当社の詳細なプロトコルは、3D構造とさまざまな細胞タイプでヒトの腸粘膜をシミュレートし、微生物のコロニー形成に応答した免疫応答と細胞機能の詳細な分析を可能にする高度な腸オンチップモデルの作成と使用について概説しています。
方法論記事
腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
上皮の3D器官型絨毛様および陰窩様構造を再現する高度な腸オンチップモデルが開発されました。免疫適格モデルには、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、Caco-2腸上皮細胞、組織常在マクロファージ、樹状細胞が含まれ、これらは組織内で自己組織化し、ヒト腸粘膜の特性を反映しています。このプラットフォームのユニークな側面は、循環するヒト初代免疫細胞を統合し、生理学的関連性を高める能力です。このモデルは、細菌や真菌のコロニー形成や感染に対する腸管免疫系の反応を調べるために設計されています。キャビティサイズが拡大しているため、このモデルは、透過アッセイ、サイトカイン放出、免疫細胞浸潤などの多様な機能的読み出しを提供し、上皮細胞層によって形成される3D構造の免疫蛍光測定に適合します。これにより、細胞の分化と機能に関する包括的な洞察が得られます。このインタインオンチッププラットフォームは、微生物叢の代理とヒト宿主組織との間の微生物叢の代理と、微生理学的灌流バイオチッププラットフォーム内での複雑な相互作用を解明する可能性を実証しています。
概要
Organ-on-Chip(OoC)システムは、従来の2D細胞培養と動物モデルとの間のギャップを埋めることができる3D細胞培養の新たな技術です。OoCプラットフォームは、典型的には、メンブレンまたはハイドロゲル1のような広範囲の足場上で増殖した組織特異的細胞を含む1つ以上のコンパートメントからなる。モデルは、1つ以上の定義された器官型機能を模倣することができます。ポンプは、細胞の老廃物を除去するための細胞培養培地の連続的なマイクロ流体灌流、細胞分化を改善するための栄養因子と成長因子の供給、および必要なin vivo条件の再現を可能にします。免疫細胞の統合により、OoCシステムはin vitroでヒトの免疫応答を模倣することができます2。これまでに、さまざまな臓器や機能単位が発表されてきました1。これらのシステムには、血管系3、肺4、肝臓2,5、および腸6のモデルが含まれ、薬物試験5,7および感染研究6,8のために容易にすることができる。
ここでは、絨毛様および陰窩様構造の器官型3Dトポグラフィーを形成するヒト上皮細胞を統合し、内皮内層および組織常在マクロファージを組み合わせたヒト腸オンチップモデルを紹介します。このモデルは、マイクロ流体灌流バイオチップで顕微鏡スライドの形式で培養されます。各バイオチップは、2つの別々のマイクロ流体キャビティで構成されています。各キャビティは、多孔質ポリエチレンテレフタレート(PET)膜によって上部と下部のチャンバーに分割されています。膜自体は、細胞が両側で成長するための足場としても機能します。メンブレンの細孔は、細胞のクロストークと細胞層間の細胞移動を可能にします。各チャンバーには、2つのメスルアーロックサイズのポートからアクセスできます。オプションで、追加のミニルアーロックサイズのポートを使用して、上部または下部のチャンバーにアクセスできます(図1)。
OoCプラットフォームは、1回の実験から得られる多数の読み出しを提供します。インセプトオンチップは、灌流3D細胞培養、廃液分析、および蛍光顕微鏡法を組み合わせて、細胞マーカーの発現、代謝率、免疫応答、微生物のコロニー形成と感染、およびバリア機能を評価するように調整されています3,6,8。このモデルには、組織に常在する免疫細胞と、生きた微生物と宿主組織との直接接触が含まれており、これは他の公開モデルと比較して利点である9。さらに、上皮細胞は、生きた微生物叢とのコロニー形成に生理学的に関連性のあるインターフェースを提供する三次元構造に自己組織化します6。
プロトコル
このプロトコルでは、健康なドナーからバイオチップ1本あたり~20mLの新鮮な血液を摂取し、ヒトの初代単球を分離する必要があります。すべてのドナーは、この研究に参加するために書面によるインフォームドコンセントを提供し、イエナ大学病院の倫理委員会によって承認されました(許可番号2018-1052-BO)。資料の詳細については、 資料表をご参照ください。すべての溶液と培地の組成の詳細については、 表1を参照してください。
1. バイオチップの取り扱いに関する一般的な注意事項
- リザーバーのストリップを慎重に分離し、加熱されたナイフを使用して蓋を取り外して、単一のリザーバーと蓋を取得します。シリコンチューブがぴったりと収まるように、蓋の穴を広げます。
- シリコンチューブの内径は0.5mmで、非対称で、2つのチューブポンプストッパーによって長い(20cm)側と短い側(12cm)に分かれています。バイオチップごとに各対称の2本のチューブを組み立てるには、チューブをオスのルアーロックコネクタとチューブの反対側の蓋に取り付けます。また、バイオチップごとに4つのリザーバーを組み立てます。
注:チューブとリザーバーを事前に準備し、使用前にオートクレーブ滅菌してください。シリコーンチューブの寿命は限られているため、3〜5回の実験後にチューブを交換してください。薬物試験など、特定の研究対象については、実験ごとに新しいチューブを準備することをお勧めします。このプロトコルの多くのステップは並行して実行されます。 図 2 に示すように、1 日に実行されるさまざまな手順を強調した概要図を参照してください。
図1:intestine-on-chipモデルの概略図(A)バイオチップを断面図で示しています。(B)バイオチップ全体と、平らで取り外し可能なPETメンブレンの寸法が見えます。メスのルアーロックサイズのポートを含む上部チャンバーの総容量は、下部チャンバーでそれぞれ 290 μL と 270 μL です。(C)腸管バイオチップの概略的な組成物として、分化した免疫細胞や粘液層を含む絨毛様や陰窩状の構造に似た立体的な伸長上皮が見られる。PETメンブレンの反対側は、内皮単層で覆われています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:モデルの構築タイムラインと実験セットアップの概略図。 次の図は、提示されたプロトコルの概略図の概要を示しています。細胞の播種やLPSによる上皮チャレンジなどの重要な手順は、矢印で示されています。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;LPS =リポ多糖類。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.バイオチップ滅菌
- 直径15cmの滅菌ガラスペトリ皿に、70%の非変性エタノールを入れます。バイオチップのすべてのポートがエタノール溶液で完全に覆われるように、バイオチップを内部に置きます。
- ポートごとに2回、チップのすべてのチャンバーから1 mLの70%エタノールを引き出します。室温(RT)で45〜60分間インキュベートします。
注意: バイオチップ内に空気が閉じ込められていないことを確認してください。この時点から、バイオチップシステムに空気が入ることはなく、空洞は液体で満たされたままになるはずです。 - ペトリ皿のエタノールを取り除き、すべてのポートが完全に覆われるまで滅菌二重蒸留水(ddH2O)と交換します。再度、ポートごとに2回、バイオチップキャビティを通して1mLのddH2Oを引き出します。ペトリ皿のddH2Oをリフレッシュし、手順を繰り返します。
- ペトリ皿からすべての液体を取り除きます。今後、完全に滅菌されたバイオチップは、無菌環境の外にあるときはいつでも、閉じたペトリ皿の内側に保管してください。2〜5 mL ddH2Oの小さなリザーバー(50 mLチューブの蓋など)をペトリ皿に追加して、バイオチップ内の液体の蒸発を減らします。
注:バイオチップは、使用まで無菌環境に置いておくと、最大3日前に滅菌できます。これにより、1日でワークロードを柔軟に処理できます。
3. HUVECの収穫および播種
注:ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、10より前に発表されたように臍帯から単離されました。
- HUVECを播種する前に、メンブレンをヒトコラーゲンIVでコーティングします。このためには、マグネシウムとカルシウムを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS +/+)にコラーゲンストック溶液(表1)を1:100希釈して調製します。希釈したストック溶液350μLをそれぞれのチャンバーに加えます。RTで5分間インキュベートします。
注:バイオチップを滅菌フードで取り扱う場合は、その下に滅菌組織を置いて、過剰な培地を収集することをお勧めします。 - すべてのチャンバーを350 μL のPBS +/+で2回フラッシングし、残りのコラーゲンと酢酸を洗い流します。次に、各チャンバーに350 μLの内皮細胞増殖(EC)培地を加えます。
注:ここから、バイオチップは細胞播種の準備が整い、使用するまで37°Cで保存できます。 - 継代1〜3でHUVECを80〜90%の細胞密度で使用します。HUVECは、メーカーが提供する所定のサプリメントミックスを含むEC培地で培養します。HUVEC細胞培養の代表的な明視野像を 図3Aに示します。
注:ドナーによっては、より高い通路のHUVECが脱分化し始め、バイオチップ内に密集した合流性単層を確実に形成できなくなります。抗生物質、すなわち100 U/mLペニシリンと100 μg/mLストレプトマイシンの使用は任意ですが、微生物汚染を防ぐためのEC培地のサプリメントとして推奨されます。 - T25細胞培養フラスコから細胞培養培地を取り出し、マグネシウムとカルシウムを含まない3〜5mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で細胞を穏やかに洗浄します。PBS-/-を取り外し、1 mLのトリプシン解離試薬を追加します(表1)。細胞が細胞培養フラスコから分離するまで、37°Cで5分間インキュベートします。
- PBS中の9 mLの5%ウシ胎児血清(FBS)を使用して、剥離した細胞をチューブに移します-/-。室温で350 × g で5分間遠心分離し、上清を除去し、1 mLのEC培地に再懸濁し、細胞数を決定します。細胞濃度を150μLあたり0.4×10個6 個(下部チャンバーでの播種)または250μLあたり(上部チャンバーでの播種)に調整します。
- それぞれの量のセルをチャンバーに追加します。下部チャンバーで播種する場合は、すべてのポートを閉じ、すぐにバイオチップを逆さまにして、細胞がPETメンブレンに落ちるようにします。バイオチップを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。
- 24時間後に、HUVEC含有チャンバーを350 μLのEC培地と交換します。対向するチャンバー内の媒体を交換する必要はありません。
4. ヒト血清採取と末梢血単核細胞(PBMC)由来単球の単離
注:PBMCは、Mosig et al.11に記載されているように単離されました。
- 健康なドナーからヒトの静脈血を採取します。バイオチップごとに、血清採取のためにケイ酸塩含有採血チューブで最低10mLの全血を調達します。完全に凝固した後、採血チューブを2,500 × g でRTで10分間遠心分離し、血清、分注を採取し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。
- PBMC分離のために、同じドナーから最低10mLの全血をEDTA含有採血チューブで調達します。凝固していない血液を等緩衝液(表1)と1:1で穏やかに混合し、この混合物の35 mLを、密度1.077 g / mLの密度15 mLの密度勾配培地の上に50 mLチューブでゆっくりと重ねます。.
- RTで800 g× gで 20分間遠心分離し、得られた免疫細胞層を慎重に引き出し、密度勾配培地の上に現れ、新しい50 mLチューブに移します。50mLまで冷たくしたアイソバッファーを充填し、穏やかに反転させて細胞を洗浄します。
- 200 × g で8分間、ブレーキなしで4°Cで遠心分離します。 上清を捨て、密度勾配ごとに10 mLのアイソバッファーに再懸濁します。オプション: 複数のグラジエントが並行して実行される場合は、1 人のドナーの PBMC をプールします。
- 150 × g で4°Cで8分間遠心分離します。 上清を捨て、密度勾配ごとにペレットを10 mLのアイソバッファーに再懸濁します。遠心分離ステップ4.4を繰り返します。最後に、上清を捨て、細胞を2 mLの単球分化培地に再懸濁します(表1)。
注:M-CSFおよびGM-CSFの添加は、単離された単球の分化を単球由来マクロファージおよび単球由来樹状細胞(このプロトコルの後の時点で添加されるリポ多糖[LPS]と組み合わせて)に強制する。抗生物質、すなわち100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシンの使用は任意ですが、微生物汚染を防ぐための培地のサプリメントとして推奨されます。 - 細胞数を決定し、2 mLの単球分化培地中の6ウェルプレートのウェルあたり10~10 ×6 個の細胞を播種します(表1)。加湿インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、6ウェルプレートのプラスチックに単球を付着させます。
- 上清を慎重に廃棄し、予熱した2 mLの造血細胞培地で2回洗浄し、結合していない細胞を取り除きます。単球分化培地で37°Cでさらに24時間インキュベートします。
- 単球を採取するには、上清を慎重に捨て、予熱したPBS2 mLで一度洗浄します。この時点での単球培養の明視野像の例については、 図3B を参照してください。次に、37°Cで1 mLの予熱単球剥離試薬(表1)で細胞を7分間インキュベートし、6ウェルプレートのプラスチックからの単球の剥離を強制します。
- 剥離した単球を低結合チューブに移します。オプション:より高い細胞収量を達成するために、6ウェルプレートをPBS-/-で数回慎重に洗浄します。
- 室温で300 × g で8分間遠心分離し、上清を廃棄し、ECコンディショニング培地に再懸濁します(表1)。細胞番号を決定し、細胞濃度を150μLあたり0.1×10個6個( 下部空洞での播種)または250μLあたり(上部空洞での播種)に調整します。
注:免疫細胞の分離のすべてのステップで穏やかにし、免疫細胞の活性化を防ぐためにせん断力を減らしてください。この単離を確立する際には、PBMC由来単球の純度を確認してください(フローサイトメトリーなど)。全細胞の95%以上が、CD14などの典型的な単球マーカーに陽性であるべきです。
5.単球播種
- HUVEC含有チャンバー内で、予熱したECコンディショニング培地350μLと培地交換を行います。
- 調製した単球懸濁液(ステップ4.10を参照)の150μL(下部チャンバー)または250μL(上部チャンバー)を同じチャンバーに加えます。下部チャンバーに播種する場合は、すべてのポートを閉じ、すぐにバイオチップを逆さまにして配置し、細胞がHUVEC層に落下するようにします。バイオチップを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。
- HUVEC + 単球含有チャンバー内で、350 μL の EC コンディショニング培地と 24 時間ごとに培地交換を行います。
6. C2BBe1の収穫と播種
注:細胞1(C2BBe1)12 を発現するCaco-2ブラシ境界は、継代35まで使用され、80〜90%の密度のフラスコから採取されます。C2BBe1培養物の代表的な明視野像を 図3Cに示します。
- C2培地でC2BBe1細胞を培養します(表1)。
注:抗生物質、すなわち20μg/mLゲンタマイシンの使用は任意ですが、微生物汚染を防ぐためのC2培地のサプリメントとして推奨されます。 - T25細胞培養フラスコの細胞培養培地を取り出し、3〜5mLのPBS-/-で細胞を穏やかに洗浄します。PBS-/-を取り外し、1 mLのトリプシン解離試薬を追加します(表1)。細胞が細胞培養フラスコから分離するまで、37°Cで5分間インキュベートします。
- PBS中の5%ウシ胎児血清(FBS)9mLを使用して、剥離した細胞をチューブに移します-/-。室温で350 × g で5分間遠心分離し、上清を取り除き、1 mLのC2培地に再懸濁して、細胞数を決定します。細胞濃度を150 μL(下部チャンバーでの播種)または250 μL(上部チャンバーでの播種)あたり0.5 × 106 細胞に調整します。
- C2BBe1を播種する前に、350μLのC2培地で各チャンバーを穏やかに洗浄してください。
- 調製したC2BBe1懸濁液(ステップ6.3を参照)の150μL(下部チャンバー)または250μL(上部チャンバー)をそれぞれのチャンバーに加えます。下部チャンバーに播種する場合は、すべてのポートを閉じ、すぐにバイオチップを逆さまにして、細胞がPETメンブレンに落ちるようにします。バイオチップを加湿インキュベーターで37°C、5%CO2でインキュベートします。
図3:バイオチップに播種する前のHUVEC、単球、およびC2BBe1の細胞形態。 この図は、プロトコル全体で使用されるさまざまな細胞源の代表的な明視野画像を示しています。画像は、10倍の倍率を使用して逆明視野顕微鏡で撮影されました。すべての細胞タイプ、(A)HUVEC、(B)単球、および(C)C2BBe1は、それぞれの特定のプロトコールセクションに記載されているように、2D単層細胞培養で培養しました。スケールバー = 200 μm。略語:HUVECs =ヒト臍帯静脈内皮細胞;PBMCs = 末梢血単核細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
7.蠕動ポンプと循環灌流への接続
- 蠕動ポンプを追加して空のインキュベーターを準備します。インキュベーターのすべての領域を徹底的に洗浄し、消毒剤でポンプして、準無菌環境を提供します。
注:蠕動ポンプは、作業中に大量の熱を発生することがあります。断熱性の高いインキュベーターや空調の行き届いていない実験室では、インキュベーターが過熱する傾向があるため、インキュベーターごとに使用できるポンプの数が制限される場合があります。インキュベーターごとに2つの蠕動ポンプが適切であるべきです。 - 滅菌したチューブをバイオチップに取り付ける前に、各チューブを700 μLのPBS +/+でフラッシュし、続いて500 μLのC2培地またはECコンディショニング培地でフラッシュします。媒体ごとに各対称のチューブを1本準備します(ステップ1.2を参照)。ルアーロックからペリスタルティックポンプストッパーまでの距離が短いチューブは左のキャビティに、チューブはもう一方の対称性を持つチューブを右のキャビティに使用します。
- インキュベーターからバイオチップを取り出し、各チャンバーで350μLの培地交換を行います。すべてのプラグを取り外し、すべてのポートを一番上まで埋めます。
- 左側のキャビティから始めて、ルアーロックアダプターをバイオチップのポートに挿入して、最初のチューブを上部チャンバーの右側のポートに接続します。次に、2 番目のチューブを下部チャンバーの左側のポートに接続します。この手順を右のマイクロ流体キャビティに対して繰り返します。
- リザーバーを取り、リザーバーの底に細胞培養培地を少量加えます。次に、リザーバーを最初のチューブの反対側に挿入し、もう一方のチャンバーについても繰り返します。すべてのポートをチューブまたはリザーバーに接続したら、リザーバーに3.5 mLの細胞培養培地を入れます。
- 蓋が取り付けられているチューブの緩い面をリザーバーの上に置き、各チャンバーのマイクロ流体システムを閉じます。この状態で、バイオチップを蠕動ポンプに輸送します。
注:インキュベーターまでの距離と実験室の周囲に応じて、事前に洗浄してオートクレーブ滅菌したボックスを使用してチップをインキュベーターに移すことができます。 - チューブをポンプに接続するには、蠕動ポンプストッパーを使用します。媒体がリザーバーからキャビティに流れ込み、チューブに流れ込み、ポンプを介してリザーバーに戻るように、各チューブを蠕動ポンプに接続します(図4)。リザーバーは、円形灌流のバブルトラップとして機能し、空気がシステムに閉じ込められるのを防ぎます。50μL/minの流速で各チャンバーを灌流すると、上部チャンバーで0.013 dyn/cm2、下部チャンバー8で0.006 dyn/cm2のせん断応力が得られます。
注:下部腔と上部腔の媒体が反対方向に移動される場合、腸組織のより高い三次元成長を達成することができる13。したがって、上部と下部の空洞の貯留層は反対側に配置されます(図4)。環状灌流は、必要な細胞培養培地の量を減らしますが、サイトカインや代謝物の濃縮につながる可能性があります。必要に応じて、バイオチップの線状灌流も可能です。 - バイオチップを37°Cおよび5%CO2で72時間灌流します。
図4:蠕動ポンプに接続されたバイオチップ。 蠕動ポンプに接続されたバイオチップの例が示されています。上皮性C2BBe1細胞は下部チャンバーで培養され(赤色のC2培地は前面のリザーバーにあります)、HUVECは上部チャンバーで培養されます(黄色がかったECコンディショニング培地は背面のリザーバーにあります)。異なる細胞培養培地は、成長した組織のバリア機能のために混合されていません。バイオチップは、媒体がリザーバーからキャビティに流れるように蠕動ポンプに接続されています。ここから、媒体はポンプを介してチューブを通ってリザーバーに逆流します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
8. LPSによる上皮バリアのコンディショニング
- 72時間の予備灌流後、蠕動ポンプを停止し、各リザーバーのチューブに接続されている蓋を取り外します。.ポンプの隣の滅菌ティッシュの上に置きます。
- すべての培地を取り出し、リザーバーに2mLの新しく調製した培地を入れます。C2BBe1細胞を含む上皮側については、100 ng/mL LPSを培地に加えます。
注:LPSは、組織のバリア機能を高め、単球由来のマクロファージを刺激して上皮組織に移動し、単球由来の樹状細胞の分化を可能にします。 - チューブと蓋をリザーバーに再接続し、50 μL/minの流速でさらに24時間、円形灌流を続けます。
注:この時点から、チップモデルは化合物試験や感染研究などの実験に使用できます。24時間ごとにリザーバーあたり2mLの中程度の交換をお勧めします。
9. さまざまな読み出し方法のための組織へのアクセス
- 灌流中は常にリザーバーから細胞培養培地の上清を収集します。リザーバーを開き、目的のボリュームを収集します(手順8.1〜8.3を参照)。これらの上清は、代謝物、サイトカイン、またはその他の分子の検出に使用します。
- 組織にアクセスするには、メスを使用して上部チャンバーの外側に沿って正確なカットを行い、ボンディングホイルを取り外してマイクロ流体キャビティを開きます。腸内バイオチップモデルの組織にアクセスできるようになりました。マイクロ流体チャンバーの外側に沿って慎重に切断し、バイオチップからメンブレンを剥がします。ピンセットを使用して組織含有膜を収集します。
注意: このステップでは指の位置に注意し、事故を防ぐために慎重に作業してください。耐切創性手袋をお勧めします。 - あるいは、酵素溶液、すなわちトリプシンまたはTriton X-100含有バッファーを使用して溶解した細胞を使用して、バイオチップ内の別々の層から細胞を回収します。
10. FITC-デキストラン拡散による透過性評価
注:組織のバリア機能は、蠕動ポンプの切断後にFITC-デキストラン透過性アッセイを介して分析できます。FITC-デキストラン透過性評価は、Deinhardt-Emmer et al.4 から採用されました。
- フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン(分子量3-5 kDa、 表1)のストック溶液を調製します。
- リザーバーを空にし、チップを灌流から切り離します。
- 上部と下部のチャンバーでフェノールレッドフリー培地と培地交換を行います。
注:実験中にフェノールレッドフリー培地がすでに使用されている場合、この手順は必要ありません。 - 1 mg/mL FITC-デキストラン溶液 350 μL を C2BBe1 細胞を含むチャンバーに加えます。
- ポートを閉じ、上皮側を上に向けてチップを37°Cで60分間インキュベートします。
- インキュベーション時間後、チップの両チャンバーから培地を別々に収集し、測定まで光から保護して4°Cで保存します。
- 測定には、C2培地とフェノールレッドを含まないECコンディショニング培地で、1,000 μg/mLから0 μg/mLのFITC-デキストランを11回連続して1:2段階希釈して標準曲線を調製します。
- 各サンプルの200 μLを、底が透明な黒色の96ウェルプレートに移します。マイクロプレートリーダーで励起波長495 nm、発光波長517 nmの蛍光を測定します。
- 標準曲線を使用して、サンプルのFITC-デキストラン濃度、ひいては透過性係数を計算します。
11. 免疫蛍光染色
注:生体組織は顕微鏡で調べることができます。取り扱いを容易にするために、バイオチップをペリスタルティックポンプから取り外し、倒立顕微鏡で長距離対物レンズを使用することをお勧めします。エンドポイント分析として、免疫蛍光染色などの手順のために、組織をバイオチップ内に固定することができます。
- 蠕動ポンプを停止し、すべての空洞のリザーバーを開きます。リザーバーを空にし、チューブとリザーバーをバイオチップから外します。
- チャンバーごとに2回、マイクロ流体キャビティを500μLの冷たいPBS +/+で洗浄します。氷冷したメタノール500μLをすべてのキャビティに加え、-20°Cで15分間インキュベートします。 次に、キャビティごとに2回、マイクロ流体チャンバーを500μLのPBS +/+で洗浄します。
注:4%パラホルムアルデヒドまたはカルノイ固定剤による固定などの他の固定方法も適しています。固定後、チップは4°Cで保存するか、直接免疫蛍光染色に進むことができます。注意:メタノールやパラホルムアルデヒドなどの固定化学物質は有毒です。ヒュームフードの下でそれぞれの作業を行い、それに応じて廃棄物を収集します。 - ステップ9.2の説明に従ってチップを開き、組織にアクセスします。組織含有PETメンブレンを最大3つに切断して、異なるイムノパネルと並行して染色します。
- 精密ピンセットを使用して、各メンブレン片をブロッキングおよび透過化溶液(表1)を含む別々の24ウェルプレートに移します。染色プロセス全体を通して、目的の細胞層が常に上を向いていることを確認してください。メンブレンピースを室温で30分間インキュベートします。
注:血清を二次抗体に一致させると、最良の染色結果が得られます。例えば、ヤギ種から二次抗体が得られる場合は、正常なヤギ血清の使用を推奨します。 - メンブレン片を湿ったチャンバー内の清潔なスライドガラスに移します。染色液(表1)で一次抗体パネルを調製し、各メンブレンピースに50 μLを加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
注:最適な抗体濃度と染色効果は、メーカーやクローンによって異なる場合があります。染色パネルは、事前に2D細胞培養で試験することをお勧めします。 - インキュベーション後、サンプルを24ウェルプレートに移し、メンブレンを洗浄液で3 x 5分間穏やかに洗浄します(表1)。
- 再度、メンブレン片を湿気の多いチャンバー内のきれいなスライドガラスに移します。二次抗体パネルを染色溶液(表1)で調製し、各メンブレン片に50 μLを加えます。必要に応じて、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)やHoechstなどの核対比染色を添加します。室温で30分間インキュベートします。
注:蛍光色素を使用している間は、光退色を防ぐためにサンプルを光から保護して画像品質を向上させてください。 - インキュベーション後、サンプルを24ウェルプレートに移し、メンブレンを洗浄液で2 x 5分間穏やかに洗浄します(表1)。次に、PBS +/+で5分間一度洗浄します。
- 蛍光封入剤とカバーガラスを使用して、透明なスライドガラスにメンブレンピースを取り付けます。顕微鏡イメージングまで4°Cで保存してください。
結果
これらの代表的な結果は、インタネインオンチップモデルの異なる組織層を示しています。それらは、プロトコルセクション11に記載されているように免疫蛍光染色されています。画像は、落射蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡でZスタックとして撮影され、直交投影に処理されました。顕微鏡のセットアップとソフトウェアの詳細については、材料の表を参照してください。図5は、HUVECとマクロファージからなるバリア形成内皮単層である血管層を示しています。内皮細胞にはVE-Cadherin因子、von Willebrand因子、マクロファージにはCD68などの代表的な細胞マーカーを染色します。C2BBe1細胞からなる三次元上皮層を図6と図7に示します。組織の完全性は、E-カドヘリンとZO-1の染色によって確認されます。予想されるすべての組織マーカーと組織分極の詳細な分析は、Maurer et al.6にあります。図8は、腸絨毛様構造の3次元成長を欠いた例示的な画像を示しています。一般的な三次元細胞層(図6)と比較して、染色された核の数は非常に少なく、細胞は単層にのみ存在します。この特定の表現型は、細胞増殖を阻害するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を細胞培養培地に添加することによって作成されました。バリア透過性は、FITC-デキストランを使用した透過アッセイによって評価されます。透過性は、図9Aに示すように、日和見病原性C.albicansに感染すると増加しました。感染は、サイトカインIL-1β、IL-6、IL-8、およびIL-10の血管培地上清への放出を増加させる(図9B)8。
図5:インタインオンチップの固定された血管側。 5日間の灌流後の血管関門の代表的な免疫蛍光画像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得し、このzスタックの直交最大投影を表示します。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。(B)完全分化型単球由来マクロファージはCD68を発現し、血管組織全体に広がっています。(C)HUVECは、VE-カドヘリンなどの接着結合の形成により、組織の完全性を示すコンフルエント層を作成します。さらに、(D)フォン・ヴィレブランド因子はHUVECによって高度に表現されます。最後に、(E)すべてのマーカーがオーバーレイで表示されます。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;HUVECs = ヒト臍帯静脈内皮細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:腸の固定された上皮側-オンチップ。 ジャンクションタンパク質E-カドヘリンとZO-1を発現する5日間の灌流後の分極上皮細胞層の代表的な免疫蛍光像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得しました。この Z スタックの直交最大投影が表示されます。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。タイトな上皮バリアは、(B)E-カドヘリンで染色された付着性ジャンクションと、(C)ZO-1で染色された頂端タイトジャンクションの形成によって形成されます。タイトジャンクションと接着ジャンクションは、(D)オーバーレイ画像に見られるように、頂端細胞膜で共局在します。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:絨毛様の成長を伴う腸の固定された上皮側。 6日間の灌流後の三次元上皮細胞層の代表的な免疫蛍光画像。組織をカーノイの固定剤で固定しました。1μm切片のzスタックを共焦点レーザー走査型顕微鏡で撮影し、(A)このzスタックの直交最大投影を表示しています。核内のDNAをヘキストで染色しました。さらに、この組織を小麦胚芽凝集素であるレクチンで染色し、ヒトムチンを染色しました。(B)上皮の絨毛様および陰窩様構造の三次元成長は、zスタックのxおよびyセクションで検出できます。スケールバー = 50 μm。略語:WGA=小麦胚芽凝集素。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:絨毛様の成長がない腸の固定された上皮側。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるスベロイルアニリドヒドロキサミン酸(SAHA)で処理し、細胞増殖を防止する上皮細胞層の代表的な免疫蛍光画像。組織をメタノールで固定した。1 μm切片のzスタックを落射蛍光顕微鏡で取得しました。この Z スタックの直交最大投影が表示されます。(A)核内のDNAをDAPIで染色した。(B)では接着接合部をE-カドヘリンで染色し、(C)ではタイトジャンクションをZO-1で染色します。タイトジャンクションと接着ジャンクションは、オーバーレイ画像(D)に示すように共局在します。スケールバー = 100 μm。略語:DAPI= 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:統合された自然免疫細胞の病原体依存性免疫応答: この図はKadenら8から改変されています。 C. albicans SC5314に非感染(-)または感染(+)した腸内モデルについて、(A)FITC-Dextran(3-5 kDa)の透過性および(B)サイトカイン分泌について分析しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション/メディウム | 組成 | |
| コラーゲンストック溶液 | 0.5 mg/mL コラーゲン IV 液中 0.5 mM 酢酸 | |
| アイソバッファ | PBS -/-、1 mg/mL ウシ血清アルブミン画分V、2 mM EDTA | |
| 単球分化培地 | 造血細胞培地 + 10% ヒト自家血清 + 10 ng/mL 組換えマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) + 10 ng/mL 組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) | |
| トリプシン解離試薬 | 0.25% トリプシン + 1 mM EDTA in PBS -/- | |
| 単球剥離試薬 | 4 mg/mL リドカイン + 5 mM EDTA in PBS -/- | |
| ECコンディショニング媒体 | EC-medium +10% ヒト自家血清 +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF | |
| C2-ミディアム | ||
ディスカッション
提示されたプロトコルは、免疫適格な腸オンチップモデルを生成するために必要な手順を詳述しています。免疫蛍光顕微鏡法、サイトカインおよび代謝物分析、フローサイトメトリー、タンパク質および遺伝子分析、透過性測定などの特定の技術と可能な読み出し方法について説明しました。
記載されたモデルは、初代HUVEC、単球由来マクロファージ、および単球由来樹状細胞で構成され、腸上皮細胞の3D層と共培養され、前に説明したように、粘液分泌、吸収性、腸内分泌性、およびパネート細胞様集団の側面を表す6,14。プロトコルの手順を実行する際には、いくつかの重要な点に留意する必要があります。すべてのステップで、マイクロ流体システム内で気泡の形成を防ぐ必要があります。したがって、バイオチップまたはチューブを取り扱うときは、常にピペットを逆方向に(2回目の停止から容量を取り、最初の停止までのみ分注する)してください。バイオチップ内の細胞に高圧またはせん断力がかかるのを防ぐために、バイオチップでピペッティングするときは、常に静かにピペットで反対側のチャンバーを閉じたままにしてください(たとえば、上部チャンバーで培地を交換するときは、それぞれのプラグで下部チャンバーを閉じます)。バイオチップは、PET膜の両側に細胞を播種することを可能にします。したがって、モデルは、PET膜の下に腸絨毛のような構造を持つか、膜上で上向きに成長するように設定できます。研究の関心に応じて、細胞の一方または他方の配向は、フロー培地に浮遊する循環細胞の重力補助細胞接着など、物理的相互作用の点で特定の利点を有する。
マイクロ流体媒体の流れにより、分極した腸細胞は、陰窩状および絨毛状構造に似た三次元組織を形成し、タイトジャンクションと接着ジャンクション6の密なネットワークによって深部の頂端組織バリアを形成します。さらに、統合された自然免疫細胞は腸のバリア機能を高め、ドナー特異的な免疫応答を含むさまざまな刺激に対するサイトカインおよび免疫細胞の応答を詳細に調べることができます3,6。このモデルは、ヒト腸の微生物共生物(Lactobacillus rhamnosus6など)および病原体(Candida albicans 6,8など)を研究するための生理学的に適切なプラットフォームを提供します。このモデルは、腸内微生物の組成変化と粘膜免疫応答の調節のメカニズムを調査するために活用されました6。本研究では、腸管腔の生理的免疫寛容を再現し、生きた微生物による恒常性定着をサポートする方法を示しました。さらに、プロバイオティクスのラクトバチルス・ラムノサスによるモデルの管腔側の事前コロニー形成は、in vivoの状況と同様に、カンジダ・アルビカンスの組織浸潤を減少させ、その血管コンパートメントへの転座を制限しました。この研究は、in vitroで生理学的に関連性のある条件下で腸の微生物相互作用、免疫応答、および病原性メカニズムを研究するためのモデルの可能性を証明しました。
しかし、このチッププラットフォームには、ヒトの腸を完全に表現できないがん由来の腸細胞の使用や、一次内皮細胞や免疫細胞の使用などの制限があります。低酸素培養条件は、灌流条件下で低酸素インキュベーターでモデルを培養することにより確立でき、ヒト腸の in vivo 状況をよりよく反映できます。
Kim et al.14,15 によって発表された「gut-on-a-chip」モデルなどの他の OoC プラットフォームと比較すると、提示された組織モデルを形成する初期細胞数は約 10 倍高くなっています。これにより、例えば、1つの実験で最大3つの免疫蛍光染色パネルを同時に解析することができます。細胞数の増加により、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット解析、およびサイトカインプロファイリングや乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)測定などの細胞培養上清を必要とするその他の標準的な既製アッセイなどのエンドポイント解析がさらに効率化されます。1つの実験から複数の読み出しを得ることで、全体的なコストと実験時間が削減されます。業界インターフェースとフットプリント(チップの顕微鏡スライド形式、ルアーロック形式のポート、96ウェルマトリックス上に整列)を特徴とする標準化されたバイオチッププラットフォームにより、幅広いメーカーの既製のハードウェアソリューションを利用できます。これには、さまざまな材料と細孔サイズの多くのメンブレンも含まれます。孔径は、細胞増殖と組織完全性16、ならびに細胞遊走に影響を与える可能性がある。
要約すると、このプロトコルは、人間の腸環境の重要な要素を再現する、詳細で適応性の高い腸オンチップモデルを提示します。腸内細菌叢と腸内宿主組織に関する広範な研究を行うためのスケーラブルで効果的なプラットフォームを提供し、特に宿主の免疫応答と腸の病態生理学に焦点を当てています。したがって、このモデルは、従来の in vitro モデルとヒト生物学との間のギャップを埋める能力があり、腸の生物学に関する詳細な研究に不可欠なツールとなっています。
開示事項
M.R.はDynamic42 GmbHのCEOであり、同社の株式を保有しています。A.S.M.はDynamic 42 GmbHの科学顧問であり、同社の株式を保有しています。
謝辞
この作業は、Collaborative Research Center PolyTarget 1278 (プロジェクト番号 316213987) から V.D.W. と A.S.M. A.F. への財政的支援を受けており、A.S.M. はさらに、ドイツのエクセレンス戦略 - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860 に基づくクラスター・オブ・エクセレンス「Balance of the Microverse」による財政的支援を認めています。Astrid Tannert 氏と Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) が共焦点レーザー走査型顕微鏡 ZEISS LSM980 へのアクセスを提供してくださったことに感謝いたします。 図 1C と 図 2 は Biorender.com を使用して作成されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96ウェルプレート ブラック、クリアボトム | サーモフィッシャー | 10000631 | 消耗品 |
| 酢酸 | ロス | 3738.4 | ケミカルズ |
| アレクサフルーア 488 アフィニピュア、ロバ、抗マウス IgG (H+L) | ジャクソン免疫研究 | 715-545-150 | 二次抗体 血管染色および上皮染色 |
| アレクサフロー 647 アフィニピュア、ロバ、抗ウサギ IgG (H+L) | ジャクソンImmuno Research | 711-605-152 | 二次抗体上皮 |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | 二次抗体 血管染色 |
| Axiocam ERc5s カメラ | Zeiss | 426540-9901-000 | 技術機器 |
| 基礎培地 MV、フェノールレッドフリー | プロモセル | C-22225 | 細胞培養消耗品 |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | マイクロ流体消耗品 |
| BSAフラクションV | Gibco | 15260-037 | 細胞培養消耗品 |
| C2BBe1 (Caco-2のクローン) | ATCC | CRL-2102 | 上皮細胞源 |
| クロロホルム | シグマ | C2432 | 化学薬品 |
| CO2インキュベーター | Heracell | 150i | 技術機器 |
| ヒト胎盤由来コラーゲンIV | Sigma-Aldrich | C5533 | 細胞培養消耗品 |
| カバースリップ (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | 消耗品 |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | 二次抗体血管染色 |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | 二次抗体上皮染色 |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | 細胞培養消耗品 |
| DMEM 高グルコース | Gibco | 41965-062 | 細胞培養消耗品 |
| DMEM 高グルコース w/o フェノールレッド | Gibco | 31053028 | 細胞培養消耗品 |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | 細胞培養消耗品 |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | 細胞培養消耗品 |
| EDTA 溶液 | Invitrogen | 15575-038 | 細胞培養消耗品 |
| 内皮細胞増殖培地 | プロモセル | C-22020 | 細胞培養消耗品 |
| 内皮細胞増殖培地サプリメントミックス | プロモセル | C-39225 | 細胞培養消耗品 |
| エタノール96%、未変性 | Nordbrand-Nordhausen | 410 | 化学物質 |
| ウシ胎児 | invitrogen | 10270106 | 細胞培養消耗品 |
| フルオレセインイソチオシアネート (FITC)-デキストラン (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | 化学薬品 |
| 蛍光実装培地 | Dako | S3023 | 化学薬品 |
| ゲンタマイシン (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | 細胞培養消耗品 |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | 細胞培養消耗品 |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | 細胞培養消耗品 |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | 上皮染色 |
| ホロトランスフェリン (5mg/mL) トランスフェリン、ホロ、ヒト血漿 | ミリポア | 616397 | 細胞培養消耗品 |
| ヒト組換え GM-CSF | Peprotech | 300-30 | 細胞培養消耗品 |
| ヒト組換え M-CSF | Peprotech | 300-25 | 細胞培養消耗品 |
| 照明装置 | Zeiss | HXP 120 C | 蛍光顕微鏡セットアップ |
| レーザー走査型顕微鏡 | Zeiss | CLSM980 | 蛍光顕微鏡セットアップ |
| 塩酸リドカイン | Sigma-Aldrich | L5647 | 細胞培養消耗品 |
| リポ多糖(LPS) | Sigma | L2630 | 細胞培養消耗品 |
| ロフテックス ワイプ | ロフテックス | 1250115 | 消耗品 |
| 低アタッチメントチューブ (PS, 5 mL) | ファルコン | 352052 | 消耗品 |
| トップキャップ用ルアーアダプター (M) | Mo Bi Tec | M3003 | マイクロ流体消耗品 |
| オス ミニルアープラグ 4 列、PP、不透明 | マイクロ流体チップショップ | 09-0556-0336-09 | マイクロ流体消耗品 |
| MEM 非必須アミノ酸溶液 | Gibco | 11140 | 細胞培養消耗品 |
| メタノール | Roth | 8388.2 | 化学 |
| 顕微鏡 | Zeiss | Axio Observer 5 | 蛍光顕微鏡セットアップ |
| 顕微鏡スライド | Menzel | MZ-0002 | 消耗品 |
| モノクローナル、マウス、抗ヒト CD68 抗体 (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | 一次抗体 血管染色 |
| モノクローナル、ラット、抗ヒト E-カドヘリン抗体 (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | 一次抗体 上皮染色 |
| Multiskan Go プレートリーダー | サーモフィッシャー | 51119300 | 技術機器 |
| ノーマルロバ血清 | Biozol | LIN-END9010-10 | 化学薬品 |
| 光学セクショニング | Zeiss | ApoTome | 蛍光顕微鏡セットアップ |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 細胞培養消耗品 |
| プラグ | コールパーマー | GZ-45555-56 | マイクロ流体消耗品 |
| ポリクローナル、ヤギ、抗ヒト VE-カドヘリン抗体 | R&D Systems | AF938 | 一次抗体 血管染色 |
| ポリクローナル、ウサギ、抗ヒト フォン・ヴィレブランド因子抗体 | Dako | A0082 | 一次抗体 血管染色 |
| ポリクローナル、ウサギ、抗ヒト ZO-1 抗体 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen | 61-7300 | 一次抗体 上皮染色 |
| 電源顕微鏡 | ZEISS | Eplax Vp232 | 蛍光顕微鏡のセットアップ |
| プリモバート顕微鏡 | ツァイス | 415510-1101-000 | 技術機器 |
| レグロICC蠕動ポンプ | イスマテック | ISM4412 | 技術機器 |
| サハ(ボリノスタット) | シグマ・アルドリッチ | SML0061-25MG | ケミカルズ |
| サポニン | フルーカ | 47036 | ケミカルズ |
| S-モノベット、7.5mL Zゲル | Sarstedt | 01.1602 | 消耗品 |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | 消耗品 |
| ピルビン酸ナトリウム | Gibco | 11360-088 | 細胞培養消耗品 |
| タンク 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | マイクロ流体消耗品 |
| トリパンブルーステイン 0.4% | Invitrogen | T10282 | 細胞培養消耗品 |
| トリプシン | Gibco | 11538876 | 細胞培養消耗品 |
| チューブ | ダイナミック 42 | ST001 | マイクロ流体消耗品 |
| ピンセット (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | 消耗品 |
| 小麦 胚芽凝集素 (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | 上皮染色 |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | 細胞培養消耗品, 造血細胞培地 |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | 消耗品 |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, | Greiner Bio-One | 657 160 | 消耗品 |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
参考文献
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