | N / A | 膣塗抹標本 |
| ガーゼ | クフ医療機器 | N / A | 胎児解剖脳 |
| 卒中生理食塩水(0.9%NaCl) | 山東Hualu Pharmaceutical Co.、LTD | N / A | 膣塗抹 |
| 標本温度計 | Beekman生物 | N / A | ラット水泳のモニタリング |
| タオル | ス | N / A | 遊泳後のケア |
| 透明プラスチック容器 | Naliya | N / A | 水泳適応トレーニング紫外線 |
| Merck Life Technologies | Z169633-1EA | 遊泳後のケア | |
| 給湯器 | ハイアール | EC6001-Q6S | ラット スイミング |
| ウェイト スケール | エレクトロン アケーレ | JM.A10001 | 体重測定 |
| Wistar Rats | Vital river Laboratory Animal Technology Co., LTD | N/A | EXPERIMENT |
参考文献
- Hanson, M. A., Gluckman, P. D. Early developmental conditioning of later health and disease: Physiology or pathophysiology. Physiol Rev. 94 (4), 1027-1076 (2014).
- Calkins, K., Devaskar, S. U. Fetal origins of adult disease. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 41 (6), 158-176 (2011).
- Chavatte-Palmer, P., Tarrade, A., Rousseau-Ralliard, D. Diet before and during pregnancy and offspring health: The importance of animal models and what can be learned from them. Int J Environ Res Public Health. 13 (6), 586(2016).
- Lapehn, S., Paquette, A. G. The placental epigenome as a molecular link between prenatal exposures and fetal health outcomes through the dohad hypothesis. Curr Environ Health Rep. 9 (3), 490-501 (2022).
- Shrestha, A., Prowak, M., Berlandi-Short, V. M., Garay, J., Ramalingam, L. Maternal obesity: A focus on maternal interventions to improve health of offspring. Front Cardiovasc Med. 8, 696812(2021).
- Haire-Joshu, D., Tabak, R. Preventing obesity across generations: Evidence for early life intervention. Annu Rev Public Health. 37, 253-271 (2016).
- Kusuyama, J., Alves-Wagner, A. B., Makarewicz, N. S., Goodyear, L. J. Effects of maternal and paternal exercise on offspring metabolism. Nat Metab. 2 (9), 858-872 (2020).
- Blaize, A. N., Pearson, K. J., Newcomer, S. C. Impact of maternal exercise during pregnancy on offspring chronic disease susceptibility. Exerc Sport Sci Rev. 43 (4), 198-203 (2015).
- Hinman, S. K., Smith, K. B., Quillen, D. M., Smith, M. S. Exercise in pregnancy: A clinical review. Sports Health. 7 (6), 527-531 (2015).
- Acog committee. Physical activity and exercise during pregnancy and the postpartum period: Acog committee opinion, number 804. Obstet Gynecol. 135 (4), e178-e188 (2020).
- Poole, D. C., et al. Guidelines for animal exercise and training protocols for cardiovascular studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 318 (5), H1100-H1138 (2020).
- Beleza, J., et al. Self-paced free-running wheel mimics high-intensity interval training impact on rats' functional, physiological, biochemical, and morphological features. Front Physiol. 10, 593(2019).
- August, P. M., Rodrigues, K. D. S., Klein, C. P., Dos Santos, B. G., Matté, C. Influence of gestational exercise practice and litter size reduction on maternal care. Neurosci Lett. 741, 135454(2021).
- Li, S., et al. Prenatal exercise reprograms the development of hypertension progress and improves vascular health in shr offspring. Vascul Pharmacol. 139, 106885(2021).
- Li, S., et al. Exercise during pregnancy enhances vascular function via epigenetic repression of ca(v)1.2 channel in offspring of hypertensive rats. Life Sci. 231, 116576(2019).
- Musial, B., et al. Exercise alters the molecular pathways of insulin signaling and lipid handling in maternal tissues of obese pregnant mice. Physiol Rep. 7 (16), e14202(2019).
- Dos Santos, A. S., et al. Resistance exercise was safe for the pregnancy and offspring's development and partially protected rats against early life stress-induced effects. Behav Brain Res. 445, 114362(2023).
- Barnes, M. D., Heaton, T. L., Goates, M. C., Packer, J. M. Intersystem implications of the developmental origins of health and disease: Advancing health promotion in the 21st century. Healthcare. 4 (3), 45(2016).
- Bakrania, B. A., George, E. M., Granger, J. P. Animal models of preeclampsia: Investigating pathophysiology and therapeutic targets. Am J Obstet Gynecol. 226, S973-S987 (2022).
- Ferrari, N., et al. Exercise during pregnancy and its impact on mothers and offspring in humans and mice. J Dev Orig Health Dis. 9 (1), 63-76 (2018).
- Lerman, L. O., et al. Animal models of hypertension: A scientific statement from the american heart association. Hypertension. 73 (6), e87-e120 (2019).
- Mangwiro, Y. T. M., et al. Exercise initiated during pregnancy in rats born growth restricted alters placental mtor and nutrient transporter expression. J Physiol. 597 (7), 1905-1918 (2019).
- Kim, H., Lee, S. H., Kim, S. S., Yoo, J. H., Kim, C. J. The influence of maternal treadmill running during pregnancy on short-term memory and hippocampal cell survival in rat pups. Int J Dev Neurosci. 25 (4), 243-249 (2007).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nat Metab. 2 (8), 678-687 (2020).
- Zhang, Y., et al. Maternal exercise represses nox4 via sirt1 to prevent vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in shr offspring. Front Endocrinol. 14, 1219194(2023).
- Shan, M., et al. Maternal exercise upregulates the DNA methylation of agtr1a to enhance vascular function in offspring of hypertensive rats. Hypertens Res. 46 (3), 654-666 (2023).
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