Lung-on-Chipモデルは、空気と液体の界面と内皮細胞の灌流を模倣することで、従来の2D培養を凌駕し、肺生理学研究に不可欠な血流と栄養交換をシミュレートします。これにより、肺研究の関連性が高まり、呼吸器感染症の理解と治療を進めるためのダイナミックで生理学的に正確な環境が提供されます。
この記事について
サマリー
要約
私たちは、ヒト肺胞の構造と機能を再現するように設計された高度な免疫適格肺オンチップモデルを紹介します。この革新的なモデルは、ヒト肺胞の環境を模倣した気液界面をサポートするマイクロ流体灌流バイオチップを採用しています。組織工学は、内皮細胞、マクロファージ、上皮細胞などの主要な細胞成分を統合して、肺胞の代表的な組織モデルを作成するために使用されます。このモデルは、ウイルス、細菌、真菌などのさまざまな病原体に対する粘膜免疫応答の詳細な調査を容易にし、肺免疫の理解を深めます。このプロトコルの主な目標は、この肺胞オンチップモデルを感染研究のための堅牢な in vitro プラットフォームとして確立するための詳細を提供し、研究者が肺環境内の病原体と宿主の免疫系との間の複雑な相互作用を綿密に観察および分析できるようにすることです。これは、マイクロ流体ベースの技術を適用して、血流や内皮細胞の生体力学的刺激など、ヒト肺胞の主要な生理学的状態をシミュレートするとともに、上皮細胞の空気への現実的な曝露に不可欠な気液界面を維持することによって達成されます。このモデルシステムは、免疫蛍光染色、サイトカインプロファイリング、コロニー形成単位(CFU)/プラーク分析など、さまざまな標準化されたアッセイと互換性があり、感染中の免疫動態に関する包括的な洞察を可能にします。Alveolus-on-chipは、多孔質ポリエチレンテレフタレート(PET)膜で分離されたヒト遠位肺上皮細胞(H441)やヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの必須細胞タイプで構成され、初代単球由来マクロファージが上皮層と内皮層の間に戦略的に配置されています。この組織モデルは、 in vitroで肺免疫応答に関与する微妙な因子を解剖し、解析する能力を高めます。貴重なツールとして、呼吸器感染症の病因を研究し、潜在的な治療介入をテストするためのより正確で動的な in vitro モデルを提供し、肺研究の進歩に貢献するはずです。
概要
ヒトの肺は、呼吸と免疫防御において顕著な役割を果たしており、肺胞粘膜の免疫応答と免疫応答の間には複雑な相互作用があります1。肺胞が効率的な免疫応答を作り出す能力は、肺感染症を予防し、肺の健康を確保するために不可欠です。肺は常に細菌、ウイルス、真菌、アレルギー、粒子状物質など、さまざまな潜在的なリスクにさらされているため、肺胞粘膜免疫応答の複雑さを理解することは、呼吸器感染症、炎症性疾患の背後にあるメカニズムを発見し、肺疾患の治療に不可欠です1。
気道の感染および炎症関連プロセスをin vitroで研究するには、肺胞の環境と免疫応答を忠実に模倣できるモデルが必要です。2D細胞培養および動物モジュールは、肺免疫応答に関する生物医学研究に不可欠なツールとして何十年にもわたって使用されてきました。しかし、人間の状況への翻訳の可能性には限界があることが多いのです。Lung-on-chipモデルは、従来のin vitroモデルとin vivoモデルの間のギャップを埋めることに貢献し、ヒト特異的な免疫応答を研究するための新しいアプローチを提供することができます2,3。Lung-on-Chipモデルは、肺細胞が気道の生理学的状態を再現し、より正確で堅牢な組織モデルを開発するために必要な気液界面を模倣することができます。この培養技術により、細胞の分化、機能、および薬物や疾患関連刺激に対する応答をin vitroで精密に調べることができます2。
この研究では、血流を模倣するための灌流と内皮細胞の生体力学的刺激を適用し、気相4に曝露された上皮細胞との気液界面を組み込むことにより、ヒト肺胞環境を再現するための効果的なツールとして、ヒト肺胞のマイクロ流体ベースのモデルを提示します。私たちは、特に気液界面に焦点を当てて、ヒト肺胞の物理的構造と生物学的相互作用を模倣するマイクロ流体灌流肺胞オンチップを開発しました。この界面は、肺環境を正確にモデル化するために不可欠な呼吸器上皮細胞の分化に重要な役割を果たします。このモデルは、多孔質ポリエチレンテレフタレート(PET)膜で分離されたヒト遠位肺上皮細胞(H441)とヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を使用し、細胞層の間に単球由来の初代マクロファージを配置しています。このセットアップは、肺胞の複雑な細胞配置を再現し、肺組織の生理学的機能における重要な要素である気液界面を正確にシミュレートするために重要です。
モデル開発の背後にある理論的根拠は、循環免疫細胞と組織常在免疫細胞の両方を統合することにまで及びます。このアプローチは、ヒトの呼吸器感染症に対する炎症性宿主の応答を正確に模倣するように設計されており、病原体と宿主の相互作用を研究するためのダイナミックな環境を提供します。マクロファージの存在により、即時の免疫応答と病原体との相互作用を調べることができ、呼吸器感染症に対する防御の最前線を反映しています。さらに、バイオチッププラットフォームの設計は、生体物理学的および生化学的手がかりの両方を便利かつ正確に操作することを容易にします。これは、 in vitroで肺胞の機能を複製するために重要です。この柔軟性は、ヒト感染の要因を解剖するのに役立ち、研究者はさまざまな病状を反映するように条件を調整したり、潜在的な治療介入をテストしたりすることができます。このプラットフォームは、高度な顕微鏡、微生物学的分析、生化学的排水分析など、複数の読み出し技術との互換性により、その有用性が向上しています。これらの機能により、細胞の挙動、病原体の増殖、免疫応答の有効性の評価など、感染に対する組織応答を包括的に評価することができます。
私たちは、気液界面の複製と免疫細胞の統合に焦点を当てたヒト肺胞オンチップモデルを作成および利用するための詳細なプロトコルと技術を提示します in vitro でヒト感染を研究するために。
プロトコル
HUVEC細胞は臍帯から単離され、継代4まで使用されます。初代単球は、全血から健康なドナーから単離されます。この研究は、ドイツのイェーナにあるイェーナ大学病院の倫理委員会によって承認されました (3939-12/13)。ヘルシンキ宣言によると、この研究のために細胞を提供したすべての個人は、インフォームドコンセントを提供しました。
1. 1日目:バイオチップの準備
- バイオチップには、さまざまなサイズとモデルがあります。ここでの実験には、モデルBC002を使用します。バイオチップをガラスのシャーレに入れ、ディッシュに充填し、すべての空洞を滅菌70%エタノール(EthOH)で洗い流します。室温で45分間インキュベートします。その後、滅菌済みのddH2Oでキャビティを2倍洗い流し、ddH2Oを取り外します。
- 青色のチップ付き1,000 μLピペットを使用して、コラーゲンIV溶液を両方の空洞に穏やかに洗い流し、滅菌コラーゲンIV溶液(0.5 mg/mL 0.5 mM酢酸溶液中0.5 mg/mL、マグネシウムおよびカルシウムPBSを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に1:100濃度を使用)で、両空洞のバイオチップメンブレンをコーティングします。37°Cおよび5%CO2で15分間インキュベートします。
注:1,000 μLピペットとブルーフィルター(P1000)チップの使用は、プロトコール全体を通して推奨されます。フィルターチップの開口部の直径は、チャネルを接続するポートの開口部を完全に覆い、チップへの気泡の挿入を防ぎます。 - 30分間のインキュベーション後、下部と上部のチャンバーを滅菌PBS(+/+)で2回洗い流し、残りのコラーゲンと酢酸を洗い流します。
- 1:100(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U / mL)を加えてEC培地を調製します。各キャビティの上部チャンバーに250μLのEC培地を充填し、下部チャンバーに150μLのEC培地を充填します。
- コンフルエントT25フラスコからHUVECを回収する:マグネシウムとカルシウムPBSを含まない5 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(-/-)で洗浄し、0.25%トリプシン+ 1 mM EDTAをPBSに1 mL加え(-/-)、37°Cで3分間インキュベートします。 5 mLのPBS(+/+)+ 5%FCSを添加してトリプシン活性を停止し、50 mLのコニカルチューブで350 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットをEC培地1mLに再懸濁します。
- 細胞計数を行うときは、1:10の段階希釈を使用してください。再懸濁した細胞ペレット10 μLを90 μLの細胞培地に加えます。サンプルを慎重に組み合わせます。10 μLのトリパンブルー染色剤を塗布した微量遠心チューブを使用してください。細胞計数チャンバースライドを使用して、細胞溶液をトリパンブルー(1:1)で希釈します。ノイバウアーチャンバーを使用して手動で細胞をカウントするか、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。細胞数を決定し、濃度を 200 μL あたり0.4 x 10 6 細胞に調整します。
- バイオチップの上部チャンバーにある内皮細胞培地を、懸濁HUVECを含む200μLのEC培地と交換します。チャネルまたはチャンバー内の気泡の形成を避けるために、静かにピペットで動かします。バイオチップを入れたガラスシャーレを37°C、5%CO2に置きます。
2. 2日目:細胞層の確認
- 2日目に、上部チャンバーのHUVEC細胞層のコンフルエンシーを目視で確認します。上部チャンバー内で300μLのEC培地と培地交換を行います。細胞がメンブレンから剥がれないように、優しくピペットで動かします。24時間後に毎日メディア交換を行います。バイオチップを入れたガラスシャーレを37°C、5%CO2に戻します。
3. 3日目:下室の準備
- 内皮細胞層のコンフルエンシーを視覚的に確認します。この時点で、合流層と丸石のような形態の存在を判断します(図1)。上部チャンバー内で300μLのEC培地と培地交換を行います。
- 次に、上皮層を形成する細胞を播種するための下部チャンバーを準備します。150 μL の RPMI 培地で下部チャンバーを静かに洗い流します (1:100 (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)、5% ウシ胎児血清、1 μM デキサメタゾンを追加)。
- 下部チャンバーでは、キャビティあたり 200 μL の RPMI 培地 (RPMI) に 0.5 x 106 個の H441 細胞をシーディングします。
- H441細胞の回収
- 細胞を5mLのPBS(-/-)で一度洗浄します。0.25%トリプシン+ 1 mM EDTAを2 mLのPBS(-/-)に加えます。
- 細胞を37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベートします。インキュベーション時間は、層の合流性によって異なります。5〜7分以内に、細胞は完全に剥離するはずです。
- 10 mLのPBS(+/+)+ 5%FBSでトリプシン活性を停止し、細胞を回収し、200 x g で4分間遠心分離します。
- 遠心分離後、上清を捨て、ペレットを1mLのRPMIに再懸濁してカウントします。
- 細胞溶液を下部チャンバーに穏やかにピペッティングすることにより、チャンバーあたり0.5 x 106 個の細胞を播種します。すべてのポートを閉じ、バイオチップを逆さまにして、細胞がPETメンブレンに付着できるようにします。バイオチップを逆さまにしておき、細胞培養インキュベーターで37°C、5%CO2で一晩インキュベートします。
4. 4日目 - 7日目:細胞のメンテナンスと単球の採取
- 上部と下部のチャンバーで毎日培地交換を行います。上部チャンバーは、300μLのEC培地と培地交換を行います。
- 200 μL の RPMI+ (RPMI 培地と 1:100 (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)、10 ng/mL GM-CSF、10% 自家ヒト血清、1 μM デキサメタゾン) を下部チャンバーに使用します。7日目に、下部チャンバーをRPMI+で洗い流し、単球を播種するためのキャビティを準備します。
- 0.1 x 106 個の単球を200 μL RPMI+に下チャンバーに懸濁してシードします。
- 単球の採取
- 細胞を1 mLのPBS(-/-)で洗浄し、4 mg/mL Lidocaine + 5 mM EDTAを含む予熱PBS(-/-)で37°Cで7分間インキュベートし、5% CO2をインキュベートします。
- 細胞を回収し、350 x g で7分間遠心分離し、細胞を1mLのRPMI+に再懸濁してカウントします。バイオチップポートを下に向けて配置し、細胞がメンブレンに付着するようにします。
5. 8日目:バイオチップ灌流
- この時点で、バイオチップをフローに接続して灌流する準備ができていることを確認します。灌流を開始する前に、空のインキュベーターを準備し、蠕動ポンプを中に入れます。
- バイオチップの灌流
- 滅菌したチューブをバイオチップに取り付ける前に、チューブを200 μLのPBS(+/+)でフラッシュし、続いて200 μLのEC培地でフラッシュします。チューブの内径は0.5mmで、長い辺(20cm)と短い辺(12cm)を2つのチューブポンプストッパーで分割したものです。チューブを脇に置き、リザーバーを媒体用に準備します。
- 上部チャンバーと下部チャンバーで培地交換を行い、それぞれ調製したばかりの細胞培養培地とフラッシュします。
- バイオチップの出口側にリザーバーを挿入し、チューブ付きのリザーバーをバイオチップの入口に接続します(図2)。チューブをリザーバーとバイオチップに接続して、リザーバーとバイオチップの間に円形の媒体灌流が行われるようにします。
- すべてがポートに接続されたら、500μLのEC培地をリザーバーに充填します。バイオチップとチューブを21 μL/minの流速で灌流接続します(図2)。灌流の最初の15分間は、気泡の挿入をよく観察してください。両方のチャンバーで毎日培地交換を行います。
6. 9日目 - 11日目:気液界面の確立
- 灌流を停止し、リザーバーを空にし、滅菌された安全キャビネットの下に新たに調製した培地を補充します。500 μLのEC培地をリザーバーにピペットで移し、200 μLのRPMI+で下部チャンバーを穏やかに洗い流します。21 μL/minの灌流速度で灌流を再開します。
- 空気液体インターフェース(ALI)
- 12日目から実験終了(14日目)までALIを確立します。ALI培養中に、上皮細胞を空気にさらします。
- ALI培養を確立するには、新しい血管培地EC(1:100(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U / mL)、10 ng / ml GM-CSF、20%自家ヒト血清、1μMデキサメタゾンを追加)を調製して、チップ内のすべての細胞タイプを維持します。この時点で、培地には高濃度のASが含まれています(20%)。
- 無菌安全キャビネットの下の下部チャンバーのプラグを開き、 図3に示すように、気泡が見えるまで培地を慎重に吸収します。チャネルとチャンバーから液体全体が取り除かれていることを確認し、ポートを慎重に閉じます。
- リザーバーにEC(-/-)培地を充填し、21 μL/minの流速で灌流培養を続けます。14日目までは上部チャンバーでのみ培地を交換し、上皮細胞を下部チャンバー内に空気のみで保持します。
7. 14日目:組織採取と分析
- バイオチップをフローから切り離します。チューブを抜き、顕微鏡で細胞の密度を確認します。下部チャンバー内の空気のため、細胞層がぼやけて見え、視覚化が困難になる場合があります。この時点で、モデルはさらに実験する準備ができています。
- バイオチップにおける組織の固定と染色
- 空洞をPBS(+/+)で洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBS(-/-)に溶解した300μLを上部チャンバーに、200μLを下部チャンバーにピペットで移動し、室温で10分間インキュベートします。
注:PFAなどの固定用化学薬品を使用する場合は、ドラフトを使用してください。それに応じて廃棄物を収集して処分します。 - チャンバーをPBS(+/+)で3回洗浄します。固定後、バイオチップを4°Cで保存するか、直接細胞の免疫蛍光染色に使用します。
- 透過処理には、0.25% Triton X-100 in PBS (+/+) を 300 μL ピペットで固定します。室温で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、両方のチャンバーをPBS(+/+)で洗浄し、両方のチャンバーでPBS(+/+)中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を300μLピペットで動かします。RTで1時間インキュベートします。
- その間に、免疫蛍光染色用の抗体パネルを調製します。免疫蛍光染色用の抗体パネルを調製するために、抗体を希釈するために十分な量の3% BSAを含むチューブをセットしました。各メンブレンに50 μLの希釈抗体を使用してください。一次抗体パネルには1:100、二次抗体パネルには1:200の希釈比を使用してください。また、二次抗体パネルについては、1:2,000の希釈比でDAPIを調製します。対応する抗体については、(表1)を参照してください。
- バイオチップ内の細胞に直接アクセスするには、接着ホイルを取り外す必要があります。マイクロ流体チャンバーを開くには、キャビティの外側を正確に切り込み、ボンディングホイルを取り外します。バイオチップに密封された端をメスで取り除いて、メンブレンを切り取ります。
注意: このステップでは、メスの鋭利さによる膜の損傷や怪我を避けるために、正確かつ正確に作業してください。 - メンブレンをバイオチップから剥がした後、メンブレンを2つに分割します。メンブレン片をピンセットで集め、顕微鏡のスライドに置いて染色します。
- メンブレンピースあたり50μLの抗体溶液をピペットで。光から保護して、4°Cで一晩インキュベートします。
- インキュベーション後、メンブレンを24ウェルプレートのPBS(-/-)500μLに入れ、メンブレンをPBS(+/+)で各5分間3回洗浄します。洗浄後、50 μLの二次抗体溶液をピペットで取り、光から保護した室温で1時間インキュベートします。
- メンブレンをPBS(+/+)で3回、それぞれ5分間洗浄します。その間、実験用の顕微鏡スライドを準備し、ラベル付けします。スライド上に封入剤を一滴垂らし、対応するメンブレンを敷きます。すべてのメンブレンについてこの手順を繰り返します。最後に、封入剤をメンブレンの上部にもう1滴垂らし、カバーガラスを使用します。4°Cで保存してください。
- 空洞をPBS(+/+)で洗浄し、細胞培養培地を取り除きます。4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBS(-/-)に溶解した300μLを上部チャンバーに、200μLを下部チャンバーにピペットで移動し、室温で10分間インキュベートします。
結果
形態学的変化およびマーカータンパク質の発現の検査は、免疫蛍光染色を用いて実施することができる。14日間共培養した後、血管側と上皮側をそれぞれの細胞マーカーの発現について分析します。この方法は、血管および上皮成分の相互作用と完全性の研究に有用であり、感染に関連する機能的な生物学的読み出しとして疾患モデリングに不可欠です。免疫蛍光染色は、定量分析、形態学的評価、およびサイトカイン放出、LDH放出などの細胞死マーカーの排水分析、細胞の形態測定の変化などの機能アッセイによってサポートできます5。血管側では、VE-カドヘリンなどの内皮細胞接合タンパク質の完全性と形態を研究して、コンフルエンシーと内皮バリア形成を評価することができます6(図4A)。灌流後、内皮細胞層は、内皮細胞の境界でVE-カドヘリンの明確に構造化された発現とコンフルエントになるはずです。メンブレンの底部は、E-カドヘリンや界面活性剤プロテインA(SP-A)7などの上皮マーカーについて免疫染色することができます。肺サーファクタントの主要成分であり、脂質とタンパク質の複雑な混合物であるSP-Aの発現は、上皮の気液界面の表面張力を低下させ、それにより呼気中の肺胞の虚脱をin vivoで防止し、適切な肺機能とガス交換を維持します6,8。私たちのモデルでは、上皮細胞はALI処理後にSP-Aを発現し、免疫蛍光染色によって視覚化できます(図4B)。上皮細胞層のコンフルエンシーと完全性は、肺胞上皮細胞の重要な上皮接合マーカーであるE-カドヘリンの免疫蛍光染色によって確認できます(図4C)。マクロファージの存在は、マクロファージメーカータンパク質CD686の免疫蛍光染色によって確認することができます(図4C)。ウイルス感染、細菌感染、真菌感染を研究するには、Deinhardt-Emmer et al.6、Schicke et al.7、Hoang et al.9 に記載されている感染モデルの詳細をご覧ください。
図1:3日目のバイオチップ内のコンフルエントHUVECs層の代表画像。 画像は、10倍の倍率で明視野顕微鏡を観察したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:alveolus-on-chipおよびALI導入のセットアップ (A)alveolus-on-chipモデルの灌流セットアップの代表的なイメージ、(B)培地を吸収して細胞に空気を導入することにより、チャンバー内でALIを誘導する代表的なイメージ。チャンバー内に気泡が形成されることは、細胞が空気にさらされていることを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:歯槽オンチップの概略図。 14日間の培養の詳細なプロトコルは、バイオチップ内で細胞を播種および増殖するための重要なステップを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:内皮細胞層および上皮細胞層の免疫蛍光染色(A)VE-カドヘリンを発現するHUVEC内皮細胞(オレンジ)、(B-C)上皮側で(B)SP-A(赤)および(C)E-カドヘリン(オレンジ)、SP-A(赤)、およびCD68(緑)を発現するH441上皮細胞。DAPI(青)はDNAを染色し、細胞核を示します。スケールバーは50μmを表しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 空洞 | 細胞 |
| アッパーキャビティ | 内皮 (0.4 x 106) |
| 下部キャビティ | 上皮(0.5x106H441 + 1x105 単球) |
表1: バイオチップにおける細胞播種の概要。
ディスカッション
alveolus-on-chipモデルは、ヒト肺胞の多層組織モデルを表しており、肺上皮細胞、内皮細胞、マクロファージなどの下気道の必須細胞タイプを統合し、内皮内層の中程度の灌流を伴うALIで器官型配置で培養します。異なる層の細胞は、肺上皮細胞のカルシウム依存性接着分子であるE-カドヘリンなどの特定の細胞マーカータンパク質を発現し、これは細胞間上皮バリアの確立において中心的な役割を果たします5,10。E-カドヘリンは物理的バリア要素を形成し、環境中の有害な病原体や物質に対する免疫学的応答を制御します10,11。H441上皮細胞は、サーファクタントプロテインAをさらに発現し、これは免疫調節活性と抗菌活性を媒介することにより、感染に対する宿主防御の第一線でも重要です8。免疫細胞を肺胞モデルに組み込むと、その細胞の複雑さが増し、炎症性トリガーに対する免疫応答、すなわち感染時の免疫応答がよりよく再現されます。これに関連して、このモデルは、インフルエンザウイルスAとヒト日和見病原体である黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)5の同時感染を研究するために使用されました。本研究では、上皮細胞へのウイルス感染が重大な炎症反応を引き起こし、内皮細胞に多大な損傷を与え、バリア機能の喪失につながるという肺炎における同時感染のメカニズムが明らかになりました。別の研究では、このモデルを使用して、黄色ブドウ球菌の感染が、肺の重要な免疫防御成分であるサーファクタントタンパク質A(SP-A)の細胞外レベルを低下させることを実証しました。これは、おそらく細菌のプロテアーゼによるものです6。SP-Aの発現は、黄色ブドウ球菌やインフルエンザウイルスAのいずれにも直接影響を受けませんが、特にマクロファージの存在下で細菌感染に強く反応して産生されるサイトカインであるTNF-αによって大幅にダウンレギュレーションされます。これらの結果は、細菌のモノ感染およびスーパー感染が肺のSP-Aレベルを低下させ、細菌性肺炎の転帰を悪化させる可能性があることを示唆しています6。さらに、肺胞モデルは、Aspergillus fumigatusによる肺胞の真菌感染と、免疫蛍光染色やサイトカインプロファイリングなどの分子生物学的アッセイと組み合わせて高解像度顕微鏡とアルゴリズムベースの画像解析を活用することにより、抗真菌薬の有効性を研究するために使用されています7.肺胞オンチップにおける侵襲性肺アスペルギルス症のモデリングにより、真菌の増殖を部分的に阻害する可能性のあるヒトマクロファージの主要な機能が明らかになりました。マクロファージは、炎症誘発性サイトカインとケモカインの放出の中心であり、これは侵襲性真菌菌糸の数の増加と相関していました。さらに、この研究では、静真菌薬のカスポファンギンが真菌の増殖を効果的に制限し、真菌構造の形態学的変化を誘発することが確認されました。これは、他の研究の結果と一致しています。これらの研究は、感染の細胞標的を特定し、臨床的に関連性のある濃度で薬物を試験するためのモデルプラットフォームの可能性を裏付けています。
歯槽チップの確立中に考慮する必要があるいくつかの側面があります。正確な細胞播種は、均一な細胞分布と層形成を達成するために重要です。細胞が適切な密度で播種されていることを確認し、細胞層の完全性と機能を損なう可能性のある互いに過成長することなく、コンフルエンスを達成してください。ALI確立プロセス中は、汚染を防ぐために、媒体を頂端側から慎重に取り外し、ポートを閉じます。温度、CO2 レベル、培地組成などの最適な共培養条件を維持することは、内皮細胞と上皮細胞の両方の生存と相互作用にとって重要です。細胞層を乱したり気泡を導入したりしないように、常に慎重に培地交換を行ってください。ピペットで軽くピペットを動かし、汚染のリスクを最小限に抑えるために、使用するすべての機器が無菌であることを確認してください。気泡を防ぐために、培地交換中はゆっくりとピペットでチップを傾けて、気泡を逃がします。汚染を最小限に抑えるために、清潔で無菌の制御された環境で作業してください。モデルを使用した後続の実験のために 3D モデルを確立して維持するために必要な複雑さと精度を考慮してください。細胞層が正しく形成されない場合は、ドナーとバッチによって細胞増殖に違いが生じる可能性があるため、細胞密度と細胞バッチの最適化を検討してください。
このモデルは既存の方法に比べて大幅に改善されていますが、いくつかの制限を考慮する必要があることを認識することも不可欠です。そのような制限の1つは、マイクロ流体デバイスの操作に関連する複雑さとコストです。臓器チップモデルを実行するには、肺胞オンチップモデルを採用するためのマイクロ流体工学の専門的な機器と専門知識が必要です。さらに、このモデルは肺胞環境の主要な特徴の多くをうまく再現できますが、 in vivoで見られる細胞相互作用と機械的な力のすべてを完全に再現することはできません。例えば、このモデルには包括的な免疫系やヒトの肺の全種類の細胞が存在しないため、病原体と宿主の相互作用研究の精度に影響を与える可能性があります。
これらの制限にもかかわらず、Lung-on-chipモデルは、Transwellシステムなどの従来の2D細胞培養と比較して進歩しています。このモデルは、動的で灌流された環境内の多層組織に気液界面、内皮細胞と上皮細胞、免疫成分を組み込むことにより、 in vitroで肺の生理学、疾患、および治療反応を研究するためのより生理学的に関連性のあるアプローチを表しています。これは、ヒトの呼吸器感染症の理解を深め、より効果的な治療法を開発するために重要です。生物物理学的および生化学的手がかりを正確に操作するモデルの能力は、疾患の進行と薬物作用のメカニズムを解剖するための重要な特徴を表しています。ヒト細胞材料を用いることで、動物実験で見られる種間差をさらに減らすことができます。複数のバイオマーカー解析の統合により、1回の実験から得られるデータの深さと幅がさらに広がり、in vitro実験のコスト削減に貢献します。その限界を認識しつつも、肺オンチップモデルは呼吸器疾患研究における大きな前進であり、従来の方法に代わるより正確で倫理的で効率的な代替手段を提供します。
開示事項
K.R.はDynamic42 GmbHのCEOであり、同社の株式を保有しています。A.S.M.はDynamic 42 GmbHの科学顧問であり、同社の株式を保有しています。他のすべての著者には利益相反はありません。
謝辞
H.K.とA.S.M.は、ライプニッツ協会の戦略的ネットワーキングの資金提供を受けて、ライプニッツ・サイエンス・キャンパス・インフェクトオプティクス・イェーナからの資金提供を受けています。M.A.とA.S.M.は、ドイツ連邦議会の決議に基づき、連邦経済エネルギー省が資金提供するIGFプロジェクトIMPROVEの支援を受けました。A.S.Mはさらに、ドイツのエクセレンス戦略 - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860の下で、マイクロバースのクラスター・オブ・エクセレンス・バランスによる財政支援を認めています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング >消耗品 | |||
| セルカウンティングチャンバースライド (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Coverslips (24x40mm; #1.5) | メンゼル-GLäser | 15747592 | |
| Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | GreinerBio-One | 227 261-TRI | |
| ガーゼ綿棒 | Noba | PZN 2417767 | |
| 手袋 ニトリル 3000 | Meditrade | 1280 | |
| 顕微鏡スライド | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E | |
| マルチウェルプレート 24ウェル、滅菌 | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| パスツールピペット (ガラス) 150mm | アシスト | 40567001 | |
| パスツールピペット (ガラス) 230mm | アシスト | 40567002 | |
| 丸底チューブ (PS、5mL) | ファルコン | 352052 | |
| セーフティマルチフライセット 20G、200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Dahlhausen | 11.000.00.715 | ||
| Serologyピペット 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Serologyピペット 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Serologyピペット 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Serological pipettes 50mL | Bio-One | 768 160-TRI | |
| Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 フラスコ | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| チップ滅菌10µL | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| チップ滅菌1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| チップ滅菌300µL | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| チップ 未滅菌 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| チップ 非滅菌 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| チップ 未滅菌 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| セット (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| エタノール 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| フルオレセイン イソチオシアネート (FITC)-デキストラン (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| 蛍光実装媒体 | ダコ | S3023 | |
| メタノール | VWR | 20847.295 | |
| サポニン | フルーカ | 47036 | |
| テルガザイム | アルコノックス | 1304-1 | |
| <ストロング>細胞培養コラーゲン | |||
| IV | シグマ-アルドリッチ | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA溶液 | Sigma-Aldrich | E788S | |
| 内皮細胞増殖培地 | Promocell | C-22020 | |
| 内皮細胞増殖培地サプリメントミックス | Promocell | C-39225 | |
| ウシ胎児血清 | Sigma-Aldrich | E2129-10G | |
| H441 | ATCC | ||
| ヒト組換え GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| リドカイン | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Trypane Blue Stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Primary Antibodies | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (ヤギ) | BD | 610252 | |
| CD68 (ウサギ) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (ヤギ) | R&D | AF748 | |
| SP-A (マウス) | Abcam | ab51891 | |
| Secondary antibodies | |||
| AF488 (ロバ抗マウス) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (ロバ抗マウス) | Invitrogen | A31571 | |
| AF647 (ロバ抗ウサギ) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (ロバ反ヤギ) | ジャクソンリサーチ | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| オス ルアー ロック (小) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| オス ミニ ルアー プラグ、4 列、PP、グリーン | マイクロ流体チップショップ | 09-0558-0336-11 | |
| オスミニルアープラグ、4列、PP、不透明マイクロ | 流体チップショップ | 09-0556-0336-09 | |
| オスミニルアープラグ、4列、PP、赤 | マイクロ流体チップショップ | 09-0557-0336-10 | |
| プラグ | コールパーマー | GZ-45555-56 | |
| リザーバー 4.5mL | チップショップ | 16-0613-0233-09 | |
| チューブ | ダイナミック 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| オートクレーブ | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5424 | |
| CO2インキュベーター | Heracell | 150i | |
| Countess 自動セルカウンター | Invitrogen | C10227 | |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
| 冷凍庫(-20°C;C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| フリーザー (-80 °C;C) | ヘレウス | ヘラフリーズ HFU 686 | |
| 冷蔵庫 | Liebherr | LCexv 4010 | |
| ヘレウス マルチフュージ | Thermo Scientific | X3R | |
| 顕微鏡 | ライカ | DM IL LED | |
| オービタルシェーカー | ハイドルフ | Reax2000 | |
| 蠕動ポンプ | REGLO デジタル MS-4/12 | ISM597D | |
| ピペット 10&マイクロ;L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| ピペット 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| ピペット 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| ピペット 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| ピペット 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| ピペット 200µL | エッペンドルフ リサーチ プラス | 3123000055 | |
| スケール | ザルトリウス | 6101 | |
| スケール | ザルトリウス | TE1245 | |
| 滅菌ベンチ | コジャイア | バイオウィザード SL-130 | |
| ウォーターバス | ジュラボ | SW-20C | |
| <強力>蛍光顕微鏡 セットアップ | |||
| Apotome.2 | ツァイス | ||
| 照明装置 | ツァイス | HXP 120 C | |
| 顕微鏡 | ツァイス | アクシオ オブザーバー 5 | |
| 光学セクショニング | ツァイス | アポトーム | |
| 電源顕微鏡 | ツァイス | エプラックス Vp232 | |
| Software | |||
| ZENブルーエディション | ツァイス |
参考文献
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
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