Method Article

質量分析を伴わないEUCAST RAST法を容易にする自動微生物同定システムを用いた直接微生物同定(英語)

DOI:

10.3791/66588

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May 24th, 2024

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1Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal, 2Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhubaneswar

In This Article

Summary

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EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。

Abstract

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グラム陰性(GN)敗血症は、リソースが限られている環境での管理が従来の微生物学的培養技術に依存している医療緊急事態であり、3〜4日で結果が得られます。このターンアラウンドタイム(TAT)の遅延を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた自動血液培養ボトル(+aBC)から直接AST結果を決定するためのプロトコルを開発しました。EUCAST rapid AST (RAST) プロトコルは 2018 年に初めて導入され、GN 敗血症の 4 つの一般的な病因、すなわち大 腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、および アシネトバクター バウマニー 複合体のゾーン直径ブレークポイントを報告できます。しかし、この方法を日常的なワークフローに導入している臨床検査室は、質量分析法に基づく微生物同定に依存しており、これは容易に入手できないため、リソースが限られている環境でのこの分析法の導入は困難です。これを回避するために、市販の自動微生物同定および抗菌剤感受性試験システム(aMIAST)を使用して直接接種プロトコル(DIP)を評価し、aBCの陽性フラグから8時間以内の早期微生物同定を可能にしました。2023年1月から10月にかけてこのプロトコルを評価し、陽性フラグが立てられたaBCの4つのRAST報告可能GN(RR-GN)を特定しました。DIPにおける微生物同定結果を、aMIASTの標準的な接種物調製プロトコル(SIP)と比較した。単型GN(+naBC)を持つ204の+aBCのうち、4つのRR-GNのうちの1つがSIPによって105の+naBCで同定されました(大腸菌: 50、 K.pneumoniae: 20、 P.aeruginosa: 9 、A.baumannii 複合体:26)。これらのうち、94%(98/105)がDIPによって正しく識別されましたが、メジャーエラー率と非常にメジャーエラー率はそれぞれ6%(7/105)と1.7%(4/240)でした。EUCAST RAST法を使用して微生物同定のためのDIPを行うと、サンプルを受け取ってから24時間以内に暫定的な臨床レポートを提供できます。このアプローチは、TATを大幅に減少させる可能性を秘めており、適切な抗菌療法を早期に開始することを可能にします。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

敗血症は、重要な世界的な健康問題であり、感染に対する宿主の反応の調節不全による生命を脅かす臓器機能障害と定義されています。「Global Burden of Diseases Study」によると、2017年の世界の敗血症症例数は4,890万人、敗血症関連死者数は1,100万人で、これは全世界の死亡者数の約20%を占めています1。死亡を引き起こす血流感染症(BSI)の約2/ 3は、グラム陰性細菌性病原体によるものです2。グラム陰性菌(GN)の死亡原因としては、 大腸菌、 肺炎桿菌、 緑膿菌、ア シネトバクター・バウマニーが主な原因で、33種類の細菌性病原体のうち約40%を占めています2。

血液培養は依然としてBSIの診断のゴールドスタンダードであり、抗菌薬感受性試験(AST)の結果とともに微生物を迅速に同定することが管理の鍵となります。敗血症3では、適切な抗菌薬の投与が1時間遅れるごとに、死亡率が9%増加すると推定されています。AST結果を含む微生物学的に陽性の血液培養報告のターンアラウンドタイム(TAT)は、自動化されたシステムであっても、リソースが限られている環境で利用可能な微生物学的ツールを使用すると、約48〜72時間です。この標準以下のTATの結果として、広域スペクトルの抗菌薬が経験的に使用され、抗菌薬耐性(AMR)の問題が急増しています。敗血症の微生物学的培養技術のためのTATを削減するこの切実な必要性を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)4,5から直接ASTを実行する方向に進んでいます。

2018年、EUCASTは、Kirby-Bauerディスク拡散法によるASTを短いインキュベーション時間、つまり4時間、6時間、8時間で+aBC 6,7から直接測定するための迅速AST(RAST)法を初めて導入しました。この方法は、BSIの8つの最も一般的な原因の1つであるグラム陰性菌のうち、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、A.バウマニー複合体、およびグラム陽性菌8のうち黄色ブドウ球菌、Enterococcus faecalis、E. faecium、 およびStreptococcus pneumoniaeを含む+aBCのASTを決定するために現在検証されています.さまざまな時間間隔でのAST測定のブレークポイントは、上記の微生物種ごとに提供されています。したがって、AST結果をカテゴリー別に解釈する前に、微生物の同定が必要です。ただし、RAST規格では、この時間枠内で微生物の同定を可能にする方法は指定されていません。

EUCAST RAST法を評価した研究の大部分は、微生物を同定するために、めっき培地上での短いインキュベーション後に質量分析に基づく微生物同定を使用していました9、10、11、12、13、14、15、16、17.しかし、質量分析装置は、特に低中所得国(LMIC)では広く利用できないため、この分析法の潜在的な有用性は大きく制限されています。質量分析を使用せずに、この方法をセンターで実施したことを報告した研究はほとんどありません18,19,20。Tayşi et al.18 は、AST 結果を解釈する前に、グラム染色形態とオキシダーゼ試験に基づいて、Enterobacterales、Pseudomonas、および Acinetobacter spp. の間で GN を広く分類したことを報告しました。このセンターの他の研究では、Guptaら19およびSiddiquiら20による、種レベルの微生物同定は、陽性フラグが立てられた血液ブロス混合物から細菌ペレットを調製し、従来の生化学的試験でそれを接種することによって行われました。Tayşi et al.18 は、彼らのアプローチによる微生物同定の正確さについてコメントしていませんが、Gupta et al.19 は、165/176 (94%) のケースでのアプローチにより、RAST 報告可能なグラム陰性 (RR-GN)、つまり、大腸菌、K. pneumoniae、P. aeruginosa、および A. baumannii のいずれかであると報告しましたコンプレックス。しかし、後者のアプローチでは、RAST結果の読み取りは、従来の生化学的結果の完全なインキュベーション後、すなわち接種後18-24時間後にのみ、8時間のゾーン直径のブレークポイントを使用して遡及的に行われ、報告の平均時間は約2日でした。

臨床報告のTATをさらに削減するために、aMIASTを使用して+aBCに存在するGNの早期同定を可能にする代替方法論を提案します。質量分析ベースの微生物同定システムが導入される前は、これらの自動同定システムは微生物同定の標準治療と考えられており、カセットに保存された小型の生化学試験で接種し、その結果を分離データベースと照合すると、試験細菌によって誘発される比色および/または蛍光の変化によって同定が可能になりました。これらのシステムでの識別までの平均時間は約4時間から8時間ですが、メーカーがそれぞれのIDカードを接種する前に微生物を一晩で増殖させることを推奨しているという事実によって制限されています。この要件により、レポート作成までの時間を短縮する際の有用性が大幅に制限されます。

これらの自動化システムを使用して+aBCから微生物を直接同定する方法を評価した研究はほとんどありません21、22、23、24、25、26、27。単形GNを含む+aBCの場合、大多数の研究で、陽性の血液とブロスの混合物から作られた細菌ペレットからの直接接種と標準的なコロニーインキュベーションとの間に優れた一致が示されました。しかし、グラム陽性の場合、一致率は最適ではありませんでした。+aBCsの平均陽性時間は8時間から16時間の間であり、GNの同定は自動微生物同定システムで~4時間から8時間かかるため、我々は、自動微生物同定に直接接種プロトコルを採用することにより、サンプル受領から24時間以内にRR-GNを有するGNを有する+aBCsの臨床報告を完了できると仮定しています。

研究のための設定
本研究は、2023年1月から10月にかけて、インド中部にある950床の学術的な国家重要三次医療機関(INI)の臨床細菌学研究室で実施されました。研究所には、持続血液培養モニタリングシステム(CBCMS)とaMIASTが装備されています。細菌学研究所は24時間体制で機能しており、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)を処理し、報告するための技術者や微生物学者が利用できます。

ここで使用されている微生物の方法
この試験のワークフローを 図 1 に示します。単型GNs(+naBC)を示す+aBCは、対応するIDカードを直接接種して処理し、EUCAST RASTプロトコルを用いた同定とASTを可能にした。これらの結果は、+aBCsの標準治療(SoC)法、すなわち、羊の血液寒天培地(SBA)、チョコレート寒天培地(CA)、およびMacConkey寒天培地(MA)を介して従来のプレーテッド培地で継代培養し、16時間から24時間好気的にインキュベートした後、分離されたコロニーが現れたときにaMIASTによって識別およびASTカードを与える方法と比較されました。グラム陽性球菌、グラム陽性菌、出芽酵母細胞、および最初のグラム染色またはプレーティング培地で≥2種類の微生物を示す血液培養物は、研究から除外されました。

Protocol

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この研究は、AIIMSボパールがアユシュ・グプタ博士に与えた学内研究助成金によって資金提供され、機関人間倫理委員会(IHEC)の書簡番号:IHEC-LOP/2022/IL072によって承認されました。

注:Quesadaら25 およびMunoz-Davilaら27によって行われた研究に基づいて、5mlのサンプル容量を使用しました。

1. aMIASTを用いた細菌同定のための標準接種プロトコール(SIP)

  1. 清潔な手袋を着用し、クラスIIaバイオセーフティキャビネット(BSC)内で、70%イソプロピルアルコールを含む綿棒で+naBCの中隔を消毒します。
  2. 21Gの針が付いた滅菌シリンジを使用して、約1 mLの血液とブロスの混合物を引き出します。.
  3. 1 大滴の血液ブロス混合物を針から 1 滴、つまり SBA、CA、MA のめっき媒体の表面に分注します。プレートに線を引いて、インキュベーター内で培養プレートをインキュベーター内で37°C±2°C、好気性条件下で18〜24時間インキュベートします。
  4. インキュベーション後、BSCで単離されたコロニーがプレートに出現するかどうかを調べ、さらにaMIASTによる同定とASTに進みます。
  5. 各分離物について、aMIASTポリスチレンチューブをaMIASTチューブスタンドに置き、生理食塩水ボトルに取り付けられたディスペンサーを使用して3mLの滅菌生理食塩水を加えます。
  6. 形態学的に類似した3〜5個のコロニーを滅菌ストレート接種ワイヤーで触れ、細菌の接種物を最初のチューブに移します。
  7. 密度計を使用して、接種チューブ内の滅菌生理食塩水を使用して0.47〜0.63マクファーランドの濁度を調整します。
  8. グラム陰性aMIAST識別カードの毛細血管アタッチメントを最初のチューブに入れます。.
  9. 選択したカードをカセットの適切な位置に置きます。カセット内の接種物は準備ができており、充填セクションでaMIASTに到着します。
    注意:カードに接種する前の30分を超えてはなりません。
  10. カセットをフィラーチャンバー内の所定の位置にロードし、サンプルバーコードを内側に向けています。
  11. ドアを閉め、ユーザーインターフェイス画面で [塗りつぶし ]を押します。充填は70秒サイクルです。サイクルが完了すると、システムの青いインジケータライトが点滅します。カードをaMIASTシステムに入れると、機械によってカードの小さなチャンバー内に接種物が分配されます。
  12. カセットを充填チャンバーから取り外し、ドアを閉めて、ローディングチャンバーに入れます。バーコードは自動的にスキャンされ、仮想カセットの電子ワークリストの維持と照合されます。ストローは自動的に密封され、カードは自動的にカルーセルにロードされます。aMIASTの青い矢印の点滅は、ロードが完了したことを示します。
  13. 終了したらカセットの廃棄物を取り除きます。製品資料の廃棄物処理手順を参照するか、他の標準的な慣行に従ってください。チューブ内の残りの懸濁液をCLED寒天培地で継代培養し、分離株の純度を確認します。
  14. 装置が分析を完了した後、結果を読み取ります。

2. aMIASTを使用した細菌同定のための直接接種プロトコール(DIP)

  1. 滅菌手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で、70%イソプロピルアルコールを含む綿棒で+naBCの中隔を清掃します。
  2. 21 G針付きの滅菌シリンジを使用して、+ naBCの血液ブロス混合物から5 mLのアリコートを取り出し、ゴムセプタムを70%イソプロピルアルコールで消毒した後、血清セパレーターチューブ(SST)に移します(図2A)。
  3. このアリコートを160 x g で10分間遠心分離し、血液 - ブロス混合物中の血球を沈殿させます。最初の遠心分離後、血球が落ち着く上清を観察します。
  4. バイオセーフティキャビネット内のバイアルのキャップを開け、滅菌チップとピペットを使用して上清を慎重に取り除き、上部を取り外して新しいプレーン採血バイアル(赤い上)に移します。
  5. キャップをバイアルに置き、再度2000 x gで10分間遠心分離します。2回目の遠心分離後、底部に細菌ペレットが形成されます。
  6. 上清を吸引し、滅菌ピペットとチップを使用して廃棄します。細菌ペレットはチューブの底に残り、aMIAST IDカードの接種に使用されます。
    注:血清セパレーターチューブを160 x gでの最初の遠心分離で使用しました。これは、Quesadaら25およびMunoz-Davilaら27によって行われた研究に基づいており、最初の遠心分離ステップはそれぞれ約30 x gおよび60 x gで行われました。+aBCからの血液とブロスの混合物を最初にSSTで低速で遠心分離し、血液細胞をペレット化しました。
  7. aMIASTポリスチレンチューブをaMIASTチューブスタンドにセットし、生理食塩水ボトルに取り付けられたディスペンサーを使用して3mLの滅菌生理食塩水を加えます。
  8. 滅菌接種ループを使用して、バイアルの底から細菌ペレットを取り出し、aMIASTチューブに接種します
  9. 手順1.7〜1.14を繰り返します。

3. EUCAST RASTプロトコル4によるAST

  1. 接種されていない90mmの円形ミューラー・ヒントン寒天培地(MHA)プレートは、バイオセーフティキャビネットに保管してください。
  2. 滅菌手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で、70%イソプロピルアルコールを含む綿棒で+naBCの中隔を清掃します。
  3. 滅菌シリンジを使用して、+naBCから125μL±25μLの希釈されていない血液ブロス混合物を吸引し、中央の各MHAプレートに加えます。
  4. 滅菌綿棒を使用してスープをプレート上に3方向に優しく広げ≤各プレートに6つの抗菌ディスクを塗布します。
  5. 好気性インキュベーターでプレートを35°C±1°Cで8時間インキュベートします。インキュベーションの完了後、分離物の純度を観察します。
  6. 8時間±5分で阻害ゾーンを読み取ります。aMIASTで細菌同定結果を確認した後、RASTブレークポイントテーブルを使用して短時間のインキュベーションで結果を解釈します。
  7. AST結果を報告できるのは、分離株がRR-GNの1つとして同定され、MHAプレートとCLEDプレートが単一のモルフォタイプを増殖させている場合のみです。

4. 品質管理

  1. aMIASTのSIPプロトコルの内部品質管理は、推奨参照株を使用して製造元の指示に従って行います。
  2. 以下に説明するように、 大腸菌 の推奨参照株を使用して、RAST メソッドの内部品質管理を毎週実施します。
    1. 滅菌ガラス管4本をチューブスタンドに並べます。1 番目のチューブに 3 mL の滅菌生理食塩水を、2 番目、3 番目、4 番目のチューブのそれぞれに 990 μL の滅菌生理食塩水を分注します。
    2. めっき培地上の一晩培養の単離コロニーからのQC株の0.5マクファーランド懸濁液を作成します。
    3. 滅菌ピペットとチップを使用して、10 μLの懸濁液を最初のチューブから2番目のチューブに移します。
    4. 混合後、10μLの懸濁液を第2のチューブから第3のチューブに移し、続いて最後のチューブに移します。
    5. 最後のチューブから、針付きの滅菌シリンジを使用して接種材料1mLを取り出し、それを未接種aBCに加えます。
    6. 同時に、針付きの滅菌シリンジを使用してaBCに5 mLの滅菌羊の血液を加え、aBCの基部にある液体エマルジョンセンサーの色の変化により陽性を示すまでCBCMSでインキュベートします。
    7. 手順1〜3で説明した手順を繰り返して、それぞれSIP、DIP、およびRASTによる識別を行います。期待される結果は、QC株はaMIASTの同定プロトコルの両方によって正しく同定されるべきであり、RASTプレートのゾーン直径は指定された範囲内にあるべきである28である。

5. 統計分析

  1. SIPをゴールドスタンダードとして使用した微生物の同定を検討し、DIPで同じ同定が得られた場合は、一致していると考えてください。
  2. RR-GN、つまり、SIPを使用して識別された 大腸菌、 肺炎桿菌、 緑膿菌、 およびA.baumannii 複合体のいずれかがDIPで一致しない場合、これをメジャーエラー(ME)と見なし、その逆は誤った識別でレポートを発行する可能性があるため、非常にメジャーエラー(VME)と見なします。
  3. RR-GN の一致率は、SIP によって識別された RR-GN の合計数に対する一致した RR-GN の合計数に 100 を掛けた値として計算します。
  4. SIP で識別された RR-GN を持つ +naBC の総数に 100 を掛けた値に対する、非 RR-GN を持つと識別された +naBC の数の比率として ME レートを計算します。
  5. DIP に RR-GN があると誤って識別された +naBC の数と合計 no の比率として VME レートを計算します。DIPでテストされた+naBCの数に100を掛けた値。
  6. CBCMS による血液培養フラグの時点から、両方のプロトコルによる分離物の同定にかかった時間として、同定を分離するまでの時間 (TTI) を計算します。
  7. DIP と SIP の差を TTI の削減として計算します。これは、RR-GN を持つ一致する +naBC についてのみ計算します。CBCMS と aMIAST のクロックからそれぞれの時点に注意してください。
  8. スプレッドシートを使用してデータを管理し、分析します。連続変数にマンホイットニーU検定を使用し、≤0.05の両側 p値を統計的に有意であると見なします。

Results

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一般的なアウトカム
研究期間中、240 +naBCがDIPとSIPの両方を使用してaMIASTによる同定を受けました。これらのうち、15%(36/240)+naBCは、めっき培地上で一晩インキュベートした後、多微生物であることがわかりました。204の+naBCのうち、SIPによって識別されたRR-GNの割合は51.5%(105/204)であった。そのうち、47.6%(50/105)が 大腸菌、19%(20/105) がK.pneumoniae、8.6%(9/105) が緑膿菌 、24.8%(26/105) がA.baumannii 複合体でした。SIPによるすべての識別結果の詳細な説明を 表1に示します。

微生物同定における診断精度
105のRR-GNのうち、98(93.3%)と99(94.2%)がDIPと一致し、それぞれ種および属レベルの同定までDIPと一致しました。生物ごとの一致率は、表1に示すように、大腸菌で94%(47/50)、K.pneumoniaeで90%(18/20)、P.aeruginosaで100%(9/9)、A.baumannii複合体で92.3%(24/26)でした。7つの+naBCでは、表2に示すように、DIPを使用した種レベルの同定まで結果は一致しませんでした。そのうち、aMIASTは未同定(3)またはNon-RR-GNを同定(4)しました。これらの結果は臨床微生物学者に報告を強制するものではないため、重大なエラー(ME)と見なされました。私たちの研究のME率は、種レベルの識別まで6.7%(7/105)でした。aMIAST by SIPにおける非RR-GNの割合は48.5%(99/204)であった。そのうち、60(60.6%)は、種レベルの同定までDIPと一致していました。表2に示すように、99の非RR-GNのうち、4つの+naBCでDIPを使用してRR-GNが同定されました。このような不一致は、報告エラーにつながる可能性があり、非常に重大なエラー(VME)と見なされました。DIPを使用した全体的なVME率は1.7%(4/240)でした。すべてのグラム陰性菌の同定結果とエラーの完全な説明は、補足表1に示されています。

同定を分離する時間(TTI)の短縮
DIPの一致する+naBCのTTIは、SIPのTTIよりも有意に低かった(中央値(IQR):507.5分(685-404)対2171分(2532-1855)、P2対P1、 p<0.00001(Mann-Whitney検定))。両プロトコル間のTTIの差の中央値は1635分でした(IQR:1964-1299)。

figure-results-1
図1:研究のワークフロー: 単形グラム陰性菌を含む陽性フラグが立てられた血液培養ボトルの研究のワークフローを、標準および直接接種プロトコルの両方で処理しています。略語: +aBC = 陽性フラグ付き血液培養ボトル、+naBC = 陽性フラグ付き血液培養ボトル、単形グラム陰性、DIP = 直接接種プロトコル、SIP = 標準接種プロトコル、SBA = 羊血液寒天、CA = チョコレート寒天、MA = マッコンキー寒天、RR-GN = RAST 報告可能なグラム陰性、TAT = ターンアラウンドタイム この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:細菌の同一証明のための直接接種物のプロトコル: 直接接種物のプロトコルの遂行中のバイアルのイメージを示すこと。略語:+ naBC =グラム陰性菌で正のフラグが立てられた血液培養ボトルこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

RAST報告可能なグラム陰性テスト済みアイソレート(n)一致誤認身分証明書なし
n (%)n (%)n (%)
トータル10598 (93.3%)4 (3.8%)3 (2.8%)
大腸菌5047 (94%)12
クレブシエラ肺炎2018 (90%)11
アシネトバクター・バウマニー 複合体2624 (92.3%)2#0
緑膿菌99 (100%)00
# 属レベルでは正しく識別されたが、種レベルでは正しく識別されなかった 1 つの分離株 (A. haemolyticus として識別された Acinetobacter baumannii 複合体)

表1:直接接種プロトコルにおける細菌同定の結果。 結果は、RASTの報告可能なグラム陰性菌のみを対象としています。略語:n =分子、%=パーセント。

グラム陰性試験したアイソレートの合計重大なエラー非常に重大なエラー、n (%)
数誤認身分証明書なし(として識別)
n (%)nn
大腸菌503 (6%)1 (A. haemolyticus)20
クレブシエラ肺炎202 (10%)1匹(Ralstonia pickettii)10
アシネトバクター・バウマニー 複合体262 (7.7%)2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)-0
サルモネラ 属菌10NAの1 (10%)
(大腸菌)
Enterobacter cloacae 複合体8NAの1 (12.5%)
(大腸菌)
アシネトバクター lwoffi14NAの1 (7.1%)
(A.バウマニーコンプレックス)
スフィンゴモナス・パウシモビリス9NAの1 (11.1%)
(K.肺炎)
略語-n:分子、%:パーセント、ID:識別、NA:該当なし、
A: アシネトバクター、E: 大腸菌、K: クレブシエラ

表2:直接接種プロトコルによる主要なエラーと非常に主要なエラーの詳細。 略語:n =分子、%=パーセント、ID =識別、NA =該当なし、A = アシネトバクター、E = エシェリヒア、K = クレブシエラ。

補足表1: 両方のプロトコルでの生物同定の詳細な結果と、直接接種プロトコルのエラーの結果。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DIPを用いて、RR-GNをかなりの診断精度で同定することに成功しました。aBCの陽性フラグ付け後の平均TTIはわずか507分(~8.5時間)でした。したがって、AST測定のためのEUCAST RAST法と組み合わせて使用すると、8時間のAST読み取り時間で分離物の同定を行うことができます。このアプローチは、EUCAST RAST法を実装する可能性を秘めており、質量分析ベースの同定の必要性を排除します。これは、EUCAST RAST法を日常のワークフローに導入して、臨床報告の時間を短縮し、その導入に対する主要な障害を回避したいと考えている低リソース環境にとっての恩恵です。

EUCAST RAST法が導入される前に、複数の著者が、さまざまなaMIASTシステム21、22、23、24、25、26、27、29、30、31に対する+aBCからの直接テストの精度を評価してきました。これらの研究では、直接試験プロトコルは、シングル遠心分離ステップ29、30、31、32、または ダブル遠心ステップ21、22、24、25、26、27 のいずれかで異なっていましたバクテリアペレットを作るため。シングルステップ法では、+aBCからの血とブロスの混合物を血清セパレーターチューブ(SST)内で高速で遠心分離し、シリコーンゲル層の上の細菌をペレット化しました。ペレットは、身分証明書の接種のための接種材料を準備するために使用されました。二重遠心分離法では、+aBCからの血液とブロスの混合物を最初にSSTで低速で遠心分離し、血液細胞をペレット化します。このチューブから、細菌を含む上清を取り出して新しいチューブに移し、高速遠心分離を行いました。このチューブから上清を捨て、ペレットを使用して適切なIDカードを接種しました。これらの研究では、一致率は62%〜100%の範囲で変動しましたが、一般的に、精度はダブル遠心分離法の方が高かった。

この方法は簡単に実施でき、>10人の検査技師が交代で勤務する日常的な診断ラボで実施されていることがわかり、このメソッドの堅牢性が証明されました。RR-GNの1つを含む~94%(98/105)+naBCでは、DIPは微生物を正しく識別しました。また、各カテゴリーの生物の一致率は、大腸菌、肺炎菌、緑膿菌、バウマニー菌でそれぞれ94%、90%、100%、92.3%と同等であった。また、グラム陰性食品の全体的な一致率は、~77%(157/204)と最適ではないこともわかりました。しかし、これらの誤認のほとんどは、バウマニー複合体以外のアシネトバクター属、アエルジノーサ以外のシュードモナス属、モラクセラ属、スフィンゴモナス・パウシモビリスなど、皮膚の一般的な汚染物質とされる非発酵性のグラム陰性菌によるものでした。非発酵性グラム陰性物質との誤認は、他の著者によっても指摘されており21,23、これは、aMIAST識別カードにおけるこれらの細菌の反応性が低いためである可能性が高い。

DIPを使用すると、+naBC内の細菌のTTIが大幅に減少することがわかりました。DIPのTTIの中央値は、通常の臨床診断検査室で行った場合、SIPのTTIの中央値よりも約4倍少なかった(507分対2171分)。この ~8.5 時間の TTI には、aBC の陽性フラグと aMIAST カード接種の性能との間の間隔も含まれており、aMIAST による分離分析の平均時間は 1.6 時間±わずか 5.45 時間でした。私たちの研究では、一致する +naBC の平均陽性率が 728 分± 301 分 (~12 時間) であることを追加すると、この細菌同定のアプローチは、定期的な診断ラボで aBC を受け取った後、同日報告を提供できる可能性があります。

DIPには、いくつかの制限もあります。まず、接種製剤の適応外使用であるため、結果は予備的と見なす必要があり、EUCAST RASTによるAST結果も考慮する必要があります。それにもかかわらず、RR-GNのみをかなりの診断精度でタイムリーに特定するという主要な目的を果たします。第二に、約60%+naBCのように、テストリソースの浪費の実際的な可能性があります。多微生物感染または非RRGNの特定のために報告することができなかったでしょう。このリソースの浪費は、血液培養用の新しい自動化された直接AST法のいずれにも当てはまります。第三に、この研究では、サンプル収集方法が不十分なため、多微生物感染率と一般的な皮膚汚染物質の特定が高かった。第四に、細菌同定の現在のゴールドスタンダードである質量分析法では、試験した分離株の同一性を確認しませんでした。

この研究は、表現型検査を用いても、特にグラム陰性菌血症において、陽性の血液培養を同日報告することが可能であることを成功裏に立証しています。これにより、細菌同定やASTのための微生物学的診断が従来の表現型検査に大きく依存しているLMICsにおいて、適切な抗菌薬治療を開始する期間を大幅に短縮できる可能性があります。このアプローチは、多施設共同研究を実施して検証し、患者の転帰に与える潜在的な影響を検証するとともに、抗菌薬適正使用ツールとして、LMICsにおける将来の臨床試験の焦点となるべきである。

結論として、aMIASTのDIPはEUCAST RAST法を補完し、RR-GNの早期同定を可能にします。これにより、高度な微生物同定やAST技術に頼る必要がなくなり、これらのアプローチで報告する時間はこのアプローチに匹敵します。グラム陰性菌の場合、従来の表現型法で最大限に最適化されれば、同日報告が可能です。これにより、広域抗菌薬治療の期間を短縮し、資源が限られた環境での抗菌薬適正使用を促進する可能性があります。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、AIIMSボパールからアユシュ・グプタ博士に与えられた学内研究助成金によって資金提供されました。私たちは、日常的および緊急時に熱心にテストを実施し、読み取った検査技師と研修医の貢献を認めます。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<ストロング>抗菌ディスク
アミカシンディスク30&マイクロ;gHimedia、ムンバイ、インドSD035-1VL抗菌剤感受性試験 
アモキシクラブディスク(20/10 µg)Himedia、ムンバイ、インドSD063-1VL抗菌剤感受性試験 
セフォタキシムディスク5 & マイクロ;gHimedia、ムンバイ、インドSD295E-1VL抗菌剤感受性試験 
セフタジジムディスク10 & マイクロ;gHimedia、ムンバイ、インドSD062A-1VL抗菌剤感受性試験 
シプロフロキサシンディスク(5 µg)Himedia、ムンバイ、インドSD060-1VL抗菌剤感受性試験 
Co-トリモキサゾールディスク(23.75 / 1.25 & micro;g)Himedia、ムンバイ、インドSD010-1VL抗菌剤感受性試験 
ゲンタマイシンディスク10 µgHimedia、ムンバイ、インドSD016-1VL抗菌剤感受性試験 
イミペネムディスク10 µgHimedia、ムンバイ、インドSD073-1VL抗菌剤感受性試験 
レボフロキサシンディスク5µgHimedia、ムンバイ、インドSD216-1VL抗菌剤感受性試験 
メロペネムディスク10 & マイクロ;g Himedia、ムンバイ、インドSD727-1VL抗菌剤感受性試験 
ピペラシリン-タゾバクタムディスク(30/6µg)Himedia、ムンバイ、インドSD292E-1VL抗菌剤感受性試験 
トブラマイシンディスク10µgHimedia、ムンバイ、インドSD044-1VL抗菌剤感受性試験 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335Aの品質管理のための推奨グラム陰性細菌株
エトワール、フランス412CM8423連続自動血液培養システム
バイオセーフティキャビネット IIタイプ A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149危険物および感染性病原体に対する保護と品質管理の維持のため
血液寒天培地 No. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500G血液寒天とチョコレート寒天培
臨床遠心分離機SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021上澄み液分離のための低速および高速遠心分離
Dispensette S アナログ調整可能なボトルトップディスペンサー BrandTech、エセックス、コネチカット州、イングランドV1200食塩水の正確な量の分注
MacConkey寒天 Himedia、ムンバイ、インドM008-500G乳糖発酵槽/非発酵槽用差動培地グラム陰性桿菌
マイクロピペット(100-1000µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162最初の遠心分離後に上清を移送し、2回目の遠心分離後に上清を廃棄
マイクロピペットチップ (200-1000 µL)‎Ltd.、コルカタ、インド521020最初の遠心分離後の上清の移動、2回目の遠心分離後の上清の廃棄
ラーヒントン寒天 Himedia、ムンバイ、インドM173-500GKirby-Bauer法によるディスク拡散による抗菌剤感受性試験
ニクロムループD-4Himedia、ムンバイ、インドLA019培養培地へのストリーキング用
ニクロムストレートワイヤーHimedia、ムンバイ、インドLA022刺し傷用
Nulife 滅菌手袋MRK healthcare Pvt Limited、ムンバイ、インド安全のため予防措置
プレーンバイアル(赤いトップのバイアル)、Advance BDバキュテイナーBecton-Dickinson、コッキーズビル、メリーランド州、米国3678152回目の遠心分離後のペレットの取得
Sheep bloodLabline Trading Co.、ハイデラバード、インド70014血液寒天およびチョコレート寒天
SST IIチューブの調製、アドバンスBDバキュテイナーベクトン-ディキンソン、コッキーズビル、メリーランド367954最初の遠心分離における上清の分離
滅菌綿棒(木の棒付き)Himedia、ムンバイ、インドPW005-1X500NO抗菌剤感受性試験のための血液培養ブロスの芝生培養
滅菌単回使用皮下注射器 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2+aBC
VITEK DensiCHEK McFarlandリファレンスキットからのアリコートの準備bioMerieux、マーシーd'Etoille, France422219の濁度をチェックする濃度計
bioMerieux, Marcy d'フランス・エトワーユV1204マクファーランド標準濁度
VITEKチューブスタンドの調整 bioMerieux、マーシーd'エトワール、フランス533306-4 REVIDカード接種前のチューブの適切な配置のためのスタンド
VITEKチューブbioMerieux、Marcy d 'エトワール、フランス接種材料調製用チューブ
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d'エトワール、フランスVKC15144自動識別およびASTシステム
VITEK-2 GNカードbioMerieux、Marcy d'Etoille, France21341グラム陰性桿菌の同定
RAST BacT-Alert 3D 480 bioMerieux, Marcy d' 地の調製 生理ミュー州、米国 懸濁液VITEK生理食塩水(0.45%NaCl)

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