方法論記事

抗菌薬耐性研究のモデルとしてのマイコバクテリアバイオフィルムの増殖

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DOI：

10.3791/66607

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2024年7月12日

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1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ペリクルバイオフィルムを開発するための堅牢な方法を説明しています。この分析法は、さまざまな培養量に拡張可能であり、さまざまな実験目的に容易に採用できます。この分析法の設計により、いくつかのマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能を定性的または定量的に評価することができます。

要約

多くの細菌は、複雑な自然群集で繁殖し、コミュニケーション、協力、競争など、多細胞性の主要な属性を示しています。細菌の多細胞性挙動の最も一般的な症状は、バイオフィルムの形成であり、多くの場合、病原性に関連しています。バイオフィルムは、抗菌剤に対する避難所を提供し、抗菌薬耐性の出現を促進します。振とうフラスコの液体培養物で細菌を培養する従来の慣行は、自然界での細菌の適切な生理学的成長を表現できず、その結果、その複雑なダイナミクスの理解が制限されます。特に、バイオフィルムに存在する細菌の代謝プロファイルと転写プロファイルは、自然に成長する細胞のプロファイルと非常によく似ています。この並列性は、基礎研究とトランスレーショナル研究の理想的なモデルとしてのバイオフィルムの重要性を強調しています。この記事では、 Mycobacterium smegmatis をモデル生物として利用し、ペリクルバイオフィルムを培養する技術を説明することに焦点を当てています。このアプローチは、さまざまな培養量に適応可能であり、抗菌研究などの多様な実験目的への実装を容易にします。さらに、このメソッドの設計により、わずかな調整でさまざまなマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能力を定性的または定量的に評価できます。

概要

バクテリアは単細胞の実体として生き残ることができます。しかし、ほとんどの生理学的に関連する条件では、彼らはコミュニティの模倣物に組織化されます。バイオフィルムは、自己生成マトリックス1に包まれた凝集細胞によって形成される細菌のコミュニティ組織として広く認識されています。このようなアセンブリは、初期の多細胞性の特徴を持ち、細菌系により高いストレス耐性を提供します。バイオフィルムは抗菌薬に耐性があることが多く、微生物感染の約80%に関与していると推定されています2,3。

シェイクフラスコとプレートベースの培養は、伝統的に細菌培養の通常の方法でした。その大きな受容性と成功は、取り扱いの容易さ、再現性、およびスケーラビリティに起因する可能性があります。しかし、生理学的文脈の欠如は、そのようなシステムを使用して生成された知識の翻訳の可能性を制限します4。したがって、バイオフィルムは細菌の病態生理学を研究するための魅力的なモデルシステムになりつつあります。バイオフィルムは、自然条件を密接に反映した動的モデルシステムを提供し、研究者が栄養勾配や空間的不均一性などの生理学的側面を再現することを可能にします5,6。

バイオフィルムのライフスタイルは、悪名高い 結核菌を含むマイコバクテリアがバイオフィルム形成に長けているため、マイコバクテリアの研究に特に関連しています7。バイオフィルム内で増殖する能力は、感染時の宿主組織での持続性に貢献します。バイオフィルムのライフスタイル8に関連する固有の抗生物質耐性を考えると、マイコバクテリア症の治療において手ごわい課題を提起します。バイオフィルムはまた、複雑な微生物群集内でマイコバクテリアが採用する独自の代謝適応と栄養素利用戦略の調査を可能にするため、マイコバクテリア代謝を研究するための理想的なモデルシステムを提供します9。

バイオフィルムは、マイコバクテリア研究10のより優れたモデルシステムとしてますます受け入れられていますが、特に異なる研究所で実施された研究間の類似性を引き出すためには、一貫性があり再現性のある標準操作手順が必要です。ここで概説する方法は、マイコバクテリア種である M.smegmatisのバイオフィルム形成手順を説明しています。 M. smegmatis は、その非病原性およびより速いバイオフィルム形成速度を考えると、マイコバクテリアバイオフィルムを研究するためのよりアクセスしやすいモデルです。この分析法は、抗マイコバクテリアスクリーニング、代謝物抽出、オミクス研究などのアプリケーションに合わせて変更することができます。

プロトコル

本試験に使用されたすべての試薬および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. Sautonの培地調製

  1. 1.25 gのリン酸二水素カリウムを慎重に秤量し、50 mLの脱イオン水に溶解して、50 mLの2.5%リン酸二水素カリウム溶液を調製します。
  2. 2.56 gの硫酸マグネシウムを秤量し、50 mLの脱イオン水に溶解して、2.5%硫酸マグネシウム溶液50 mLを調製します。.
  3. 0.5 gのクエン酸第二鉄アンモニウムを秤量し、10 mLの脱イオン水に溶解して、10 mLの5%クエン酸第二鉄アンモニウム溶液を調製します。琥珀色のチューブに保管してください。
  4. 20gのブドウ糖を秤量し、100mLの脱イオン水に溶解して、20%ブドウ糖溶液100mLを調製します。チューブ内の50 mL滅菌シリンジと0.2 μM PVDFシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌します。
  5. 0.1 gの硫酸亜鉛を慎重に秤量し、10 mLの脱イオン水に溶解して、滅菌1%硫酸亜鉛溶液10 mLを調製します。10 mLの滅菌シリンジと0.2 μM PVDFシリンジフィルターを層流フードで使用してフィルター滅菌します。
  6. 調製した成分を750 mLの脱イオン水に混合します( 表1を参照)。溶液のpHを測定し、7に調整します。脱イオン水で容量を900mLにします。
  7. 15 PSIおよび121°Cで15〜20分間、培地をオートクレーブします。冷まします。次に、フィルター滅菌した1%硫酸亜鉛100μLを加えます。フィルター滅菌した20%グルコース100mLを加え、よく溶かします。

2. フィルター滅菌した5%Tween-80の調製

  1. 0.5 mLのTween-80を9.5 mLの脱イオン水に溶解します。
  2. 10 mLの滅菌シリンジと0.2 μM PVDFシリンジフィルターを層流フードで使用して、溶液をフィルター滅菌します。

3. 一次培養の準備

  1. 層流フードで、血清学的ピペットを使用して、2 mLのオートクレーブ滅菌LB培地を2つの滅菌14 mL試験管に分注します。
  2. マイクロピペットを使用して、フィルター滅菌した5%Tween-80を20μLを試験管に加えます。
  3. M. smegmatisをチューブの1つに接種し、そのクライオストックを接種ループを使用して追加します。もう一方の試験管は、メディアコントロールとして機能します。
  4. チューブをシェーカーインキュベーターで300rpm、37°Cで48時間インキュベートします。
    注意: メディアコントロールチューブは成長を示さないようにする必要があります。

4. 二次培養の準備

  1. 層流フードで、血清学的ピペットを使用して、2 mLのオートクレーブ滅菌LB培地を2つの滅菌14 mL試験管に分注します。
  2. マイクロピペットを使用して、フィルター滅菌した5%Tween-80を20μLを試験管に加えます。
  3. マイクロピペットを使用して、20 μLの一次培養物をチューブの1つに加えます。もう一方のチューブはメディアコントロールとして保管してください。
  4. 培養物を300rpmおよび37°Cのシェーカーインキュベーターで、OD600 が0.6〜0.8に達するまでインキュベートします。
    注:通常、OD600 が0.6〜0.8に達するには12〜14時間かかります。他の細胞密度も使用できますが、定義されたOD600 値は比較研究に役立ちます。

5. バイオフィルムの設定

  1. 層流フードで、血清学的ピペットを使用して、2%グルコースを補充した6 mLのSauton培地を6ウェルプレートの各ウェルに分注します。
  2. マイクロピペットを使用して、各ウェルに120μL(つまり、2%)の二次接種物を接種します。メディアコントロールとして、1つを接種せずによく保管してください。
  3. 1 mLマイクロピペットでピペッティングして培地と培養物を混合します。蓋をして、プレートをパラフィンフィルムで慎重に密封します。
  4. プレートを静置型インキュベーターで37°Cで7日間インキュベートします。

6. ステージ別観察のためのバイオフィルムの設定

注:全体的なバイオフィルムのセットアップは、手順5で説明したものと同じです。異なる時点でバイオフィルムを採取または画像化するには、同じバイオフィルムを別々のプレートに複数のセットでセットアップすることをお勧めします。

  1. 3日目から6日目までのバイオフィルムを観察するには、同じ条件のプレートを4枚用意し、1日1枚のプレートでイメージングを行います。
    注:バイオフィルム層は、プレートセットアップの3日目から空気と媒体のインターフェースに現れ始めます。

7. バイオフィルムの現像の推定

  1. 視覚的な見積もり
    1. エピ白色光照明を備えたゲルドキュメンテーションシステムを使用してプレートをイメージングします(図1)。
      注:イメージングは、形成されたバイオフィルムの全体的な定性的および定量的な推定値を提供します。代わりに、高品質のカメラを使用できます。
  2. 乾燥重量の推定値
    1. 乾燥重量測定を行い、より正確な定量化を実現します。
    2. 乾燥重量を測定するには、まずあぶらとり紙の重量を量ります。
      注意: 濾紙は、あぶらとり紙の代わりにも使用できます。
    3. 6ウェルプレートからバイオフィルムを抽出し、スパチュラを使用して紙に転写します。
    4. 培養物からバイオフィルムの大部分を慎重に収集し、紙に過剰な量の培地を移さないように注意します。
    5. バイオフィルムをあぶらとり紙の上に置きます。
    6. バイオフィルムが完全に乾くまで、50°Cのインキュベーターに0.5〜1時間置きます。
    7. 紙とバイオフィルムの合計重量を測定します。
      注:バイオフィルムの乾燥重量=(バイオフィルム+紙の重量)-(紙の重量)

8. バイオフィルムにおける抗生物質耐性アッセイ

  1. Sautonの培地11を使用して、Irith Wiegandらによって記述されたプロトコルに従って、M. smegmatisプランクトン培養におけるリファンピシンのMIC90を推定します。培養物がOD600の0.2に達したら、抗生物質を追加します。
  2. プロトコルのステップ5で説明されているように、バイオフィルム成長のためのプレートをセットアップします。
  3. インキュベーションの4日目に、層流フードのマイクロピペットを使用して、ウェルの側面からMIC90濃度(64 μg/mL)の培養物にリファンピシンを加えます。
    注:バイオフィルムをあまり乱さないように、これを慎重に行ってください。バイオフィルムのある井戸の1つを未処理のままにします。
  4. プレートをゆっくりと回転させて抗生物質を混合します。
  5. プレートの側面をパラフィンフィルムで覆い、さらなる成長のためにインキュベーターに保管します。
  6. 24時間後、層流フードからプレートを取り外し、バイオフィルムを含むすべてのウェルでTween-80を最終濃度0.2%まで追加します。
  7. もう一度、プレートをパラフィンフィルムで覆い、4°C、100rpmで12時間保ちます。
  8. プレートを層流フードに取り出し、1mLのマイクロピペットで成分を均質化します。
  9. Anand et al.12に記載されているプロトコルを使用して、Sautonの培地で成分を洗浄します。
  10. 最後に、細胞を6 mLのSauton培地に再懸濁し、最終濃度の10-4、10-5、10-6、および10-7に希釈します。
  11. 各希釈液100 μLを、オートクレーブ処理したガラスビーズを用いてLB寒天プレート上に広げます。
  12. すべてのプレートをパラフィンフィルムで密封し、37°Cのインキュベーターに保管します。
  13. 3日間のインキュベーション後、各プレート上のコロニーを数えます。コロニー数が30〜300のプレートのみを考慮してください。
  14. 提供された式13を使用して、CFU / mLとCFU / mLの相対的な減少を計算します。
    注:CFU/mL = (コロニー数×希釈係数) / (メッキ容量 (mL))
    CFU/mL の相対的減少 = ((未処理の CFU/mL - 治療済みの CFU/mL)) / ((未処理の CFU/mL)) × 100

結果

バイオフィルムペリクルは、3日目以降に肉眼で見えるようになります。バイオフィルムは2%グルコースなしでSautonの培地で成長しますが、添加すると網状化の改善が観察されました。我々は、1.5mLのSauton培地(2%グルコースを添加)を4日間培養した24ウェルプレートの各ウェルから、10.48mg±3.13mg(n = 4)のバイオフィルム乾燥重量を得た。 図2では、バイオフィルムの発達が3日目から6日目まで見られました。3日目にはわずかな網状になって膜を形成し始め、5日目までに完全に成熟します。6日目以降、バイオフィルムは崩壊し始めます。MIC90のリファンピシン(64 μg/mL)は、バイオフィルムのCFUを12%(n = 3)±25%減少させました。

figure-results-1
図1:Sautonの培地での4日間のインキュベーション後の M.smegmatis のバイオフィルム( 1)グルコースを使用せず、2%の接種物を接種。(2)ブドウ糖を含まず、4%の接種物を接種。(3)2%グルコースを使用し、2%接種。(4)2%グルコースを使用し、4%接種。(5)および(6)はメディアコントロールです。ここでは、サンプルは標準の6ウェルプレートに入っています。写真は拡大せずに撮影されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:M. smegmatisのバイオフィルム形態(接種後3日目から6日目まで)ここでは、サンプルは標準の24ウェルプレートに入っています。写真は拡大せずに撮影されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

S. いいえ。コンポーネント作業濃度(w / v)原液濃度原液の体積/重量
1リン酸二水素カリウム0.05%2.50%20ミリリットル
2硫酸マグネシウム0.05%2.50%20ミリリットル
3クエン酸第二鉄アンモニウム0.01%5%1 mLの
4グリセロール6%100%60ミリリットル
5L-アスパラギン0.40%NAの4グラム
6クエン酸0.20%NAの2グラム

表1:Sautonの培地調製用のコンポーネント。

ディスカッション

微生物の多細胞生活様式は、ほぼ1世紀前に報告されました。しかし、臨床研究は依然としてまばらであり、その主な原因は堅牢な方法の欠如です14。バイオフィルム生物学の研究で説明されている方法は、多くの場合、適応が困難です。ここでは、重要なステップのデモンストレーションに支えられた詳細な方法論により、プロトコルの再現性が向上することが期待されます。

この記事で説明するバイオフィルム製造方法はスケーラブルであり、それに比例して培地の量と接種物のサイズを増やす必要があります。代謝物抽出などのアプリケーションでは、より多くの培養量が必要ですが、抗菌剤感受性アッセイでは、より小さなバイオマスが必要です12。さらに、接種物のサイズを調整して、バイオフィルムの形成速度を調整することができます。この柔軟性により、研究者は実験の期間を適切に制御できます。

生育条件と微小環境は、バイオフィルム生理学において重要な役割を果たします15。特に、グルコースの存在はバイオフィルムを形成するために必須ではありません。それにもかかわらず、2%グルコースの包含は、バイオフィルムの網状化および安定性を強化することが観察されている。もう1つの興味深い観察結果は、培養ウェルの底にガラスカバースリップを配置することのバイオフィルム強化の可能性です。Tween-80を初代培養と二次培養の両方で添加することは、細胞凝集を緩和するために重要です。

バイオフィルムの開発には、付着、成熟、分散などの明確な成長段階が含まれます。ここで説明するバイオフィルムのセットアップは通常7日間インキュベートされますが、ペリクルは3日目以降に肉眼で見えるようになります。この設定により、バイオフィルム発生の時間的ダイナミクスを研究することができます。この記事では、バイオフィルムバイオマスを評価するための乾燥重量の推定について説明しますが、このセットアップは、従来のクリスタルバイオレット染色または顕微鏡ベースの推定12,16にも適しています。

マイコバクテリアによるバイオフィルムの産生は、その病原性に重要な役割を果たし、薬物に対する耐性を強化します8,17。バイオフィルム培養では、シェイクフラスコ培養物と比較して、7〜8倍の抗生物質耐性が観察されました。いくつかのグループは、細菌生理学を研究するためのモデルシステムとしてバイオフィルムを使用しています。マイコバクテリア研究コミュニティがこの増殖様式を広く採用することで、この属内のさまざまな病原性の種の病態生理学について新たな知見を得ることができます。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

この研究は、アミテシュ・アナンドに授与されたDBT-Ramalingaswami Fellowshipによって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2 &マイクロ;M PVDF シリンジ フィルターAxivaSFNY04 R
1 mL チップGenetixGXM-611000 C
10 µLチップジェネティックスGXM-6110 C
200 & マイクロ;L tipsGenetixGXM-61200C
6 ウェル ポリプロピレン プレートターソン980010
琥珀色のチューブターソン546051
オートクレーブホスファーマ
バイオセーフティ キャビネット A IIMSET
ブロッティング ペーパー任意の適切なベンダー
遠心分離機エッペンドルフ
クエン酸シグマ251275
キュベットバイオ・ラッド2239955
クエン酸第二鉄アンモニウムシグマF5879
ゲルドキュメンテーションシステムバイオ・ラッド
ガラスビーズシグマG8772
グルコースシグマ49139
グリセロールΣG5516
接種ループGenaxyHS81121C
L-アスパルギンΣA0884
LB寒天HimediaM1151
LBメディアHimediaM575
M. smegmatis mc2155 cryo-stockATCC700084
硫酸マグネシウムシグマM2643
マイクロピペットギルソン
パラフィルムターソン
シャーターソン460020
pHメーターラボマン 科学機器
プレートリーダーテカン
ポリプロピレン 試験管GenaxyGEN-14100-PS
リン酸カリウム 一塩基性SigmaP5379
リファンピシンMedchemExpressHY-B0272
血清ピペットSPL ライフサイエンス95210
シェーカーインキュベーターエッペンドルフ
スパチュラ
分光光度計サーモサイエンティフィック
スタティックインキュベーターキャロン
滅菌済み 10 mL シリンジベクトン ディキンソン309642
滅菌済み 50 mL シリンジベクトン ディキンソン309653
Tween-80シグマP1754
天秤ザルトリウス
硫酸亜鉛シグマZ0251
レ

参考文献

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  16. O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
  17. Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).

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