示差走査蛍光法によるCD40タンパク質-ウンベリフェロン相互作用の検出

サマリー

このプロトコールは、化合物とタンパク質分子との間の結合を検出するための独自の方法を説明しており、タンパク質サンプルの損失を最小限に抑え、高いデータ精度という利点を提供します。

要約

異なる分子間の相互作用の調査は、疾患の病因を理解し、創薬標的をスクリーニングする上で重要な側面です。チベットの薬 Vicatia thibeticaの有効成分であるUmbelliferoneは、未知のメカニズムで免疫調節効果を示します。CD40タンパク質は、免疫応答の重要な標的です。そこで、本研究では、示差走査蛍光技術の原理を用いて、蛍光酵素マーカーを用いてCD40タンパク質とウンベリフェロンとの相互作用を解析します。まず、タンパク質蛍光オレンジ色素の安定性を実験的に検証し、1:500の最適希釈比を決定しました。その結果、CD40タンパク質の温度融解(Tm)値は、濃度の増加に伴って減少する傾向があることが観察されました。興味深いことに、CD40タンパク質とウンベリフェロンとの間の相互作用は、CD40タンパク質の熱安定性を高めることがわかりました。この研究は、蛍光マイクロプレートと蛍光色素を使用して低分子化合物とタンパク質の結合電位を検出する最初の試みです。この技術は、高い感度と精度を特徴とし、タンパク質の安定性、タンパク質構造、およびタンパク質-リガンド相互作用の分野における進歩が期待されているため、さらなる研究と探索が容易になります。

概要

Vicatia thibetica H. Boissieuは、臍帯科の植物で、チベット医学で一般的に使用されており、5つの基本成分(Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute、 Asparagus cochinchinensis (Lour.)Merr、 Vicatia thibetica H. Boissieu、 Oxybaphus himalaicus Edgew.、および Gymnadenia conopsea (L.)R. Br。¹.雲南省北西部、四川省西部、チベットなど、主に中国南西部に分布し、その乾燥根はアンジェリカ¹の地元の代替品として機能します。香りで知られる根はシチューの調味料としてよく利用され、チベットのセロリと呼ばれる葉はおいしい料理に貢献しています。したがって、 Vicatia thibetica は、ユニークな薬用植物としてだけでなく、チベットの食料源としても重要性を持っています。

国内外の研究によると、Vicatia thibeticaは血液を補充し、気(力またはエネルギー)を活性化する特性を持ち、月経の調節に有益です。動悸や血液欠乏による月経困難症の不規則な症状に対処するために用いられ、体免疫の抗酸化調節などの薬理学的効果を示します²。Vicatia thibeticaのアルコール抽出物は、シクロホスファミドによって誘発された免疫不全マウスの体重と臓器指数を回復する能力を示しています。さらに、血清中のスーパーオキシドジスムターゼの活性を高め、マロンジアルデヒドの含有量を減少させることで、抗酸化能力の改善と脂質過酸化に対するバランス効果が示唆されています^2,3。同時に、それは血球とヘモグロビンの数を増加させ、これは体の造血機能を客観的に反映するだけでなく、免疫系にも重要な役割を果たします^2,3。

針状の結晶と苦味を特徴とするUmbelliferoneは、分子量が小さく、揮発性であり、蒸気で蒸留できます。昇華しやすく、水への溶解度が低く、有機物への溶解度が高いです。Vicatia thibeticaの主要な化学成分の1つとして、ウンベリフェロンは、ヒドロコルチゾン誘導^{免疫抑制マウス}モデル^4,5において、細胞性免疫、体液性免疫、および非特異的免疫に対する免疫調節効果を示します。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである細胞表面分子CD40は、免疫細胞に広く発現しています⁶。その相同リガンドであるCD154は、CD40Lとも呼ばれ、活性化Tリンパ球によって発現されるII型膜貫通タンパク質です。CD40の活性化は、樹状細胞(DC)および単球の表面上の共刺激分子の発現をアップレギュレートする能力を持っています。このプロセスは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の抗原提示機能を促進し、CD8+ T細胞をさらに活性化します⁷。

マクロファージは、腫瘍微小環境の形成と調節に重要な役割を果たしており、CD40の活性化は、マクロ^{ファージ8}による腫瘍微小環境のリモデリングを促進することができる。CD40シグナルの活性化は、B細胞の増殖と活性化に大きく影響します。B細胞は、CD40によって活性化されると、有効な抗原提示細胞として機能することができます。それらは抗原を提示し、エフェクターT細胞活性を生成し、それによって抗腫瘍効果に寄与します⁹。さらに、腫瘍細胞におけるCD40の活性化は、アポトーシスを誘導し、腫瘍の成長を阻害することができる¹⁰。CD40は、主に、Lyn、Fyn、Sykなどの非受容体型チロシンタンパク質キナーゼの活性を制御することにより、シグナルを伝達します。さらに、Bcl-xL、Cdk4、およびCdk6タンパク質を刺激し、Rel/NF-kB転写因子を活性化し、CG-2およびPI3K¹⁰をリン酸化する能力があります。

示差走査蛍光法(DSF)は、バッファー組成、温度、低分子リガンドなどのさまざまな環境条件がタンパク質構造の熱安定性に及ぼす影響を評価するために広く使用されています。DSFに一般的に使用される色素は、オレンジ色の環境に敏感な疎水性色素です。通常の条件下では、タンパク質構造は折り畳まれ、その疎水性セグメントを内部に隠します。温度が上昇すると、タンパク質の疎水性領域がより露出し、その結果、天然のタンパク質構造が徐々に分解されます。色素は、この露出したタンパク質部分に選択的に結合し、その蛍光を増幅します。次いで、Tm値は、蛍光シグナル検出¹¹の変化を監視することによって計算される。Tm値の変動は、突然変異、バッファーの変化、またはリガンド結合によるタンパク質の安定性の変化をある程度測定できます。さらに、タンパク質の折り畳み過程における構造変化を示すことができる¹²。このアプローチにより、正確なデータ、広い温度範囲、高感度、最小限のタンパク質サンプル損失が得られます¹³。

本研究では、蛍光定量ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)装置ではなく、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光測定を行いました。この変更により、蛍光定量PCR装置がないラボでもDSF検出が可能になり、分析法の複雑さが軽減され、装置のセットアップに必要なステップが削減されるため、実験プロセスが簡素化されます。ただし、このアプローチにはいくつかの欠点があります。複雑さが軽減される一方で、手順はより面倒になります。異なる温度での手動蛍光検出が必要であり、システムからの蛍光の自動的かつ連続的な収集は達成できません。したがって、この研究では、DSF技術を利用してCD40タンパク質とウンベリフェロンの間の相互作用を調査し、チベット医学の分子メカニズムに関する新たな洞察を提供しました。

プロトコル

化合物溶液、タンパク質溶液、および色素をPBS溶液に導入しました。その後、デジタル加熱振とうドライバスを用いて試料を段階的に加熱し、複合体系内の蛍光強度の変化を測定することでタンパク質の熱安定性を評価しました。詳細な手順を以下に概説し、 図 1 にプロトコルの概要を示します。

1. 溶液の調製

1. 616.75 μL の DMSO 溶液に 0.1 mg のウンベリフェロンを添加して、1 mM のウンベリフェロン溶液を調製します( 材料の表を参照)。
2. 0.1 mg の CD40 を 500 μL の ddH₂O 溶液に加えて、200 μg/mL の CD40 タンパク質溶液を調製します( 「材料の表」を参照)。
3. 500x Orange色素1 μLを9 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、500x Orange色素溶液を調製します( 材料の表を参照)。
   注:上記の操作を氷上で行い、ピペットの最小範囲が0.1μLであるため、最初にオレンジタンパク質色素を10倍に希釈して、その後の使用を容易にします。

2.染料性能試験

1. 500xオレンジ色素をPBS溶液に加え、希釈して色素(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)を実現します。
   注意: DMSOの最終濃度が2%(v / v)を超えないようにしてください。
2. 蛍光マイクロプレートリーダーの電源を入れ、10分間予熱します。
3. コンピュータとデータ集録ソフトウェアを順番に開きます( 資料の表を参照)。
4. [装置]をクリックし、対応する蛍光マイクロプレートモデルを選択し、データ取得ソフトウェアで[OK]を選択します。
   注:蛍光マイクロプレートの予熱が終了し、パネルに温度が表示されるのを待ってから、データ収集ソフトウェアを開いて、装置とソフトウェア間の接続が成功することを確認してください。
5. Acquisition Settingsをクリックし、データ取得ソフトウェアでFluorescenceを選択します。
6. Wavelengthsインターフェイスでプログラムを編集します:Lm1 = 470 nm、570 nm、[OK]を選択します。
   注:オレンジ色の色素は、300 nmのUV光または470 nmの可視光で励起でき、570 nmで発光を測定できます。
7. 異なる濃度のオレンジ色素(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)とPBSを100 μL/ウェルの96ウェルプレートに加えます。
   注:溶液をPBSに添加する前にDMSOに溶解し、調製プロセス中に2000 x g で完全にボルテックスして、染料が沈殿する傾向による完全な溶解を確保します。
8. 96ウェルプレートを装置の検出ステージにセットし、データ取得ソフトウェアの Read ボタンをクリックして、室温で各色素濃度の蛍光を13回、毎回2分間隔で測定します。
9. 各決定後に[エクスポート]ボタンをクリックし、[XML XLS TXTにエクスポート]を選択し、[すべてのプレート]を選択し、[出力形式のプレート]を選択し、最後に[OK]をクリックして、データを「XLS」形式でフォルダに保存し、さらに分析します。
   注:これらのステップは、室温でのオレンジ色素の自家蛍光に対する連続測定の影響を判断し、最適な染色濃度を特定するのに役立ちます。
10. デジタル加熱振とうドライバスをオンにし、加熱温度を35°Cに、加熱時間を2分に設定します。
11. 1.5 mLの微量遠心チューブで最適な希釈比の色素を調製し、デジタル加熱振とうドライバスに2分間入れます。
12. PBS溶液と35°Cで加熱した染色溶液を、ウェルあたり100 μLの容量で96ウェルプレートに加えます。
13. 96ウェルプレートを装置の検出ステージにセットし、データ集録ソフトウェアの Read ボタンをクリックします。
14. 加熱温度を40°Cに、加熱時間を2分に設定します。
15. 96ウェルプレートの色素溶液をピペットで1.5 mL微量遠心チューブに戻し、装置内で2分間加熱します。
16. ステップ2.12-2.15とステップ2.9の操作を繰り返して、それぞれ35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°Cで染料溶液の吸光度をテストします。
    注:これらのステップは、35°Cから95°Cの勾配で連続加熱したオレンジ色の染料の自家蛍光の安定性を決定するのに役立ちます。 急激な温度低下や間違った液体の追加を避けるためには、迅速に作業することが重要です。これは実験エラーにつながる可能性があります。

3. タンパク質の温度融解(Tm)の検出

1. CD40タンパク質とオレンジ色素をPBS溶液と組み合わせ、それぞれ5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、1:500の最終濃度を達成します。
2. ステップ 2.2 から 2.6 とステップ 2.10 から 2.16 で概説した操作を繰り返して、それぞれ 35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、55 °C、60 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 °C、90 °C、95 °C の温度での CD40 タンパク質溶液の吸光度を評価します。
3. 手順 2.9 を繰り返してデータを保存および分析し、その後、データ分析ソフトウェアを使用して Tm 値を計算します ( 資料の表を参照)。
4. CD40タンパク質、ウンベリフェロン、およびオレンジ色素をPBS溶液に添加して、それぞれ5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、10 μM、および1:500の最終濃度を得ます。
   注:溶液調製中の激しいボルテックスは、PBS中の色素、CD40タンパク質、およびウンベリフェロンの均一な分布を確保するために不可欠です。
5. 手順3.2〜3.3の操作を繰り返して、それぞれ35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、および95°Cの温度でCD40-ウンベリフェロン複合体溶液の吸光度を測定します。
   注:これらのステップは、CD40タンパク質およびCD40-ウンベリフェロン複合体のTm値を決定するために実施され、最適なCD40タンパク質のウンベリフェロンへの結合濃度を特定することを目的としていました。

結果

オレンジ色の色素は、室温と高温の両方で、E_x = 470 nmおよびE_m = 570 nmで一貫して安定した蛍光励起を示しました。1:500の最適な希釈比を決定しました(図2A、B)。CD40タンパク質の濃度が15 μg/mL未満の場合、Tm値の検出は困難であることが証明されました(図3A、B)。しかし、15 μg/mL の濃度では、51.82 °C の安定した Tm 値が検出され、CD40 タンパク質濃度の増加に伴って 45.79 °C に減少しました(図 3C、D)。

図3に示すように、CD40タンパク質がウンベリフェロンに結合することがCD40タンパク質のTm値に影響を与えることは明らかです。具体的には、15 μg/mL と 20 μg/mL、10 μM ウンベリフェロンの濃度で CD40 タンパク質の Tm 値は、それぞれ 62.08 °C と 65.27 °C に増加しました。

図1:プロトコルの概要。 CD40タンパク質のウンベリフェロンへの結合能をDSF原理に基づいて蛍光マイクロプレートリーダーで記録するプロセスのフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:オレンジ色素の希釈比のスクリーニングと安定性試験(A)室温で希釈比が異なる色素の蛍光安定性。(B)希釈比が1:500、35-95°Cでの色素の蛍光安定性。 エラーバーは、SEM±n = 4の平均を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、DSFの原理に従ってCD40タンパク質のウンベリフェロンへの結合能を記録した結果プロット。(A-D)Tmプロファイルは、それぞれ5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL CD40タンパク質およびCD40 + 10 μMウンベリフェロンです。エラーバーは、SEM±n = 4の平均を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

DSFは、熱シフトアッセイまたは熱蛍光アッセイとも呼ばれ、プログラムされたゆっくりとした温度上昇中に試験サンプルまたは色素の蛍光シグナルの変化を監視することにより、サンプル中のタンパク質の熱変性プロセスを検出するために使用される技術です。Pantoliano¹⁴によって最初に確立されたDSFは、ハイスループットな方法として機能します。主な手順は、コンピュータ制御の加熱プレート上で温度を上昇させ、長波長紫外線ランプを用いて励起光を発し、電荷結合デバイス相形成カメラを通じて蛍光色素がタンパク質に結合することによる蛍光シグナル強度の変化を捉えることです。

Tm値は、タンパク質の高次構造を特徴付ける重要な指標であり、温度上昇中のタンパク質薬物の変性の半分に対応する温度を表します。Tm値が高いほど、タンパク質変性に必要な温度が高いことを示しており、タンパク質構造がより安定していることを示しています。現在、Tm値を検出するための方法として認識されているのは、1960年代に開始された示差走査熱量測定(DSC)である¹⁵。DSCは、プログラムされた温度制御下で、試験対象物と参照対象物に供給される電力の差を温度の関数として測定し、吸収および放出される熱の量を取得します。これは、熱安定性解析^16,17のゴールドスタンダードとして立っています。

DSFは、DSCよりも3つの利点により広く使用されています:(1)サンプル消費量が少ない:DSCは通常、400μLのサンプル量を必要としますが、DSFは20〜25μLしか必要としません。(2)より大きな濃度範囲:DSCは一般に、有意な変性ピークを得るために0.2〜2 mg / mLのタンパク質濃度を必要としますが、DSFは0.005〜200 mg / mLの範囲のサンプルを分析できます。(3)より高いサンプルスループット:DSCは一度に1つのサンプルしか分析できませんが、DSFは最大96サンプル以上を同時にスキャンできます¹⁸。これらの利点により、DSFは、タンパク質の安定性、タンパク質の構造とコンフォメーション、タンパク質-リガンド相互作用、およびタンパク質安定剤、阻害剤、補因子などの効果の研究に広く利用されています。

DSFとDSCに加えて、他にもいくつかの分子相互作用技術が存在します。表面プラズモン共鳴(SPR)は、2つの媒体の界面で発生する光学現象であり、光子または電子によって誘発される可能性があります。これは、光が光学的に密度の高い媒体から光学的にまばらな媒体に放出されるときの全反射を伴います。表面プラズモン共鳴が発生する角度は、SPR角度として知られています。SPRバイオセンサーは、SPR角度の変化を利用して、分子間相互作用をリアルタイムで監視します^19,20。MicroScale熱泳動(MST)は、結合によって引き起こされる生体分子のサイズ、電荷、および水和層の変化を検出することにより、生体分子の相互作用を分析する技術です。これは、レーザーがオンになる前、オンになる間、およびオンになった後のサンプル内部の赤外線レーザーによって照射される領域の蛍光変化を記録するため、比較的迅速な測定が可能になります²¹。バイオレイヤー干渉法(BLI)は、干渉スペクトルの変位変化を追跡することにより、センサー表面の反応を測定します。BLI実験では、1つの分子を潜水艇センサーの表面に固定化して、それに結合できる別の分子を検出します。結合相互作用は干渉変位を誘発し、この変位変化のリアルタイムモニタリングは結合曲線²²をもたらす。等温滴定型熱量測定(ITC)は、生体分子の結合中に放出または吸収される熱を直接測定することにより、生体分子の相互作用を定量化します。分子相互作用に関する包括的な熱力学的情報を提供します²³。これらの分子間相互作用技術と比較して、DSFは機器、消耗品、および操作技術に対する要件が低くなっています。ほとんどの研究室で化合物とタンパク質の間の相互作用を効率的に検出できます。

DSFテクノロジーの操作手順は比較的簡単です。最初に、白質サンプル、反応バッファー、蛍光色素、および候補リガンドを反応系に結合します。次に、このシステムを蛍光PCR装置に移し、そこで蛍光決定のための加熱および検出条件を設定する^24,25。DSFに最も一般的に使用されるタンパク質色素は、現在オレンジ色素であり、検出装置は典型的には蛍光定量PCR装置²⁶である。しかし、オレンジ色素の励起波長は470nm、発光波長は570nmであるため、市場に出回っているすべての蛍光定量PCR装置が完全に一致するわけではありません。そこで、本研究では、タンパク質-リガンド相互作用を探索するための新たな検出装置として、蛍光マイクロプレートリーダーを採用しています。

このアプローチには、蛍光定量PCR装置を使用したDSFに比べて、主に2つの利点があります。まず、蛍光酵素マーカーの波長範囲をカスタマイズできるため、色素の波長範囲との適合性が高まり、より正確な蛍光検出が保証されます。次に、蛍光定量PCR装置のプログラムは一度開始すると停止できないため、加熱プロセス中の問題のトラブルシューティングが困難になります。対照的に、蛍光マイクロプレートリーダーは、検出プロセス全体を通じてシステム比と検出条件を繰り返し変更することにより、干渉を排除することができます。ただし、DSFに蛍光マイクロプレートリーダーを使用することには、特定の欠点、特に、従来のDSFが通常20〜25μLのサンプルを使用するのに対し、通常は50〜200μLの範囲の比較的大量のサンプルが必要になるという欠点もあります。

本稿では、5-20 μg/mLの濃度範囲内でCD40タンパク質とウンベリフェロンを用いてTmを検出するために、蛍光マイクロプレートリーダーを用いたDSFの検証を行いました。この結果、この分析法の高い特異性と精度が実証され、Tm検出への適合性が確認されました。その後、異なるサンプル濃度でのTm検出結果を比較すると、濃度が増加するにつれてCD40タンパク質のTm値が減少傾向にあることが明らかになり、Tm検出に対する潜在的な濃度効果が示唆されました(図3)。さらに、この研究では、ウンベリフェロンをシステムに添加した後、添加前と比較してCD40タンパク質のTm値の増加を検出しました。これは、ウンベリフェロンがCD40タンパク質に結合する能力を有しており、その結合によりCD40タンパク質の熱安定性が向上することを示しています(図3)。

プロトコールの重要なステップは、ステップ2.7から2.16として特定され、その成功裏の完了は、その後のタンパク質蛍光の検出に直接影響します。要約すると、この研究では、CD40タンパク質とウンベリフェロンを例に、DSF技術の原理に基づく新しいDSF検出法を確立しました。この分析法では、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、タンパク質とリガンド間の結合力を効果的に分析しました。さらに、この技術は、タンパク質の安定性の解析やタンパク質構造の研究に拡張することができ、細胞シグナル伝達経路の研究や疾患の病因の探索におけるDSF技術の応用を深めることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD40タンパク質	MedChemExpress	HY-P75408
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
FlexStation 3 多機能マイクロプレートリーダー	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., Ltd	FlexStation 3
OriginPro 8 software	OriginLab Corporation	v8.0724(B724)
リン酸緩衝生理食塩水 (1x)	Gibco	8120485
SoftMax Pro 7.1	Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., Ltd	SoftMax Pro 7.1
SSYPRO オレンジ染料	Sigma	S5942
Umbelliferone	Shanghai Yuanye Biotechnology Co.	B21854