新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

サマリー

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。

要約

成体マウスから骨髄を分離するためのさまざまな技術が確立されています。しかし、新生児マウスから骨髄を分離することは困難で時間がかかりますが、一部のモデルでは、翻訳的に関連性があり、必要です。このプロトコルは、7〜9日齢の子犬から骨髄細胞を調製するための効率的で簡単な方法を説明しています。その後、これらの細胞をさらに単離したり、目的の特定の細胞タイプに分化させたりすることができます。マクロファージは、炎症や感染に大きな役割を果たす重要な免疫細胞です。発生中、新生児マクロファージは組織のリモデリングに大きく寄与します。さらに、新生児マクロファージの表現型と機能は、成人のマクロファージの表現型と機能とは異なります。このプロトコルはまた、L929馴化培地の存在下での単離された骨髄細胞からの新生児マクロファージの分化を概説しています。分化した新生児マクロファージの表面マーカーをフローサイトメトリー解析を用いて評価した。機能性を実証するために、pH感受性色素標識大 腸菌を用いて食作用効率も試験しました。

概要

骨髄は、自家再生可能でさまざまな細胞系譜に分化できる造血幹細胞集団と間葉系幹細胞集団の両方を囲んでいます。骨髄の造血幹細胞は、骨髄系およびリンパ系^1を生じさせます。間葉系幹細胞は、骨芽細胞(骨)、脂肪細胞(脂肪)、または軟骨細胞(軟骨)を産生します²。これらの細胞は、遺伝子治療^3,4を含む細胞生物学および組織工学の分野で複数の用途があります。骨髄に存在する前駆細胞は、系統特異的な成長因子の存在下で特定の細胞型に分化します。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞の増殖を促進し、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は好中球コロニーの成長を刺激し、トロンボポエチンは血小板の産生を調節するなど、系統特異的な成長因子のいくつかの例として挙げられます⁵。細胞表面抗原標識FACSおよび磁気活性化セルソーティング(MACS)は、特定の骨髄由来細胞タイプの単離および精製のための確立された方法です⁶。

新生児研究は、新生児の死亡原因の解明や早産時の合併症への対処に向けて進んでいますが、直接的な治療法の開発は依然としてアンメットメディカルニーズです。スミスとデイビスは、「小児患者は依然として治療的孤児である」と述べています⁷。新生児の臨床試験で同意を得るには、サンプルが少ないこと、結果の生涯にわたる影響、倫理的問題など、いくつかの課題^{があります8。}したがって、翻訳関連性を達成するために、新生児に特化した in vivo および in vitro 研究モデルに対する高い需要があります。解剖学的レベルと組織レベル、妊娠期間の短さ、および同腹児数の間に類似性があるため、げっ歯類は最も研究されている哺乳類のモデルシステムです。

ここでは、7-9日齢のマウスの子犬から骨髄を分離するための詳細で、非常に実現可能で、再現性のある手順と、マクロファージに分化する能力について説明します。しかし、異なる分化シグナルを用いることで、さまざまな細胞系譜を達成することができます。また、細胞表面マーカーの存在と、骨髄由来マクロファージ(BMDM)に期待される in vitro 食作用の存在も示しています。

プロトコル

すべての手続きは、ウェストバージニア州の動物管理および使用委員会によって承認され、全米研究評議会による実験動物の世話と使用に関するガイドの推奨事項に従って実施されました。この研究では、C57BL/6Jマウスの子マウスを使用しました。使用したすべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 培地の準備

1. 10% FBS、2 mM グルタミン、25 mM HEPES、およびペニシリン(100 U/mL)/ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加した MEM 培地 3 mL を 5 mL の遠心チューブに調製し、氷上に保ちます。
2. 骨髄前駆細胞を液体窒素で保存する必要がある場合は、10%のDMEM、80%のFBS、および10%のDMSOを含む凍結培地を調製します。
3. 完全なDMEMを得るには、10% FBS、2 mMグルタミン、25 mM HEPES、およびペニシリン(100 U/mL)/ストレプトマイシン(100 μg/mL)を添加したDMEMを調製します。
4. マクロファージの分化には、10% FBS、2 mM グルタミン、ペニシリン (100 U/mL)/ストレプトマイシン (100 μg/mL)、および 10% L929 細胞上清 ^9,10,11 を添加した DMEM を調製します。

2. L929細胞上清調製物

1. 液体窒素に保存されたL929細胞を解凍し、5 mLの完全DMEMが入った15 mLの遠心チューブに移します。350 x g で室温で5分間遠心分離します。
2. 細胞を5 mLの完全DMEM培地に再懸濁し、2×10⁵ 細胞の密度でT25組織培養フラスコに播種します。0.4%トリパンブルーを使用した自動セルカウンターで細胞をカウントします。37°Cで5%_CO2 とインキュベートし、70%のコンフルエント度に達するまでインキュベートします。
3. 細胞を剥離するには、まず5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。PBSを吸引し、2.5mLの0.05%トリプシン-EDTAと交換します。
4. 5% CO₂ と共に 37 °C で 5 分間インキュベートし、5 mL の完全 DMEM を添加します。
5. 細胞を回収し、350 x g で室温で5分間遠心分離します。
6. 細胞ペレットを15 mLの完全DMEM培地に再懸濁し、T75フラスコに移します。
7. 細胞が90%のコンフルエント度に達するまで、5%_CO2 で37°Cでインキュベートし、培地を回収し、500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 M-CSFを含む培地を0.45 μmフィルターでろ過し、5 mLアリコートで-80°Cで凍結します。

3.動物の調理

1. バイオセーフティキャビネットの下で、生後7〜9日のC57BL / 6Jマウスの子犬(6匹の子犬)をダムから慎重に分離し、別のケージに入れます。
2. ベルジャーまたはその他の封じ込めチャンバーで、2 mLの獣医用イソフルランにコットンボールを浸します。
3. 子犬をチャンバーに入れ、蓋を閉めます。新生児を約90秒間監視して、新生児が動かなくなり、意識を失うことを確認します。
4. 子犬が意識を取り戻す前に、子犬をすばやく取り除き、鋭利なハサミで(制度的に承認されたプロトコルに従って)首を切り落とします。
   注:新生児は、イソフルラン吸入のみによる安楽死のために十分に深く呼吸しません。
5. 各子犬を取り外した後は、必ず容器の蓋を閉めてください。同じコットンボールを5〜7匹の子犬に使用できます。

4. 新生児骨髄の分離

1. 新生児の体を70%エタノールで滅菌します。
2. 「鉗子と先端の細い手術用ハサミを使用して、
   腹部と後ろ足。後肢の足元に向かって引っ張って皮膚を取り除きます。
3. 鋭利な鉗子を使用して、骨に付着した結合組織と筋肉をこすり落とします。
4. 図1に示すように、脛骨と大腿骨をハサミで切り取り、取り外します。鉗子を使用して、これらの骨を氷上のメディアチューブに入れます。各子犬に対してこのプロセスを繰り返します。
5. 鉗子の助けを借りて、収集チューブ付きの40μmストレーナーに骨を移します。骨を粉砕し、3mLのシリンジプランジャーでストレーナーに押し付けて骨髄を放出します。
6. 細胞懸濁液を350 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
7. 上清を吸引し、赤血球の溶解のための低張溶液である0.2%NaClで穏やかにピペッティングすることにより、細胞を再懸濁します。直ちに等量の1.6%NaClを添加し、溶液を等張性にします。
8. 350 x g で4°Cで5分間遠心分離し、溶解溶液を除去します。
9. すぐに使用するために完全なDMEMに再懸濁するか、培地を凍結して保存し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
   注:本研究では、この方法では、10⁶ 個の骨髄細胞/子×6.55(± 1.44)が得られました(図1E)。
10. 細胞を-80°Cで凍結培地に保存するか、以下に説明するようにすぐに使用してください。
    注:年齢のため、骨は透明で、骨髄を視覚化するのに十分透明です。骨を引っ張るときは、骨にわずかな圧力を加えるだけで骨髄が解放される可能性があるため、注意することが重要です。新生児の骨髄は、成人の骨に見られる無傷の糸ではなく、液体の形をしています。骨髄の採取中に骨髄が逃げてしまうと、骨髄を採取するのが難しくなります。

5. 新生児骨髄由来マクロファージの分化

1. M-CSFの供給源として10%のL929細胞上清(2.5 mL)を含む10 mLの完全DMEM中のT75フラスコあたり2×10⁷ の骨髄細胞を播種します。培養皿を5%_CO2 で37°Cで5日間インキュベートします。分化の3日目に2 mLのL929コンディショニング培地を添加します。
2. 倒立顕微鏡と20倍の倍率のイメージングシステムを使用して、顕微鏡下で細胞を毎日観察します。分化すると、マクロファージは接着性、伸長性、不均一性を示すはずです(図2)。
3. ダウンストリームアッセイのためにマクロファージを回収するには、分化培地を吸引します。
4. 5mLのPBSで細胞を洗浄し、剥離を妨げる非接着性細胞と血清タンパク質を除去します。PBSを吸引します。
5. フラスコに0.05%トリプシン-EDTAを5mL加えて細胞を回収します。培養フラスコを5% CO₂ インキュベーターで37°Cに5分間置き、5 mLのDMEMを加えます。
6. 細胞をピペットで分離し、350 x g で室温で5分間遠心分離します。
7. 細胞ペレットを1 mLの完全DMEMで解離し、トリパンブルーを使用して細胞生存率をカウントして確認します。この方法を使用して単離されたBMDMは、7.05(± 2.52)×10⁵ 細胞/子です(図1E)。
   注:分化の2日目に現れ始める紡錘形の細胞の存在を観察します(図1B、赤い矢印)。メディアの色が黄色に変わり、メディアが消費されたことを示している場合は、差別化の4日目にL929で調整されたメディアをさらに追加します。メディアの完全な交換はお勧めしません。

6. 免疫標識およびフローサイトメトリー解析

1. 100 μL/label Flow cytometry buffer (PBSに2 mM EDTAおよび0.5% Boine Serum Armamineを添加したPBS)で、メーカーの推奨に従って10 μL/10⁷細胞のFcRブロッキング試薬で処理することにより、BMDMの非特異的抗体標識(2x10⁵/label)をブロックします。氷の上に10分間置きます。
   注:細胞は、バルクまたは個々のウェルまたはチューブでブロックできます。後続のすべてのステップは、最終容量100 μLでの個々の細胞マーカー標識あたりの量と容量を示しています。
2. 200 μLのフローサイトメトリーバッファーを加えて細胞を洗浄し、525 x g で室温で7分間遠心分離します。
3. 上清を除去し、U底96ウェルプレートにウェルあたり5×10⁵細胞の密度で細胞を播種します。3,000倍に希釈したFVS780-Live/Dead cell-Counting Dyeと0.625 μLのBV786-CD11b、PE-F4/80、およびAlexaFluor488-CD206を100 μLのフローサイトメトリーバッファーに個別または組み合わせて加えて細胞を染色します12,13,14,15。ホイルで覆われた氷上で細胞を45分間インキュベートします。
4. 100 μLのフローサイトメトリーバッファーを添加し、525 x g で室温で7分間遠心分離して細胞を洗浄します。
5. 上清を吸引し、細胞ペレットを穏やかに渦巻きます。各ウェルに0.4%パラホルムアルデヒド100 μLを加え、4°Cで一晩インキュベートします。
6. 100 μLのフローサイトメトリーバッファーとペレットを添加し、525 x g で室温で7分間遠心分離して細胞を洗浄します。
7. 細胞を400 μLのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターを使用して分析します。

7. 新生児骨髄由来マクロファージの食作用評価のための in vitro アッセイ

1. BMDMをフェノールレッドまたは抗生物質を含まない完全なDMEMに再懸濁し、35mmのクワッド皿に2×10⁵/象限の密度で播種し、容量500μLで35mmのクワッド皿に入れます。
2. 25の感染多重度(MOI)またはその他の所望のMOIで細菌接種物を調製するには、-80°Cで保存された 大腸菌 O1:K1:H7の事前に計算されたストックを取り除きます。
3. 必要な量の細菌を1.7mLの微量遠心チューブに分注します。PBSを総容量1mLまで加えて細菌を洗浄します。細菌を2,000 x g で遠心分離し、室温で5分間ペレット化します。洗浄手順を繰り返します。
4. バクテリアペレットを50 μLのPBSに再懸濁し、緑色蛍光pH感受性色素を最終濃度500 μMまで加えます。これは、中性pHでは蛍光シグナルを持たないpH感受性色素であり、酸性化ファゴソームなどの酸性環境では、食作用の過程で明るく蛍光を発します。
5. 細菌細胞を暗所で20分間インキュベートし、色素の結合を行います。
6. 1mLのPBSで細菌を1000 × g で室温で5分間遠心分離し、4回洗浄します。
7. フェノールレッドを含まない500 μLの完全DMEMに細菌を再懸濁し、BMDM培養物に添加します。
8. BMDMを5% CO₂ インキュベーターで37°Cで4時間インキュベートし、次にリソソームを染色する細胞透過性の赤色蛍光色素200 ngを加えます。
   注:食性細菌は蛍光顕微鏡で可視化できます。

結果

この研究で概説した方法を使用すると、5 匹の C57BL/6 マウスの子犬の同腹仔サイズから 2,500 万から 3,700 万個の骨髄細胞を成功裏に単離できます。この方法は、5〜7匹の子犬の同腹仔サイズで検証されています。私たちの実験での隔離の最低年齢は生後7日です。同腹児のサイズと実験に必要な細胞数が100万未満であることにもよりますが、研究者は生後7日未満のマウスでこのプロトコルを試すことができます。M-CSFの供給源としてL929細胞上清の存在下では、骨髄細胞は5日でマクロファージに分化しました(図2)。分化2日目に紡錘形細胞の形成が観察され(図2B)、細胞のほぼ半数が3日目に紡錘形を示し(図2C)、分化5日目にほとんどの細胞が接着して細長い紡錘体形を形成しました(図2D)。この方法による骨髄由来マクロファージ(BMDM)の収量は、生後7日の5匹の仔から250万〜500万個の細胞でした。

分化したBMDMを表現型的に特徴付けるために、5日間培養した細胞をCD11b、CD206、およびF4/80に対して免疫標識しました。前方/側方散乱光とシングルマーカーゲートスキームは、補足図1で見ることができます。フローサイトメトリー解析の結果、BMDMの76.4%がCD11bとF4/80の両方に陽性であることが示されました(図3A)。F480-CD11b⁺の集団は、CD206陽性の細胞のおおよその数と一致しています(図3B)。後者は一般にM2様マクロファージと一致するマーカーと考えられており、CD206標識の存在量は2倍にも及ぶ可能性がありますが、F4/80標識の割合が高いほど、M-CSFがM1様表現型への分化を促進する能力と一致しています^16,17(図3)。

さらに、分化した新生児BMDMが細菌を食作用させ、機能的手段として酸性化コンパートメントに輸送する能力を評価しました。pH感受性色素で標識された細菌は、食作用を与えられ、酸性化されたコンパートメントに輸送された場合にのみ緑色に蛍光を発するはずです。感染後に、BMDM内で貪食された豊富な緑色蛍光細菌が検出されました(図4A)。緑色の蛍光は、酸性化されたリソソームを示す赤色の蛍光でさらに局在します(図4B、C)。食作用と緑色のpH感受性色素陽性新生児BMDMの出現も、4時間の感染を通じて観察されました(図4Dおよび補足ビデオ)。ここで示す機能活性は、M1様炎症性マクロファージ活性と一致しています。

図1:7日齢のC57BL/6Jマウスの子犬の骨髄の分離 (A)100mm皿に入った7日齢の子犬の後肢骨。(B)皮膚と皮下組織を取り除いた後の生後7日の子犬の後肢。黒い点線は、骨髄抽出のために切断する場所を示しています。(C)新生児の後肢は、骨を粉砕する前に骨髄で処理しました。(D)新生児後肢は、ストレーナーのシリンジプランジャーを使用して骨を粉砕した後、骨を処理しました。(E)3つの独立した実験から得られた骨髄(BM)および骨髄由来マクロファージ細胞の平均±標準誤差数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:7日齢の新生児骨髄細胞からのBMDMの鑑別。 分化の1日目(A)、2日目(B)、3日目(C)、および5日目(D)の骨髄細胞。パネルBの赤い矢印は、分化2日目の紡錘形の接着細胞を示しています。スケールバー:200μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:フローサイトメトリー解析によるマウスマクロファージマーカーの検出。 F4/80とCD11b(A)またはCD206とCD11b(B)の表面抗原の発現を示す分化した新生児骨髄由来マクロファージ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:新生児BMDMによるpH感受性色素標識 大腸菌 の食 作用 (A)感染の4時間後に食作用したpH感受性色素標識(緑) 大腸菌 を示す骨髄由来マクロファージ。(B)酸性化リソソームの染色で標識されたBMDM(赤)。(C)パネル(A)と(B)の合体画像。スケールバー:20μm.(D)位相コントラストで示されたマクロファージ上の緑色蛍光細菌のオーバーレイ。(D)の倍率は(A)と同じです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ。図4パネルAのような新生児BMDMによる緑色蛍光細菌のライブセルイメージングの4時間ビデオ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:BMDMのフローサイトメトリー解析。 (A)BMDMは、最初にFSCとSSCにゲートが付けられ、破片とダブレットが除去されました。F4/80(B)、CD11b(C)、CD206(D)の単回染色を示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

新生児マウスモデルを用いた研究には、多くの課題があります。新生児は、大人に比べてユニークな発達中の免疫システムを持っています⁸。そのため、成体動物モデルから生成されたデータは新生児に適用されると想定すべきではなく、いくつかの公開された研究はこの考えをよく明確にしています^18,19。したがって、新生児特有のモデルと細胞源は、幼少期の免疫応答の複雑さを研究するために必要です。ただし、新生児マウスのサイズ、感度、および繊細な性質により、生物学的サンプルの量が制限され、収集プロセスに時間がかかる場合があります。このプロトコルは、新生児マウスから骨髄を抽出するための簡単で時間効率の良い手順を確立します。

成体のマウスの骨は、針を挿入して骨髄を簡単に洗い流すのに十分な大きさです。逆に、新生児の骨髄に針でアクセスすることは、その大きさと脆弱性のために困難です。一部の研究では、コラゲナーゼII型およびディスパーゼ²⁰による酵素消化が採用されています。ここでは、新生児の骨が柔らかくて小さいため、骨髄を放出するために粉砕方法を採用しました。精製後、関心のある研究用途に応じて、これらの細胞を特定の細胞型に分化させることができます。

新生児は、明確な表現型マクロファージ集団を示します²¹。本研究では、酵素を使わずに7-9日目の老齢児の骨髄細胞からのBMDMの分化を解明した。この方法論に含まれる重要なステップには、新生児マウスの子犬の全体的な繊細な性質、骨髄の放出を許さない方法での小さな骨の収集、はさみカットを行うための脛骨と大腿骨の適切な場所の特定が含まれます。新生児のBMDMは、成人のBMDMよりも培養において感度が高く、新生児からの骨髄の分離期間が長いため、その分化能力が妨げられることが観察されました。したがって、一度に7匹以上の子犬から抽出することは推奨されません。さらに、分化の2日目にBMDM分化培地を添加したことも、分化不良や生存率の低下などの不良な結果をもたらしました。

このプロトコルは、骨髄細胞をマクロファージに分化するためのM-CSFの供給源としてL929細胞上清を使用しました。L929細胞は、M-CSF10を大量に産生することが知られているマウス線維芽細胞です。マクロファージは、M-CSFとともにL929上清に分泌される他の物質に曝露されることが予想されます。市販の精製M-CSFは、マクロファージの分化にも使用できます。ただし、L929培養上清の使用と直接比較したことはありません。L de Brito Monteiroらは、L929を用いて産生されたマクロファージと市販のM−CSF²²を用いて産生されたマクロファージとの間に明確な代謝プロファイルを観察したことに注意することも重要である。

この方法は、消化酵素を使用せずに時間を節約し、経済的なアプローチを確立しました。この技術により、新生児の骨髄の信頼性の高い単離が得られ、新生児のBMDMの明確な分化がもたらされました。単離された新生児のBMDMは、さまざまな感染時の新生児マクロファージの動態とこれらの細胞による炎症の調節をさらに研究するために使用することができます。この方法の限界には、小さな骨の引っ張りプロセスに対する初期確立と適応のための学習曲線が含まれ、最終的には経験とともに改善され、細胞の生存率が向上してプロセスの期間が最小限に抑えられます。仔の同腹児のサイズは、実験の必要性に応じて区別できるマクロファージの数に関する追加の考慮事項です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
40 &マイクロ;m strainer	Greiner	542040	細胞培養
96 ウェル ラウンド (U) 底板	Thermo Scientific	12-565-65	細胞培養
抗マウス CD11b-BV786	BD Biosciences		740861 FACS 分析
抗マウス CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS 分析
抗マウス F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS分析
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	自動セルカウンター
DMEM	Hyclone	SH30022.01	細胞培養
DMSO	VWR	WN182	細胞培養
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	細胞培養
大腸菌 O1:K1:H7	ATCC	11775	感染
エヴォスFL	Invitrogen	12-563-649	セルイメージングシステム
FBS	アバントー	76419-584	細胞培養
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	色素フリー培地
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	細胞培養
HEPES	Cytiva	SH30237.01	細胞培養
L-929	ATCC		分化
LSRFortessa	Becton Dickinson		フローサイトメーター
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	蛍光色素
MEM	Corning	15-010-CV	細胞培養
ペニシリン/ストレプトマイシン	Hyclone	SV30010	細胞培養
pHrodo green STP エステル	Invitrogen	P35369	蛍光色素
T75 フラスコ	Cell star	658170	細胞培養
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	細胞培養
Zeiss 710	ツァイス	P20GM103434	コンフォーカル