ヒト脂肪由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の精製とキャラクタリゼーション

サマリー

このプロトコルは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の培養や上清の収集から、超遠心分離を使用した細胞外小胞(EV)の抽出まで、すべての手順を説明しています。

要約

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)は、さまざまな組織や臓器の再生と再構築を促進することができます。最近の研究では、それらの再生機能は、細胞間接触と細胞パラクリン効果に起因する可能性があることが示唆されています。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な方法であり、細胞外小胞(EV)がキャリアとしての機能的役割を果たします。ADSC EVは、再生医療に大きな可能性を秘めています。これらの方法の有効性については、複数の研究で報告されています。現在、EVを抽出および単離するためのさまざまな方法が、遠心分離、沈殿、分子サイズ、親和性、マイクロ流体工学などの原理に基づいて説明されています。超遠心分離は、EVを分離するためのゴールドスタンダードと見なされています。それにもかかわらず、超遠心分離中の予防措置を強調するための細心の注意を払ったプロトコルはまだ存在しません。この研究では、ADSC培養、上清収集、およびEV超遠心分離に関与する方法論と重要なステップを示します。しかし、超遠心分離は費用対効果が高く、さらなる治療を必要としないにもかかわらず、回収率が低い、EVが凝集するなど、避けられない欠点がいくつかあります。

概要

ほとんどのADSCは脂肪組織に由来し、心筋、骨、皮膚など、さまざまな組織や臓器の再生と再建を促進することが実証されています¹。最近の研究では、ADSCの再生機能は、細胞間接触と細胞のパラクリン効果によるものである可能性が示唆されています²。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な手段であり、この機能は細胞外小胞(EV)を介して達成されます。

EVは、細胞が作り出す二重膜構造で、直径は40nmから160nm(平均約100nm)です。それらは、サイトカイン産生、細胞増殖、アポトーシス、代謝など、さまざまな細胞機能に影響を及ぼします^3,4。ADSC EVの機能については、骨再生の促進、口腔粘膜組織の再生、組織移植後の脂肪組織の生存、皮膚創傷修復など、数多くの研究が行われてきた5,6,7,8。ADSC EVの再生医療における大きな可能性は明らかです。上清からEVを抽出し分離するには、遠心分離、沈殿、分子サイズ、親和性、マイクロ流体工学に基づく技術など、さまざまな方法が存在します。超遠心分離法は、^EV9を分離するためのゴールドスタンダードと広く考えられています。EV分離のための超遠心分離の基本原理は、サンプル中の粒子の沈降係数が異なるため、粒子が沈降し、異なる分離層に凝集するという事実に基づいています。しかし、超遠心分離時の注意点を強調した詳細なプロトコルは未だ確立されていません。

したがって、この研究では、ADSC培養、上清収集、およびEVの超遠心分離手順と重要なポイントを、情報の論理的な流れと明確で形式的な言語を使用して客観的に概説します。これは、将来の実験の貴重な参考資料となります。

プロトコル

プロトコルの手順の概要を 図 1 に示します。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 培地の準備

1. 450 mLの基礎培地、エクソソームを含まないウシ胎児血清50 mL、および5 mLのトリプル抗生物質を使用して、エクソソームを含まないADSC用の培地を調製します。

2. ADSCの蘇生と培養

注:ADSCを蘇生します。

1. 超清潔なテーブルの紫外線を事前にONにし、30分間消毒してください。
2. あらかじめ37°Cのウォーターバスで培地を予熱してください。
3. 凍結したADSC(P3)のチューブ2本を液体窒素から取り出し、37°Cの水浴で一定温度で完全に解凍するまで攪拌します。
   注意: 汚染を防ぐために、冷凍庫チューブの開口部を水に接触させないでください。
4. 凍結保存チューブを75%アルコールで消毒し、超清潔なテーブルに移します。ピペットを使用して細胞懸濁液を吸引し、15 mLの遠心チューブに入れます。
5. 遠心分離機チューブを低速遠心分離機に入れ、250 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
6. 10cmの培養皿を4つ用意し、各皿に9mLの培地を入れます。名前、細胞の種類、世代、実験日をマークし、37°Cのサーモスタットセルインキュベーターで予熱します。
7. 遠心分離管を消毒し、超清潔なテーブルに移動します。ピペットで上清を取り除きます。
8. 4 mLの培地を加え、溶液(1 x 10⁵ 細胞/mL)を均一に分散するまで穏やかに撹拌します。
   注:上清を抽出するときは、細胞ペレットを除去しないように注意してください。
9. 各皿に1 mLの細胞懸濁液を加えます。クロス法で皿を振る。
   注意: プレートを平らな面に置き、クロスパターンで攪拌します(上下左右に動かします)5〜6回繰り返します。円運動は、中心に細胞が蓄積する可能性があるため、避けてください。
10. 光学顕微鏡で細胞を40倍倍で観察し、皿をインキュベーターに入れます。
    注:細胞を観察する主な目的は、不均一な分布がその後の成長に影響を与えるため、細胞が均等に分布しているかどうかを判断することです。
11. 細胞の交換培地を調製します。
    1. 超清潔なテーブルの紫外線を事前にONにし、30分間消毒してください。
    2. あらかじめ37°Cのウォーターバスで培地を予熱してください。
    3. 光学顕微鏡で細胞の状態を40倍の倍率で観察します。合流レベルは約 50% です。
       注:コンフルエンスレベルは、細胞が壁に付着して完全に伸びた後のペトリ皿の表面積に対する細胞が占める面積の比率として計算されます。
    4. 消毒後、培養皿を超清浄なテーブル(バイオセーフティレベル2)に移し、培地を取り出します。
    5. 各培養皿を2mLのPBS溶液で2回穏やかにすすいでください。
    6. 各皿に10mLの培地を加えます。皿をインキュベーターに移します。

3. ADSC上清の採取とEVの抽出

1. 超清潔なテーブルの紫外線を事前にONにし、30分間消毒してください。
2. 顕微鏡で細胞の状態を観察します。合流レベルは約 80% です。
3. 消毒後、皿を超清潔なテーブルに移します。上清をピペットで慎重に収集し、50 mLの遠心チューブに入れます。
   注:セルは凍結または破棄できます。無菌性が不要な場合は、手術台で以下の手順を実行することができます。この時点で、実験を一時停止し、後で再開できます。実験が中止された場合は、上清を4°Cの冷蔵庫に1週間以内保存してください。長期保管は、EVの活動に影響を与える可能性があるため、お勧めしません。最適なアプローチは、EVをすぐに抽出することです。
4. 遠心分離(300 x g、10分、室温)して、懸濁細胞を除去します。上清をピペットで集めます。
   注:注がないでください。ペレットが吸い上げられるのを防ぐために、上澄みを少し残します。
5. 遠心分離して細胞の破片(2000 x g、10分、4°C)を除去し、続いてピペットで上清を回収します。
   注: 重要なポイントは、手順 3.4 と同じです。
6. 上清を0.22 umメンブレンでろ過して、大きな粒子と細胞の破片を取り除きます。
   注:ろ過前に、上清を2mLの滅菌PBSでろ過し、フィルターメンブレンを湿らせます。
7. 超遠心分離機(10,000 x g、30分、4°C)で遠心分離します。
8. 次に、1,00,000 x g で4°Cで70分間遠心分離し、ペレットを除去し、上清を回収します。
   (注)得られたEVは、純度を高めるために複数回遠心分離により精製されました。ペレットは肉眼では見えない場合があります。したがって、ペレットの収集を避けるために、ピペットを優しく操作し、底に少量の上清を残すことが重要です。
9. ピペットで上清を取り除きます。ペレットをPBSで再懸濁し、遠心分離機(1,00,000 x g、70分、4°C)します。
   注意: ペレットは肉眼では見えない場合があります。したがって、ピペットで上清を吸引する場合、EVの純度を最大化するためには、上清を穏やかかつ完全に除去することが重要です。
10. 上澄みを取り除き、EVのペレットを入手します。1 mLのPBSで再懸濁し、1 mLの遠心分離チューブに移し、その後の検出のために4°Cの冷蔵庫に保管します。
    注意: ペレットは肉眼では見えない場合があります。そのため、ピペットで上清を吸引する際には、EVの純度を最大限に高めるためには、上清を穏やかかつ徹底的に除去することが重要です。サンプルが長期間必要ない場合は、-80°Cの冷蔵庫に保管してください。

結果

まず、ADSCは、その形態¹⁰ および表面抗体を含めて、特徴付けられ、同定されました。 図2Aに基づくと、ADSCは紡錘形に配置され、密集した成長後に渦を形成することが明らかです。培養細胞を脂肪形成細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞に分化させ、オイルレッドO、アリザリンレッド、アルシアン^ブルー11で染色した。誘導分化実験とフローサイトメトリーにより、それらが実際に多方向分化の可能性を秘めたADSCであることが検証されました。しかし、結果では22%の細胞がCD45陽性であり、十分な陽性抗体と陰性抗体がそれを裏付けているため、結論には影響しません(図2A、B)。

次に、抽出されたEVの識別が不可欠です。主に、形態、粒子サイズ、マーカータンパク質の3つの側面が含まれます。TEMの結果は、二重層膜¹² を備えたカップ状のEV構造を明確に示しています(図3A)。NTAは、EVの粒度分布が約50〜150nmで、濃度が約1.6 x 10¹⁰ 粒子/ mLであることを示しています(図3B)。ウェスタンブロット解析では、CD9、CD63、TSG101¹³などのEVのマーカータンパク質もスムーズに発現していることも示されています(図3C)。

図1:プロトコルの手順の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ADSCの特性評価。 (A)ADSCの形態は紡錘状です。ADSCは、それぞれ脂肪原性、骨原性、および軟骨原性の分化のために培地で培養されました。脂肪形成分化は、オイルレッドO染色によって同定されました。骨形成分化および軟骨形成分化は、それぞれアリザリンレッド染色およびアルシアンブルー染色によって確認された。スケールバー:100 μm. (B) MSC表面マーカー(CD90、CD105、CD29、CD73)および造血細胞特異的マーカー(CD31、CD34、CD45、HLA-DR)のADSCのフローサイトメトリー解析。ゲーティング戦略: 最初に空白のグループを丸で囲みます。それに基づいて、各群の標識抗体に従って、CD90、CD105、CD29、CD73、CD31、CD34、CD45、およびHLA-DRを連続して円を描く。この図は、Han, Y. D. et ^al.13 から引用したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:EVの特性評価 (A) TEMの結果から、二重膜のカップ状のEV構造が明確に示されています。スケールバー:200nm。(B)NTAは、EVの粒度分布が約50-150nmで、濃度が約1.6×10¹⁰ 粒/mLであることを示しています。(C)ウェスタンブロットによるエキソソーム中のTSG101、CD9、およびCD63発現の検出。この図は、Han, Y. D. et ^al.13 から引用したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

正式な実験プロセスでは、最良の実験結果を得るためにいくつかのポイントが重要です。私たちの以前の経験に基づいて、可能な限り最高の細胞状態を保証するため、継代3-6 ADSCを選択することをお勧めします。P3より前は、赤血球、内皮細胞、およびその他の雑多な細胞がスクリーニングされていなかった可能性があります。P6以降、細胞は徐々に老化する可能性があり、分泌されたEVの状態に影響を与える可能性があります。次に、細胞の結合度が80%から90%の間にあるときに上清を採取して、できるだけ多くのEVが十分に分泌されるようにする必要があります。EVの純度を最大限に維持するために、研究者は最初の3回の遠心分離では注意を払い、不純物やペレットの吸引を防ぐために液体の残留物が残らないようにする必要があります。最後の2回の遠心分離では、ペレットを保護しながら上清が完全に除去されていることを確認してください。

超遠心分離は費用対効果が高く、それ以上の治療は必要ありません。この手法はEV研究で広く使用されており、特性評価実験によって確認されているように、EVの取得に十分な効率が実証されています。それにもかかわらず、避けられない欠点がいくつかあります。まず、EVの回収率が低いことです。次に、EVは時々集約する傾向があります。さらに、非細胞成分を単離することができ、一部のEVはプロセス中に破裂し、デブリの蓄積につながる可能性がある14,15,16。これらの欠陥に対処するために、ほとんどの研究はEVの精製に焦点を当てています^12,13。しかし、このプロトコールは、細胞培養からエクソソーム精製までの全プロセスをカバーしており、その全プロセスが最終的に抽出されたEVの状態と純度に影響を与えると考えています。操作中は、前述のガイドラインを遵守することが重要です。さらに、3D培養は2D培養と比較してEVの分泌を刺激するのにより効果的であることを多くの研究が示しているため、より多くの上清を収集し、3D細胞培養を実施することは有益である可能性があります^17,18。

このプロトコルは、超遠心分離を使用してADSCからEVを抽出するプロセスの概要を示しています。これは実用的なガイダンスを提供し、実験者が操作中の詳細を可能な限り避けることを可能にします。要約すると、このプロトコルは、実験者がサンプルの品質を向上させるのを支援し、各ステップの詳細に焦点を当てるだけでなく、実験全体を考慮する必要があることを思い出させる役割を果たします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Supor 膜の Acrodisc ニードルフィルター	Acros Organics	4652	0.22 μm
細胞培養用基礎培地	OriCell	BHDM-03011
EXOなしのウシ胎児血清+培養サプリメント(ヒト脂肪由来間葉系幹細胞用)	OriCell	HUXMD-05002
倒立顕微鏡	OLYMPUS	Lx70-S8F2
低速遠心分離機	安徽省USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP 卓上超遠心分離機	Beckman Coulter	393315
ペニシリン-ストレプトマイシン-ゲンタマイシン溶液 (100x)	Solarbio	P1410