EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。
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EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。
グラム陰性(GN)敗血症は、リソースが限られている環境での管理が従来の微生物学的培養技術に依存している医療緊急事態であり、3〜4日で結果が得られます。このターンアラウンドタイム(TAT)の遅延を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた自動血液培養ボトル(+aBC)から直接AST結果を決定するためのプロトコルを開発しました。EUCAST rapid AST (RAST) プロトコルは 2018 年に初めて導入され、GN 敗血症の 4 つの一般的な病因、すなわち大 腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、および アシネトバクター バウマニー 複合体のゾーン直径ブレークポイントを報告できます。しかし、この方法を日常的なワークフローに導入している臨床検査室は、質量分析法に基づく微生物同定に依存しており、これは容易に入手できないため、リソースが限られている環境でのこの分析法の導入は困難です。これを回避するために、市販の自動微生物同定および抗菌剤感受性試験システム(aMIAST)を使用して直接接種プロトコル(DIP)を評価し、aBCの陽性フラグから8時間以内の早期微生物同定を可能にしました。2023年1月から10月にかけてこのプロトコルを評価し、陽性フラグが立てられたaBCの4つのRAST報告可能GN(RR-GN)を特定しました。DIPにおける微生物同定結果を、aMIASTの標準的な接種物調製プロトコル(SIP)と比較した。単型GN(+naBC)を持つ204の+aBCのうち、4つのRR-GNのうちの1つがSIPによって105の+naBCで同定されました(大腸菌: 50、 K.pneumoniae: 20、 P.aeruginosa: 9 、A.baumannii 複合体:26)。これらのうち、94%(98/105)がDIPによって正しく識別されましたが、メジャーエラー率と非常にメジャーエラー率はそれぞれ6%(7/105)と1.7%(4/240)でした。EUCAST RAST法を使用して微生物同定のためのDIPを行うと、サンプルを受け取ってから24時間以内に暫定的な臨床レポートを提供できます。このアプローチは、TATを大幅に減少させる可能性を秘めており、適切な抗菌療法を早期に開始することを可能にします。
敗血症は、重要な世界的な健康問題であり、感染に対する宿主の反応の調節不全による生命を脅かす臓器機能障害と定義されています。「Global Burden of Diseases Study」によると、2017年の世界の敗血症症例数は4,890万人、敗血症関連死者数は1,100万人で、これは全世界の死亡者数の約20%を占めています1。死亡を引き起こす血流感染症(BSI)の約2/ 3は、グラム陰性細菌性病原体によるものです2。グラム陰性菌(GN)の死亡原因としては、 大腸菌、 肺炎桿菌、 緑膿菌、ア シネトバクター・バウマニーが主な原因で、33種類の細菌性病原体のうち約40%を占めています2。
血液培養は依然としてBSIの診断のゴールドスタンダードであり、抗菌薬感受性試験(AST)の結果とともに微生物を迅速に同定することが管理の鍵となります。敗血症3では、適切な抗菌薬の投与が1時間遅れるごとに、死亡率が9%増加すると推定されています。AST結果を含む微生物学的に陽性の血液培養報告のターンアラウンドタイム(TAT)は、自動化されたシステムであっても、リソースが限られている環境で利用可能な微生物学的ツールを使用すると、約48〜72時間です。この標準以下のTATの結果として、広域スペクトルの抗菌薬が経験的に使用され、抗菌薬耐性(AMR)の問題が急増しています。敗血症の微生物学的培養技術のためのTATを削減するこの切実な必要性を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)4,5から直接ASTを実行する方向に進んでいます。
2018年、EUCASTは、Kirby-Bauerディスク拡散法によるASTを短いインキュベーション時間、つまり4時間、6時間、8時間で+aBC 6,7から直接測定するための迅速AST(RAST)法を初めて導入しました。この方法は、BSIの8つの最も一般的な原因の1つであるグラム陰性菌のうち、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、A.バウマニー複合体、およびグラム陽性菌8のうち黄色ブドウ球菌、Enterococcus faecalis、E. faecium、 およびStreptococcus pneumoniaeを含む+aBCのASTを決定するために現在検証されています.さまざまな時間間隔でのAST測定のブレークポイントは、上記の微生物種ごとに提供されています。したがって、AST結果をカテゴリー別に解釈する前に、微生物の同定が必要です。ただし、RAST規格では、この時間枠内で微生物の同定を可能にする方法は指定されていません。
EUCAST RAST法を評価した研究の大部分は、微生物を同定するために、めっき培地上での短いインキュベーション後に質量分析に基づく微生物同定を使用していました9、10、11、12、13、14、15、16、17.しかし、質量分析装置は、特に低中所得国(LMIC)では広く利用できないため、この分析法の潜在的な有用性は大きく制限されています。質量分析を使用せずに、この方法をセンターで実施したことを報告した研究はほとんどありません18,19,20。Tayşi et al.18 は、AST 結果を解釈する前に、グラム染色形態とオキシダーゼ試験に基づいて、Enterobacterales、Pseudomonas、および Acinetobacter spp. の間で GN を広く分類したことを報告しました。このセンターの他の研究では、Guptaら19およびSiddiquiら20による、種レベルの微生物同定は、陽性フラグが立てられた血液ブロス混合物から細菌ペレットを調製し、従来の生化学的試験でそれを接種することによって行われました。Tayşi et al.18 は、彼らのアプローチによる微生物同定の正確さについてコメントしていませんが、Gupta et al.19 は、165/176 (94%) のケースでのアプローチにより、RAST 報告可能なグラム陰性 (RR-GN)、つまり、大腸菌、K. pneumoniae、P. aeruginosa、および A. baumannii のいずれかであると報告しましたコンプレックス。しかし、後者のアプローチでは、RAST結果の読み取りは、従来の生化学的結果の完全なインキュベーション後、すなわち接種後18-24時間後にのみ、8時間のゾーン直径のブレークポイントを使用して遡及的に行われ、報告の平均時間は約2日でした。
臨床報告のTATをさらに削減するために、aMIASTを使用して+aBCに存在するGNの早期同定を可能にする代替方法論を提案します。質量分析ベースの微生物同定システムが導入される前は、これらの自動同定システムは微生物同定の標準治療と考えられており、カセットに保存された小型の生化学試験で接種し、その結果を分離データベースと照合すると、試験細菌によって誘発される比色および/または蛍光の変化によって同定が可能になりました。これらのシステムでの識別までの平均時間は約4時間から8時間ですが、メーカーがそれぞれのIDカードを接種する前に微生物を一晩で増殖させることを推奨しているという事実によって制限されています。この要件により、レポート作成までの時間を短縮する際の有用性が大幅に制限されます。
これらの自動化システムを使用して+aBCから微生物を直接同定する方法を評価した研究はほとんどありません21、22、23、24、25、26、27。単形GNを含む+aBCの場合、大多数の研究で、陽性の血液とブロスの混合物から作られた細菌ペレットからの直接接種と標準的なコロニーインキュベーションとの間に優れた一致が示されました。しかし、グラム陽性の場合、一致率は最適ではありませんでした。+aBCsの平均陽性時間は8時間から16時間の間であり、GNの同定は自動微生物同定システムで~4時間から8時間かかるため、我々は、自動微生物同定に直接接種プロトコルを採用することにより、サンプル受領から24時間以内にRR-GNを有するGNを有する+aBCsの臨床報告を完了できると仮定しています。
研究のための設定
本研究は、2023年1月から10月にかけて、インド中部にある950床の学術的な国家重要三次医療機関(INI)の臨床細菌学研究室で実施されました。研究所には、持続血液培養モニタリングシステム(CBCMS)とaMIASTが装備されています。細菌学研究所は24時間体制で機能しており、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)を処理し、報告するための技術者や微生物学者が利用できます。
ここで使用されている微生物の方法
この試験のワークフローを 図 1 に示します。単型GNs(+naBC)を示す+aBCは、対応するIDカードを直接接種して処理し、EUCAST RASTプロトコルを用いた同定とASTを可能にした。これらの結果は、+aBCsの標準治療(SoC)法、すなわち、羊の血液寒天培地(SBA)、チョコレート寒天培地(CA)、およびMacConkey寒天培地(MA)を介して従来のプレーテッド培地で継代培養し、16時間から24時間好気的にインキュベートした後、分離されたコロニーが現れたときにaMIASTによって識別およびASTカードを与える方法と比較されました。グラム陽性球菌、グラム陽性菌、出芽酵母細胞、および最初のグラム染色またはプレーティング培地で≥2種類の微生物を示す血液培養物は、研究から除外されました。
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この研究は、AIIMSボパールがアユシュ・グプタ博士に与えた学内研究助成金によって資金提供され、機関人間倫理委員会(IHEC)の書簡番号:IHEC-LOP/2022/IL072によって承認されました。
注:Quesadaら25 およびMunoz-Davilaら27によって行われた研究に基づいて、5mlのサンプル容量を使用しました。
1. aMIASTを用いた細菌同定のための標準接種プロトコール(SIP)
2. aMIASTを使用した細菌同定のための直接接種プロトコール(DIP)
3. EUCAST RASTプロトコル4によるAST
4. 品質管理
5. 統計分析
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一般的なアウトカム
研究期間中、240 +naBCがDIPとSIPの両方を使用してaMIASTによる同定を受けました。これらのうち、15%(36/240)+naBCは、めっき培地上で一晩インキュベートした後、多微生物であることがわかりました。204の+naBCのうち、SIPによって識別されたRR-GNの割合は51.5%(105/204)であった。そのうち、47.6%(50/105)が 大腸菌、19%(20/105) がK.pneumoniae、8.6%(9/105) が緑膿菌 、24.8%(26/105) がA.baumannii 複合体でした。SIPによるすべての識別結果の詳細な説明を 表1に示します。
微生物同定における診断精度
105のRR-GNのうち、98(93.3%)と99(94.2%)がDIPと一致し、それぞれ種および属レベルの同定までDIPと一致しました。生物ごとの一致率は、
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DIPを用いて、RR-GNをかなりの診断精度で同定することに成功しました。aBCの陽性フラグ付け後の平均TTIはわずか507分(~8.5時間)でした。したがって、AST測定のためのEUCAST RAST法と組み合わせて使用すると、8時間のAST読み取り時間で分離物の同定を行うことができます。このアプローチは、EUCAST RAST法を実装する可能性を秘めており、質量分析ベースの同定の必要性を排除します。これは、EUCAST RAST法を日常のワークフローに導入して、臨床報告の時間を短縮し、その導入に対する主要な障害を回避したいと考えている低リソース環境にとっての恩恵です。
EUCAST RAST法が導入される前に、複数の著者が、さまざまなaMIASTシステム21、22、23、24、
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著者は何も開示していません。
この研究は、AIIMSボパールからアユシュ・グプタ博士に与えられた学内研究助成金によって資金提供されました。私たちは、日常的および緊急時に熱心にテストを実施し、読み取った検査技師と研修医の貢献を認めます。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>抗菌ディスク | |||
| アミカシンディスク30&マイクロ;g | Himedia、ムンバイ、インド | SD035-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| アモキシクラブディスク(20/10 µg) | Himedia、ムンバイ、インド | SD063-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| セフォタキシムディスク5 & マイクロ;g | Himedia、ムンバイ、インド | SD295E-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| セフタジジムディスク10 & マイクロ;g | Himedia、ムンバイ、インド | SD062A-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| シプロフロキサシンディスク(5 µg) | Himedia、ムンバイ、インド | SD060-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| Co-トリモキサゾールディスク(23.75 / 1.25 & micro;g) | Himedia、ムンバイ、インド | SD010-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| ゲンタマイシンディスク10 µg | Himedia、ムンバイ、インド | SD016-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| イミペネムディスク10 µg | Himedia、ムンバイ、インド | SD073-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| レボフロキサシンディスク5µg | Himedia、ムンバイ、インド | SD216-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| メロペネムディスク10 & マイクロ;g | Himedia、ムンバイ、インド | SD727-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| ピペラシリン-タゾバクタムディスク(30/6µg) | Himedia、ムンバイ、インド | SD292E-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| トブラマイシンディスク10µg | Himedia、ムンバイ、インド | SD044-1VL | 抗菌剤感受性試験 |
| ATCC Escherichia coli 25922 | Microbiologics, Minnesota USA | 0335A | の品質管理のための推奨グラム陰性細菌株 |
| エトワール、フランス | 412CM8423 | 連続自動血液培養システム | |
| バイオセーフティキャビネット IIタイプ A2 | Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India | DFP-2/21-22/149 | 危険物および感染性病原体に対する保護と品質管理の維持のため |
| 血液寒天培地 No. 2 | Himedia, Mumbai, India | M834-500G | 血液寒天とチョコレート寒天培 |
| 臨床遠心分離機SP-8BL | Laby Instruments, Ambala, India | HLL/2021-22/021 | 上澄み液分離のための低速および高速遠心分離 |
| Dispensette S アナログ調整可能なボトルトップディスペンサー | BrandTech、エセックス、コネチカット州、イングランド | V1200 | 食塩水の正確な量の分注 |
| MacConkey寒天 | Himedia、ムンバイ、インド | M008-500G | 乳糖発酵槽/非発酵槽用差動培地グラム陰性桿菌 |
| マイクロピペット(100-1000µL) | Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India | NJ478162 | 最初の遠心分離後に上清を移送し、2回目の遠心分離後に上清を廃棄 |
| マイクロピペットチップ (200-1000 µL) | Ltd.、コルカタ、インド | 521020 | 最初の遠心分離後の上清の移動、2回目の遠心分離後の上清の廃棄 |
| ラーヒントン寒天 | Himedia、ムンバイ、インド | M173-500G | Kirby-Bauer法によるディスク拡散による抗菌剤感受性試験 |
| ニクロムループD-4 | Himedia、ムンバイ、インド | LA019 | 培養培地へのストリーキング用 |
| ニクロムストレートワイヤー | Himedia、ムンバイ、インド | LA022 | 刺し傷用 |
| Nulife 滅菌手袋 | MRK healthcare Pvt Limited、ムンバイ、インド | 安全のため予防措置 | |
| プレーンバイアル(赤いトップのバイアル)、Advance BDバキュテイ | ナーBecton-Dickinson、コッキーズビル、メリーランド州、米国 | 367815 | 2回目の遠心分離後のペレットの取得 |
| Sheep blood | Labline Trading Co.、ハイデラバード、インド | 70014 | 血液寒天およびチョコレート寒天 |
| SST IIチューブの調製、アドバンスBDバキュテイナー | ベクトン-ディキンソン、コッキーズビル、メリーランド | 367954 | 最初の遠心分離における上清の分離 |
| 滅菌綿棒(木の棒付き) | Himedia、ムンバイ、インド | PW005-1X500NO | 抗菌剤感受性試験のための血液培養ブロスの芝生培養 |
| 滅菌単回使用皮下注射器 5ml/cc | Nihal Healthcare, Solan, India | 2213805NB2 | +aBC |
| VITEK DensiCHEK McFarlandリファレンスキット | からのアリコートの準備bioMerieux、マーシーd'Etoille, France | 422219 | の濁度をチェックする濃度計 |
| bioMerieux, Marcy d'フランス・エトワーユ | V1204 | マクファーランド標準濁度 | |
| VITEKチューブスタンドの調整 | bioMerieux、マーシーd'エトワール、フランス | 533306-4 REV | IDカード接種前のチューブの適切な配置のためのスタンド |
| VITEKチューブ | bioMerieux、Marcy d 'エトワール、フランス | 接種材料調製用チューブ | |
| VITEK-2 Compact 60 | bioMerieux, Marcy d'エトワール、フランス | VKC15144 | 自動識別およびASTシステム |
| VITEK-2 GNカード | bioMerieux、Marcy d'Etoille, France | 21341 | グラム陰性桿菌の同定 |
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