方法論記事

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

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DOI：

10.3791/66589

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2024年5月24日

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1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、網膜光受容体末の構造的特徴に焦点を当てて、体積電子顕微鏡用の網膜サンプルを調製するための詳細な手順について説明します。

要約

体積電子顕微鏡(Volume EM)は、細胞や組織の3D構造をナノメートルレベルの精度で視覚化するための強力なツールとして登場しました。網膜内では、さまざまな種類のニューロンが内叢状層と外叢状層にシナプス接続を確立しています。従来のEM技術は、網膜細胞内小器官に関する貴重な洞察をもたらしてきましたが、その限界は2D画像データの提供にあり、正確な測定を妨げる可能性があります。例えば、シナプス伝達に不可欠な3つの異なるシナプス小胞プールのサイズを定量化することは、2Dでは困難です。Volume EMは、大規模で高解像度の3Dデータを提供することでソリューションを提供します。サンプル調製はボリュームEMの重要なステップであり、画像の鮮明度とコントラストに大きな影響を与えることは注目に値します。これに関連して、網膜の視細胞軸索終末の3D再構築のためのサンプル調製プロトコルを概説します。このプロトコルには、網膜の解剖と固定、サンプルの埋め込みプロセス、および関心領域の選択という3つの主要なステップが含まれています。

概要

網膜には、ニューロンの軸索と樹状突起が絡み合って密集しており、それらの間にシナプスを形成しています1。顕微鏡検査は、微細で複雑で小さな構造を持つ網膜の解剖学を研究するために不可欠なツールです。電子顕微鏡(EM)は、細胞内小器官の超微細構造や特定のタンパク質の正確な局在をナノメートルレベル2で調査するための比類のない能力を提供しますが、2次元(2D)平面に限定された画像を生成するため、重要な情報が失われる可能性があります。

新しい高解像度体積電子顕微鏡(ボリュームEM)技術の開発は、より包括的で大規模な3次元(3D)構造情報の提供をサポートします。一部の3D EM手法は、最近、他の手法によってレビューされました3,4,5。3D EMは、ニューロンの形状と接続性の詳細の再構築を可能にし、関心のある構造の正確な定量分析を可能にします。これは、ボリュームEMによって取得されたデータが、より体系的で、完全で、正確であることを示しています。

視覚シグナル伝達6,7の初期ニューロンを構成する網膜光受容体は、光受容体の末端に二次双極細胞および水平細胞の樹状突起とシナプスを確立し、興奮性シグナル8,9を促進する。これらの末端は、円錐茎および桿体スフェルールと呼ばれ、ミトコンドリア、シナプスリボン、シナプス小胞の3つの重要なコンポーネントを包含しています。これまでの研究は主にリボンシナプスの一般的な構造に集中していましたが、ミトコンドリア、リボン、小胞プールなどの主要成分の微細構造、およびターミナル10,11,12,13の空間構成に関する調査は著しく欠如していました.各成分を精密かつ系統的に解析し、視細胞末端におけるそれらの相互関連を理解することは、空間構成を解き明かし、視覚処理機能を包括的に把握するために不可欠です。視細胞では、ミトコンドリアは主に内部セグメント、細胞体、および末端に存在します。ここでは、光受容体末端のミトコンドリアに着目しました。集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)は、高分解能(x、y、z分解能<5nm)と比較的大きな体積磁束4,14を誇る体積EMの一種であり、感光器端末の3D構造を正確に視覚化するための強力なツールとして位置付けられています。

FIB-SEMとシリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡(SBF-SEM)は、サンプルの表面をスキャンして組織の画像を取得するためのSEMに基づくボリュームEMです。試料表面の超微細構造的特徴は、電子ビームが試料15をスキャンするときの二次電子または後方散乱電子(BSE)の強度によって生じるコントラストによって明らかにされる。基本的に、SEMで樹脂包埋組織サンプルの断面表面からBSEまたは二次電子を検出することで、包埋サンプル16,17の画像を取得することができる。BSEや二次電子の生成が少ない場合、試料表面の情報しか得られません。一貫したコントラストと高品質の連続画像を実現するには、サンプル中に重金属を十分に堆積させる必要があります。したがって、特定のサンプル調製プロトコルは、その後のセグメンテーション、3D再構成、およびSEMをシリアルイメージングに利用する際の分析に不可欠です。オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法は、生体試料の3D電子顕微鏡法の典型的な試料調製スキームであり、脂質含有膜の構造を維持し、良好なコントラストを維持する18,19。

ここでは、ボリュームEMを使用するためのレチナールサンプルの調製のためのOTO法を開発しました。このプロセスは、特に網膜の解剖、網膜組織の最適な固定時間の決定、3Dサンプル調製における特定の手順と注意事項の詳細に焦点を当てています。さらに、ターゲット構造のセグメンテーションと3D再構成は、この拡張アプリケーションに不可欠なステップです。網膜は小さくて材料を得るのが難しい構造であるため、EMには迅速かつ正確な操作が必要であり、決まった時間とすぐに使用できる新鮮な試薬が準備されています。

プロトコル

動物の世話と使用のプロトコルは、温州医科大学の倫理委員会によって承認され、視覚眼科研究協会(ARVO)によって確立されたガイドラインに従っていました。すべてのマウスを12時間のライトサイクルと12時間のダークサイクルで維持し、標準的なチャウ食餌を与えました。

1. 網膜の解剖と固定

  1. マウス(C57BL / 6J、雄、8週齢、20-25 g)に2,2,2-トリブロモエタノール(0.25 mg / g体重)を腹腔内に注入して麻酔します。.つま先をつまんだ後足を引っ込めない、またはまばたき反射をしないことで、麻酔の深さを確認します。次に、麻酔下で頸椎を脱臼して動物を安楽死させます。
    注:トリブロモエタノールは、小動物モデル、特に短期間の処置において、迅速で信頼性の高い麻酔を誘発する有効性が十分に文書化されているために選択されました。医薬品グレードの麻酔薬が好まれますが、トリブロモエタノールは特定のプロトコルで特定の利点を提供するため、適切に準備および投与された場合、適切な代替手段となります。その安全で効果的な使用を確保するために、すべての予防措置が講じられました。この研究は、その使用に関連する潜在的なリスクを軽減するために、適切な準備、管理、および監視を確保することにより、倫理的考慮事項を遵守しています。
  2. 湾曲したハサミで目を取り除き、2%グルタルアルデヒドと2%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液(PB、0.1M、pH 7.4)に目を浸します。
  3. 解剖顕微鏡下の鉗子で前眼部と硝子体を眼から取り除きます。
  4. 網膜がアイカップから完全に分離されるまで、2つの鉗子で強膜をはがします。
  5. 網膜をカミソリで厚さ100〜200μmのストリップにすばやく切断し、パスツールピペットで網膜ストリップを2%グルタルアルデヒドと2%パラホルムアルデヒドを含む新しい微量遠心分離機(EP)チューブに処理します リン酸塩緩衝液(PB、0.1 M、pH 7.4)で、ローテーターの室温(RT)で2時間。完了後、チューブを4°Cで24時間固定します。

2. サンプルの埋め込みプロセス

  1. 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)でそれぞれ5回、15分間洗浄した後、網膜ストリップを1.5%フェロシアン化カリウムおよび1%OsO4(PB、pH7.4)含有溶液、0.1 Mカコジル酸ナトリウム、4 mM CaCl 2、4 mM CaCl2 含有溶液と氷上で1.5時間インキュベートします。
    注:インキュベーションが暗く、リン酸が不足していると、サンプル中の沈殿物やアーティファクトを防ぐことができます。
  2. 網膜ストリップをddH2Oでそれぞれ10分間3回洗浄し、次いで1%チオカルボヒドラジドをddH2O中でRTの暗闇で30分間処理する。
  3. ddH2Oでそれぞれ15分間3回すすいだ後、網膜ストリップを2% OsO4(PB、PH 7.4)でRTの暗闇で45分間インキュベートします。
  4. ddH2Oでそれぞれ15分間3回洗浄した後、網膜ストリップを1%酢酸ウラニル水溶液に4°Cの暗所で一晩浸します。
  5. 翌日、ddH2Oでそれぞれ15分間3回洗浄した後、網膜ストリップをL-アスパラギン酸(0.03 M、pH 5.5)中の0.66%硝酸鉛で65°Cで40分間処理します。
  6. ddH2Oで各15分間3回洗浄した後、網膜ストリップを上昇エタノール濃度30%、50%、70%、90%、および100%で各溶液中で20分間脱水します。
  7. 網膜ストリップを等量のエタノールとアセトンを含む混合溶液で20分間処理し、続いてアセトンを2回ずつ20分間洗浄します。
  8. RTで一晩中、暗闇で7:3の比率で混合されたアセトン/樹脂で網膜ストリップに浸潤し、次にRTで24時間暗闇でアセトン/樹脂を3:7で浸潤します。
    注:樹脂の正確な組成は次のとおりです:Epon812 10.06 mL、DDSA 4 mL、MNA 5.94 mL、およびDMP-30 0.2 mL。
  9. 翌日チューブを交換し、網膜ストリップに純粋な樹脂を45°Cで24時間浸潤します。 翌日に再度樹脂を交換し、網膜ストリップを60°Cで48時間埋め込みます。
    注:温度を上げる目的は、浸透性を向上させることです。

3. 関心領域の選択

  1. レジンブロックを厚さ1 μmの切片に切断し、切片を1%トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で網膜の一般的な構造を観察して、粗い関心領域を選択します。
  2. スパッタコーターで樹脂ブロックを白金でコーティングし、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡で0.23nAの電流と加速電圧30kVで厚さ70nmの切片をミリングします。
  3. FIB-SEMを2000倍の倍率で切片を事前にスクリーニングし、正確な関心領域を特定します。
  4. FIB-SEMを用いて、ビーム電流0.69nA、加速電圧2kVでデータを収集します。その他のパラメータは次のとおりです:滞留時間= 2μs、ボクセルサイズ= 1.8 nm x 1.8 nm x 15 nm。

結果

図1A は、従来の化学的二重固定法を用いて調製した網膜視細胞終末の像を示し、 図1B は、OTO法を用いて調製した網膜光受容体終末の像を示す。どちらもFIB-SEMでサンプリングしました。OTO法を用いることで細胞膜構造を極力保持でき、小胞の輪郭まで鮮明に見えることがよくわかります。また、OTO法を用いて得られる画像のコントラストもより鮮明になります。

図2 は、視細胞末端の超微細構造特性を再構築するために採用された実験ワークフローを示しています。再構成は、M錐体椎弓根、S錐体椎弓根、rod1球体、rod2球体を含む4種類の視細胞末端に焦点を当てました。主に重点が置かれたのは、ミトコンドリア、シナプスリボン、視細胞末端内のシナプス小胞プールなどの必須成分でした。

図3 は、桿体視細胞末端の再構築されたミトコンドリアとシナプスリボンを示しています。特に、rod2 spherulesのシナプスリボンは独特の馬蹄形を示し、通常は1つのspheruleにつき1つのリボンを特徴としています。さらに、 図2 は、桿体スフェルールに2つのミトコンドリアが存在することを強調しており、シナプスリボンの上にある末端の中央空間内に一貫した位置があります。すべての構造は、ページごとに手動でトレースされました。

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図1:FIB-SEMを用いて従来の化学二重固定法とOTO法でサンプリングした画像例 (A)従来の化学二重固定法。(B)OTO法。スケールバー:1000nm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:FIB-SEMを用いた感光器端末の3D再構成ワークフロー。 3Dデータ視覚化ソフトウェアを使用して位置合わせを行った後、シリアル画像を手動でセグメント化し、さらなる分析のためにレンダリングしました。(A)オリジナルのシリアル画像。(B)整列された画像。(C)セグメント化された画像。(D)再構築された画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:3D再構成。 代表的な3次元再構成画像は、視細胞末端を白、ミトコンドリアをオレンジ色、シナプスリボンを青色で描いています。スケールバー:500nm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

私たちは、網膜組織における光受容体の末端構造を分析するために、OTOのボリュームEMサンプル調製プロトコルを実装しました。焦点は、網膜の剥離と固定から始まり、視細胞軸索終末の3D再構成の結果を示すことまで、手順全体を詳細に説明することでした。

網膜組織の特徴は、脳組織とは異なり、地域差がないことです。網膜は、3層のニューロン細胞体と2層のシナプス結合から構成され、そのニューロンとシナプスの構成成分が複雑であるにもかかわらず、規則的で階層的な構造を示す20。網膜を解剖する際には、その後のサンプル調製段階で均一なコントラストを確保するために、細いストリップを最小限に抑えることが不可欠になります。視細胞軸索終末は、重要な重要な構造であり、網膜の外側の網状層(OPL)に位置しています。網膜の階層的で組織化された性質により、ターゲット構造の効率的なローカリゼーションが可能になり、EM中の正確なサンプリングが容易になり、その後の3D再構成結果の精度が確保されます。

ボリュームEMは、シリアルセクション21,22を利用して、ナノスケールで網膜内の局所神経回路とシナプス接続の3次元視覚化を容易にします。この技術により、高解像度の3D画像の自動生成が可能になり、FIB-SEMは生理学的および病理学的活動の複雑な詳細を明らかにする可能性を秘めています。したがって、サンプル調製プロセスでは、ブロック全体で安定した画像コントラストを維持することが重要です。均一な導電率を達成するために、走査型電子顕微鏡(SEM)18,23,24におけるコントラストの向上に効果的であることが広く認められている古典的なアプローチであるプレエンベッドOTO法を採用しています。この方法では、ダブルオスミウムコーティングとチオカルボヒドラジドを組み合わせ、大きなサンプルに最適なバルク導電率を確保します。さらに、ダブルオスミウム処理は、脂質膜構造の優れた保存に貢献し、私たちの研究に精度の層を追加します。網膜サンプルは階層的であり、組織ブロックは小さくて浸透しやすく、OTO法はより良い細胞膜の輪郭と均一な画像コントラストを維持できます。

このプロトコルの成功には、いくつかの重要な要素が貢献しています。まず、最適な細胞内構造を維持するためには、迅速な網膜採取と正確な固定時間が最も重要です。次に、オスミウムとチオカルボヒドラジドの適切な濃度を確保することは、シリーズ画像の膜構造のコントラストを維持するために不可欠です。特にオスミウムは、脂質分子と結合し、BSEシグナルを増強することで重要な役割を果たしています。

当社の網膜サンプル調製プロトコルはユーザーフレンドリーで、追加の機器を必要とせず、処理時間を最小限に抑えます。この特性は、他のボリュームEM技術への適用可能性を浮き彫りにしており、多様な実験セットアップでの汎用性と採用の容易さを示唆しています。OTOの方法は、FIB-SEM画像のコントラストを著しく向上させます。ただし、細胞膜の詳細、特に二重層構造は、まだややぼやけて見える場合があります。現在のサンプル調製スキームでは、細胞構造の細部をある程度犠牲にしています。将来的には、この制限に対処し改善するために、最適化された方法を開発することを目指しています。

開示事項

著者は開示していません。

謝辞

本研究の一部は、National Key Research and Development Program of China(2022YFA1105503)、State Key Laboratory of Neuroscience(SKLN-202103)、Zhejiang Natural Science Foundation of China(Y21H120019)の助成を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,2,2-トリブロモエタノールSigma-AldrichT48402
アセトン電子顕微鏡 Science10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
埋め込み金型Beijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon樹脂電子顕微鏡 科学14900
エタノールシグマ64-17-5
グルタルアルデヒド電子顕微鏡 科学16020
Helios NanoLab 600i デュアルビーム SEMFEI
L-アスパラギン酸シグマ56-84-8
硝酸鉛シグマ10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650リン酸緩衝液NaH
2PO4の成分。H2OΣ71507リン酸緩衝液の成分
OsO4TED PELLA4008-160501
パラホルムアルデヒド電子顕微鏡 科学157-8
フェロシアン化カリウムΣ14459-95-1
カコジル酸ナトリウムΣ6131-99-3
スパッタコーターライカACE200
チオカルボヒドラジドΣ2231-57-4
酢酸ウラニルTED PELLACA96049

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