方法論記事

天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド

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DOI:

10.3791/66620

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2024年3月8日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

この記事について

サマリー

トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。

要約

今日利用されている多くの薬品は合成由来ですが、天然物は依然として新しい化学的多様性と生物活性の豊富な供給源を提供し、耐性のある病気や新興の病気の有望な手がかりを生み出すことができます。しかし、研究者は天然物を見つけてその構造を解明するだけでなく、分離して分析する価値のあるもの(およびすでに知られているもの、つまり複製除去として知られるプロセス)を特定する必要があります。最新の分析機器の出現により、天然物の発見とデレプリケーションのペースは加速しています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)は、化学構造の同定と分類に特に有用な手法となっています。トロパンアルカロイド(TA)は、薬効上および毒物学的に重要な植物由来の化合物です。この研究では、トリプル四重極(QQQ)質量分析計で利用可能な複数のMS/MS構成を利用して、TA構造の明確なフラグメンテーションパターンに基づいてアノテーションおよび分類するLC-MS/MSベースのスクリーニングワークフローを開発しました。データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン(PrIS)、およびニュートラルロススキャン(NLS)を組み合わせて使用することにより、この方法をナイトシェードである チョウセンアサガオストラモニウム およびチョウセンアサガオ メテル のTAリッチ抽出物に適用しました。この方法は迅速で感度が高く、複雑なTA含有サンプルの予備的な再現性の除去と、単離、精製(および最終的にはバイオアッセイ)の新規候補の発見の両方に採用されました。

概要

ここ数十年で創薬において完全合成分子が目立つようになりましたが、過去39年間に承認された医薬品の3分の2近くが天然物または天然物に触発されたものであり1,2 、天然物研究の継続的な重要性を強調しています。アルカロイドは、特定の窒素含有天然物であり、その薬効成分で特に高く評価されています。[3.2.1.]-二環式窒素含有システムは、主にナス科(ナイトシェード)、エリスロキシラ科、およびコンボルブラ科の植物によって生産されます。例としては、アトロピン、スコポラミン、コカインなどがあります。複数の半合成または合成トロパンも臨床的に使用されています3。TAとその誘導体は、多くの疾患の治療に使用されており3,4、これらの薬剤のいくつかは、WHOの2023年必須医薬品リスト5に掲載されています。TAはその強力な活性のために、娯楽としても(覚醒剤またはせん妄剤として)使用され、それらを含む植物(または調剤)を摂取すると中毒を引き起こす可能性があります6,7。TAは、人間および動物の食品8には好ましくなく、お茶、香辛料、穀物、蜂蜜、およびハーブサプリメント9,10を汚染する可能性があります。その薬効と毒殺能力の両方から、新しいTAの発見(および既知のTAの同定)に役立つ分析法が有用です。

タンデム質量分析(MS/MS)では、「質量フィルター」(四重極、飛行時間型チューブなど)を物理的に結合するか(「空間内」)、または装置が追加の「インタイム」反応/分離ステップを使用します。インスペースMS/MSは、さまざまなモードを使用して、異なる質量フィルター(トリプル四重極やQQQ装置の四重極など)でさまざまなイオンを選択し、フラグメンテーションします。これらの異なるモードを使用して、特定のイオンによってどの特定のフラグメントが作られるか(プロダクトイオンスキャン)、サンプル中のどのイオンが特定のフラグメントを生成するか(プリカーサーイオンスキャンまたはPrIS)、または特性質量の損失を受けるか(ニュートラルロススキャンまたはNLS)、またはどの特定の化合物がどの特定のフラグメントを持っているか(マルチプルリアクションモニタリング)を決定できます。したがって、MS/MSは、新しい化合物の構造を提案したり、既存の化合物の存在を確認したりするのに役立つフラグメントを提供します。MS/MSは、創薬、天然物化学、およびメタボロミクスの分野でますます使用されており11,12、アルカロイド含有種のプロファイリング(植物化学的特性評価または化学分類学的分析用)や、食品または薬用植物の特定のアルカロイドの検出および定量10,13,14,15,16に使用されています。

多くの質量分析技術が利用可能であるにもかかわらず、新しいアルカロイドの探索には課題があります。スクリーニングする候補生物を見つけることに加えて、アルカロイドの完全な構造確認は、多くの異なる分析技術を含む困難なプロセスです。さらに、研究者はすでに知られている化合物を分離し、労力、時間、リソースを浪費する可能性があります。これは、数千とは言わないまでも数百のTAが報告されており、その多くが互いに異性体であるTAにとっては特に困難です。「既知のものを特定し、未知のものと区別する」プロセスは、レプリケーション解除として知られています。このプロセスを支援するために、さまざまなTAや他の化合物の保持時間(r.t.s)と質量断片のデータベースが公開されています17,18。それにもかかわらず、レプリケーション解除は面倒です。サンプル全体のLC-MS/MSクロマトグラム中のアルカロイドにアノテーションを付ける(つまり、推定構造を割り当てる)だけでは時間がかかります。最近、分子ネットワーク1 9,20および手動脱複製18,21,22の両方がベンジルイソキノリン、モノテルペンインドール、およびトロパンアルカロイドに使用され、PrISはピロリジジンおよびソラニン型アルカロイド23,24を同定するためのスペクトルの「構造フィルタリング」に使用されている.しかし、TAは共通の、容易に識別できるフラグメントを持っているにもかかわらず、TA含有サンプルの迅速なLC-MS/MSベースの重複除去に利用できる特定の方法やワークフローはありません(図1)。ここで説明する方法では、データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、PrIS、NLSを組み合わせて、モノ置換、ジ置換、および三置換トロパンの明確なフラグメンテーションパターン(図1A)と、これらのアルカロイドに見られる一般的なエステル基の損失(図1B)の両方に基づいて、植物のTA構造をアノテーションおよび分類します。研究生物は、ナイトシェード属のチョウセンアサガオのいくつかの種です。多様なTAの豊富な供給源であるチョウセンアサガオは、世界の歴史を通じて医療および文化的な目的で使用されており17、構造的に類似したTAが多数あるため、複製解除が困難なマトリックスであり、私たちの方法をテストするための魅力的なサンプルを提供してくれます。

プロトコル

注意: 記載されている化学物質を使用する前に、関連するすべての製品安全データシート(MSDS)を参照してください。

1. サンプル調製

注意: 液体窒素は、極低温火傷を引き起こす可能性があります。クライオジェングローブと目の保護具は、換気の良い場所で使用してください。アルカロイド含有植物サンプルは、皮膚に刺激を与える可能性があります。常に手袋をはめて取り扱ってください。メタノールは有毒で可燃性であり、潜在的な発火源から離れたドラフト内で取り扱う必要があります。

注:理論的には、栽培または野生植物組織を使用できます(乾燥または挽きたての植物)。以下の手順は、メソッド開発中に利用される手順です。

  1. 目的の植物組織が新鮮な場合は、ポリプロピレン製の円錐形のチューブに入れ、液体窒素に2〜3分間浸して凍結します。
  2. 凍結した植物組織を事前に冷却した乳鉢(液体窒素を入れたポリスチレンクーラー)に入れ、事前に冷却した乳棒を使用して、組織を均一な粉末に粉砕します。
  3. 予め冷却したスパチュラを使用して、風袋引きポリプロピレンマイクロ遠心チューブに所望の量の組織を迅速に秤量し、直ちに組織100 mgあたり1 mLの濃度で20%メタノール(室温[RT])を加えます。
    注:メタノール(20%)は、TAの抽出に一般的に使用されます25。時折、0.1%ギ酸が添加されますが、この方法や他の方法の開発中に抽出効率に違いは観察されませんでした。
  4. キャップ付きチューブをロッキングシェーカー(中速)にRTで最低3時間置きます。
  5. チューブを9464 x g で10分間遠心分離します。上清をピペットで取り除き、LC-MSオートサンプラーバイアルに入れるか、まだ曇っている場合は、まず0.45 μmシリンジフィルターでろ過します。
    注:プロトコールはここで一時停止できますが、処理された新鮮な植物サンプルと抽出物は、潜在的なアルカロイド分解を避けるために、分析前に-80°Cの冷凍庫に保存する必要があります。

2. LC-MS装置の設定とデータ収集

注意:アセトニトリルは有毒で可燃性です。発火源から遠ざけ、ヒュームフードを使用して蒸気を制御します。ギ酸は腐食性です。皮膚や目に入ったものを避け、適切な個人用保護具を着用してください。

  1. エレクトロスプレーイオン化(ESI)ソースと逆相HPLCカラム(C18、4.6 × 100 mm)を備えたLC-MS装置を使用してください。
  2. HPLCの場合、溶媒AとしてH2O中の0.1%ギ酸を使用し、溶媒Bとしてアセトニトリル中の0.1%ギ酸を使用します。カラムを 99% A と 1% B で平衡化し、1% から 50% B のグラジエントを 26 分間で 30 分間設定し、26.01 分で 1% B に戻り、1% B で 4 分間保持します。温度45°C、流速0.5mL/minのカラムオーブンを使用してください。
  3. LC-MS 分析法では、界面電圧:4.0 kV、ネブライジングガス流量:3 L/min、加熱ガス流量:10 L/min、DL 温度:250 °C、ヒートブロック温度:400 °C、界面温度:300 °C、乾燥ガス流量:10 L/min、衝突誘起解離(CID)ガス(アルゴン)圧力 17 kPa の質量分析計の操作パラメータを使用します。
  4. Q3 スキャンと Q1 スキャン(100-1000 Da)の両方を含む ESI ポジティブモードで MS メソッドを作製し、サーベイイベント(LC メソッドの長さに設定)として機能し、自動同位体排除を有効にします。Q1スキャン(DD分析)の従属イベントとして、質量ウィンドウが50〜1000 Da、コリジョンセルエネルギーが-20 V、イベント時間が<0.2秒のプロダクトイオンスキャンを含めます。
    注:Q1 の DD プロダクトイオンスキャンをトリガーするためのカウントしきい値は可変ですが、通常は 7,000 〜 10,000 カウントのレベルが使用されます。この分析法の開発に使用された装置など、一部の装置では、Q3 スキャンは Q1 よりも高い質量精度と感度を提供し、Q1 スキャンで観察されたイオンを確認するために含まれていますが、ステップ 2.4 からは問題なく省略できます。
  5. 上記のMS法に、LC法の長さに等しいポジティブモードPrISを、コリジョンセルエネルギーが-20 V、イベント時間が0.75秒の場合に追加します。いずれの場合も、自動同位体除外または脱同位体機能が有効になっていることを確認してください。TA フラグメント (Da、図 1A を参照) の対象となる m/z 値が 124.1 (モノリサム TA の場合、マスウィンドウ 125-1000 Da)、122.1 および 140.1 (二置換 TA の場合、それぞれ 123 および 141 Da から始まるマスウィンドウ)、156.1 および 138.1 (三置換 TA の場合、157 および 139 Da から始まるマスウィンドウ) であることを確認してください。 それぞれ)。
    注:分析法開発中、PrISは、単置換TAと二置換TA用、および三置換TA用の2つの異なる分析法に分割されましたが、これらは任意の方法で分割または組み合わせることができます。
  6. ステップ 2.4 のパラメーターを含む 2 つ目の MS メソッドを作成します。
    1. この MS/MS メソッドに、LC メソッドの長さに等しいポジティブモード NLS を追加し、コリジョンセルエネルギーを -20 V で、イベント時間を 0.75 秒にします。いずれの場合も、 自動同位体除外 または 脱同位機能 が有効になっていることを確認してください。
    2. TA上のエステル(Da、 図1Bを参照)の関心中性損失質量が100.05(チグリ酸由来のエステルの場合、質量ウィンドウが110-1000 Da)、60.03(アセチル基の場合、質量ウィンドウが100-1000 Da)、および166.06(フェニル乳酸または熱帯酸エステル、質量ウィンドウが170-1000 Da)であることを確認してください。
  7. LC-MS メソッドをダウンロードし、目的のサンプルのデータファイルを作成します。HPLCカラムを45°Cで平衡化したら、異なる種または組織タイプ間で適切な抽出溶媒ブランクを使用して、目的のサンプルをバッチファイルまたはプロジェクトファイルで分析します。一般的な注入量は10〜20μLです。
    注:特に大量の質量では、質量分析計検出器が飽和状態になる場合があります。非常に高濃度のサンプルを分析する場合は、ESIソースが洗浄され、装置が定期的にチューニングされていることを確認してください。ここでプロトコルは、すべてのデータが収集された後に一時停止できます。

3. データ分析

  1. Q1 スキャンと Q3 スキャン(および DD プロダクトイオンスキャン)の全イオンクロマトグラムを調べ、TA のような特徴を持つ存在量豊富なイオンの親質量(a)質量<[M+H]+ イオンの場合は 500 Da、通常は偶数質量、b)上記の LC 分析法を使用した 2 〜 22 分間の典型的な r.t.s、c)次のリストのフラグメントを確認します。 m/z 93、124、142、140、122、138、156、174、110、または128 Da。
  2. m/z 124 の PrIS クロマトグラム/チャンネルを調べ、r.t.s(ステップ 3.1 で記録)がこのフラグメントを生成するピーク/イオンを確認します。クロマトグラムをスキャンごとにクリックし、DDプロダクトイオンスキャンで得られたMS/MSスペクトル全体(特に存在量の少ない分子種)を調べます。
    注:このフラグメントを含む真の種は、複数のスキャンに存在し、Q1 スキャンと Q3 スキャンの両方に表示されます (後者が使用されている場合)。補足情報(補足ファイル1)には、注釈を補助するスプレッドシートが添付されています。
  3. 他のPrISクロマトグラムについても、ステップ3.2を繰り返します。 m/z 122 と 140 はどちらも二置換 TA を示し、 m/z 138 と 156 はどちらも三置換 TA を示しているため、これらのクロマトグラム/チャンネルを一緒に調べてください。
  4. m/z 100、60、および 166 の NLS クロマトグラム/チャンネルを調べ、r.t.s(ステップ 3.1 で記録)がこれらの中性損失を生成するピーク/イオンを確認します。PrISと同様に、クロマトグラムをスキャンごとにクリックし、特に存在量の少ない分子種について、DDプロダクトイオンスキャンで得られたフラグメンテーションと比較します。
  5. DDプロダクトイオンスキャン結果によって裏付けられたPrISデータとNLSデータの組み合わせを使用して、最小のトロパン質量(124、122、138など)と中性損失を加算し、残りの残りの質量を考慮することにより、観察されたアルカロイドの推定アノテーションを作成します。
    注:TAを置換する典型的な基(およびDa中のそれらの質量)は、ヒドロキシル(18)、アセチル(60)、プロピオニル(74)、イソブチリル(88)、チグロイル(100)、飽和チグロイル/2-メチルブチリル(102)、またはフェニル乳酸/熱帯酸(166)です。
  6. アルカロイドのアノテーションを文献17 およびデータベース(MoNAなど)26 で報告されているものと比較し、報告されているTA置換パターン(および新規性がある可能性のあるパターン)を決定します。さらに、確認のために市販されているいくつかの一般的なトロパンアルカロイド(アトロピン、リトリン、スコポラミンなど)の標準物質を使用してください。
  7. 低存在量のサンプル(PrISおよびNLSは従属イベント閾値を下回るイオンを拾う可能性があります)の追加の構造情報については、より濃縮されたサンプルで特定のプロダクトイオンスキャン(対象質量をプリカーサーイオンとして利用)を収集します。
    注:この方法は、低分解能のQQQ機器で開発されました。すべての推定される新しい化合物について、高分解能MS装置を使用して正確な質量スペクトルを取得する必要があります。

結果

この分析法の有効性を実証するために、TAの標準混合物(アセチルトロピン/アセチルシュードトロピン混合物[一置換]各10 μg/mL、2つのアニソダミン異性体[二置換]の混合物各10 μg/mL、ヒヨスチアミン[一置換]、リトリン[一置換]、スコポラミン[三代替])をポジティブコントロールとして分析しました(図2)。図2AにフルQ1スキャンクロマトグラム(ベースピーククロマトグラムビューに表示)が示され、TA標準構造は対応するピークで示されています。m/z 124 の PrIS (図 2B)は、モノ置換された TA のクロマトグラムにピークを示します。エルゴ、アセチルトロピン/シュードトロピンミックス、ヒヨスチアミン、およびリットリンが表示されます。m/z 124 クロマトグラムのアセチルトロピンおよびシュードトロピンに対応するピークは小さいです(おそらく、これらの標準試料が他の標準試料よりも濃度が低く、他のモノ置換 TA よりも存在量が少ない m/z 124 フラグメントを生成する可能性があるため)。それにもかかわらず、このクロマトグラムと対応するPrISチャネルの両方で検出可能です。図 2C と図 2D は、それぞれ m/z 122 と 140 の PrIS クロマトグラムです。二置換されたTAフラグメントを検出すると、両者ともアニソダミンの2つの異性体にフラグを立て、m/z 140チャネルでより強いシグナルが見えます。異なるTAは異なる強度のフラグメントを持っている可能性があるため、m/z 122チャネルと140チャネルを一緒に調べる必要があります。最後に、m/z 156(図 2E)および m/z 138(図 2F)チャネルは、三置換 TA の診断用であり、どちらもスコポラミン(標準ミックスで唯一の三置換 TA)の 1 つのピークを示します。

次に、NLSクロマトグラムを使用して、存在するエステル基を割り当てました。 図 2G は、60 Da の NLS クロマトグラム(アセテートエステルからの酢酸の損失)を示しています。2 つのアセチル化モノ置換 TA 異性体が見えます。166 DaのNLSクロマトグラム(図2I)は、フェニルラキシーエステルまたはトロピックエステルを同定するためのもので、これらの基(ヒヨスチアミン、リットリン、2つのアニソダミン異性体、スコポラミン)のいずれかを含むすべてのアルカロイドを正しく同定します。最後に、予測されたように、100 Daの損失(チグロイルエステルの診断)のクロマトグラム(図2H)は、r.t. 1.75 minでのわずかな不純物を除いて空白です。これは、標準的なアルカロイドのいずれにもこの基が含まれていないためです。

その後、このメソッドで偽陽性がないかテストしました。トマト(Solanum lycopersicum)の葉の水/メタノール抽出物は、ネガティブコントロールとして機能しました。ナイトシェードであるにもかかわらず、トマトはTAを生成しません。完全な Q1 スキャンベースピーククロマトグラムを 図 3A に示します。 m/z 124(図3B)のPrISはほとんど空白で、検出器のノイズである可能性が高い小さなベースライン変動があります(Q1またはQ3スキャンでこれらの質量に一致する信号はありませんでした)。r.t.s が 2.6 分と 3.4 分の 2 つの特徴から 124 フラグメントが得られますが、DD プロダクトイオンスキャンの検査では、これらの特徴は他のモノ置換トロパンフラグメント (m/z 93 または 142) を生成しないことが明らかになり、TA ではないことが示唆されます。この例では、このメソッドにDDプロダクトイオンスキャンを含めることで、誤検出を除外することの有用性も強調しています。同様に、置換されたTAの m/z 122チャネル(図3C)もノイズを示しています。 m/z 140、 m/z 138、 m/z 156 の PrIS クロマトグラムと、DD スキャンで非 TA 特徴のみを示唆する 3 つの NLS を 補足図 1A-F に示します。

TA含有サンプルの複製除去におけるこの方法の使用を実証するために、D. metel var. 'fastuosa'根の抽出物を分析しました。この根は、ナイトシェードにおけるTA生合成の主要な部位であり、多くの多様なTAが存在すると予測されました。完全な Q1 スキャンクロマトグラムを図 4A に示します。予想通り、m/z 124(図4B)、m/z 122(図4C)、m/z 140(図4D)、m/z 156(図4E)、およびm/z 138(図4F)のPrISでは、存在量が異なる多数の特徴が検出されました。これらの TA の多くは、アセチル化またはチグロイル化されていたり、フェニルルアクト酸/トロピック酸に由来したりすることも、それぞれ図 4G-I の NLS クロマトグラムの多数のシグナルで示されています。

スプレッドシートは.xlsファイルとして提供され(読者が使用するための空のシートは 補足ファイル1、 D.metel rootは 補足ファイル2にあります)、最初にどの特徴(質量またはr.t.s)がTAのように見えたかを文書化しました（ステップ3.1の基準を使用)。次に、これらの特徴に属する断片と中立損失が注目されました。この分析法は非常に感度が高く、PrIS チャネルは、対応するクロマトグラムで目に見えるピークをもたらさなかった微量 TA でも容易に検出できます。フラグメントと中性損失を使用して、ステップ3.5に従うことにより、アルカロイドの構造を提案できます。

スペクトルデータを使用してアルカロイドに注釈を付ける例を 図5に示します。 D. metel root の完全な Q1 スキャンクロマトグラムを 図 5A に示します。14.4 分の特徴が選択されました。Q1 スキャンスペクトル(図 5B)は、このピークの親質量が m/z 224 であることを示しています。DDプロダクトのイオンスキャンスペクトルを 図5Cに示します。 m/z 124 の PrIS チャネル(図 5D)は、224 イオンがこのフラグメントを生成することを示しています(DD プロダクトイオンスキャンでも確認できます)。100 DaのNLSチャネル(tigloylated TAsの検出用)も m/z 224のフラグを示します(DD生成物イオンスキャンでも確認)。中性損失と最小質量のTAフラグメント(100 + 124 Da)を合計すると、親質量の224に等しくなり、チグロイル基が唯一の置換であることが確認されます。このアルカロイドの可能性のある構造を 図5Cに示します。二置換および三置換TAの場合、観測された中性損失質量を最小のTA質量に加え、その後、残りの質量を説明するために別の置換が提案されました:例えば、 m/z 222は、140および122の二置換TAフラグメントと100Daの中性損失を持ち、残りの質量は100(222-122 = 100)です。 おそらく2番目のTigloylグループになるでしょう。このワークフローは、直感的に除去のプロセスに使用することができます:トロパンフラグメントを欠く特徴(たとえ60、100、または166 Daを失う可能性があるとしても)は、TAである可能性は低いです。このワークフローを使用した徹底的かつ迅速な重複排除の例では、複数の異性体化合物を含む、存在量と極性の異なる 71 の異なる TA が D. metel root で同定されました (補足ファイル 2)。これらの化合物の中には、容易に割り当てることができないエステル基を持つものや、TA候補としてフラグが立てられたものの、高い信頼性でアノテーションできなかった化合物もありました。

粉砕されたD.ストラモニウム種子のメタノール/水抽出物も分析しました。D. metel root の完全な Q1 スキャンベースピーククロマトグラムを図 6A に示します。m/z 124のPrISを図6Bに、m/z 122のPrISを図6Cに示します。その他のクロマトグラムを補足図2A-Fに示します。図6Bは、r.t. = 12.6分で非常に豊富なモノ置換トロパンアルカロイド、おそらくヒヨスチアミンを示しています。シード TA アノテーションを示すスプレッドシートは、補足ファイル 3 に含まれています。この特定のサンプルでは、分析法の性能は低下しているように見えました:r.t.s が 8.5 分と 10.2 分で m/z が 259 の 2 つの非常に豊富な特徴から、NLS クロマトグラムで 60 Da と 100 Da のピークが得られました(補足図 2 D、E)、質量は m/z 260(M+1 同位体)で、対応するスペクトルで示されました。これらの化合物はTAではなく、β-カルボリンアルカロイド27と一致するフラグメントを形成した。アセチル化またはチグロイル化されていませんが、M+1同位体から60または100を失うため、これら2つのNLSチャネルに現れるのは不正確です。さらに、スコポラミン(r.t. = 10.5 分)は、スコポラミンの予想される m/z 121 フラグメントの同位体である m/z 305 M+1 同位体ピークから m/z 122 フラグメントを生成しました。これらの方法では脱同位体機能が採用されていますが、これらの高サンプル濃度では、同位体の「漏れ」が発生する可能性があります。これは、この研究またはこのサンプルで使用された機器に固有の事象である可能性がありますが、注目に値します。

この方法を用いて、40個のTAをD. stramonium種子にアノテーションし、その中にはグリコシル化されていると思われるものもいくつか含まれており、162(ヘキソース)、146(デオキシヘキソース)、または132Da(キシロースまたは類似の糖)の質量が失われました。ヘキソース含有TAはMerremia(Convolvulaceae)28、Duboisia29、およびAtropa25で報告されていますが、これはデオキシヘキソースまたはキシロース含有TAの最初の報告です。1つのTAのr.t.は13.8分(図7A)、質量はm/z 436(図7BのQ1スキャン)でした。この特徴は、モノリペンテッドTAを示すm/z 124チャンネルで信号を生成しましたが(図7D)、他のPrISまたはNLSチャネルでは信号を生成しませんでした。DDプロダクトイオンスキャン(図7C)は、予想されたm / z 124、親イオンから312 Da、おそらく166 + 146 Daの損失を示しました。四重極飛行時間型装置(図7Eのスペクトル)で高分解能MS/MSが得られ、m/z 290フラグメントが示され、ヒヨスチアミンまたはリトリンがエステルヒドロキシル部分でラムノースまたは類似の糖でグリコシル化されていることが示唆されました。測定された精密質量も、ラムノシルヒヨスチアミンまたはリトリンについて計算された正確な質量に非常に近かった(図7Eの構造)。その前例のない構造と豊富さから、このアルカロイドはD. stramonium種子からの単離に値し、この方法が新たなアルカロイドの発見に使用されていることを示す例です。

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図1:MSで観察されたTAの関連フラグメントと損失 (A)単置換、二置換、および三置換されたTAから形成された特性フラグメント(およびその診断質量)、および各クラスのアルカロイドの代表的な例 (B)TAのエステル基から観察された一般的な中性損失(およびその診断質量)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:ポジティブコントロールのプリカーサーイオンとニュートラルロスのスキャン。すべてのクロマトグラムについて、X 軸は保持時間、Y 軸はカウント(イオン存在量)です。(A)アルカロイド標準ミックスのベースピーククロマトグラムビューにおける全イオンクロマトグラム。標準の構造が示されています。対応するピークは赤い矢印で示されます。(B-F)は、(B)m/z 124、(C)122、(D)140、(E)156、(F)138のPrISクロマトグラムです。(G-I)60 Da(アセチル、G)、100 Da(チグロイル、H)、および 166 Da (フェニルラクチン酸/熱帯酸、I)の NLS クロマトグラム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:ネガティブコントロールプリカーサーイオンとニュートラルロススキャン。 すべてのクロマトグラムについて、X 軸は保持時間、Y 軸はカウント(イオン存在量)です。(A) S. lycopersicum 葉のメタノール/水抽出物のベースピーククロマトグラムビューでの全イオンクロマトグラム。(B)r.t. 2.6 と 3.4 分で 2 つの非トロパンの特徴のみを示す m/z 124 の PrIS クロマトグラム (C) m/z 122 の PrIS クロマトグラム、検出器ノイズ以外は空白。 図 2と同じものとして使用されるスケール。残りのクロマトグラムは 補足図1にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:MS/MS法のD. metel var. 'fastuosa'根への適用。 すべてのクロマトグラムについて、X 軸は保持時間、Y 軸はカウント(イオン存在量)です。(A)ベースピーククロマトグラムビューでの、D. metel var. 'fastuosa' 根のメタノール/水抽出物の全イオンクロマトグラム。(B-F)はm/zのPrISクロマトグラム、(B)124、(C)122、(D)140、(E)156、(F)138です。(G-I)は、60 Da(アセチル、G)、100 Da(チグロイル、H)、および166 Da(フェニル乳酸/熱帯酸、I)のNLSクロマトグラムです。各クロマトグラムには、多数のTAに対応する豊富なシグナルがあることに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:TAの構造を提案するためのDDプロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン、および中性損失スキャン法の組み合わせの適用(A)D. metel var. 'fastuosa'根のメタノール/水抽出物のベースピーククロマトグラムビューでの全イオンクロマトグラム。r.t. = 14.4 分でのピークは、赤い矢印で示されます。(B)Q1(サーベイスキャン)、このピークの質量はm/z 224と豊富です。すべてのスペクトルについて、X軸は質量、Y軸は強度です。(C)DDプロダクトイオンスキャンは、m / z 224イオンの断片化を示し、100 Daの損失とm / z 124フラグメント(赤い矢印)を示しています。この化合物は、(D)m/z 124 PrISチャネルと(E)100 Da NLSチャネルの両方に存在し、モノリプレイスおよびチグロイレートであることを示しています(パネルCの構造)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:MS/MS法の D.stramonium 種子への適用。 すべてのクロマトグラムについて、X 軸は保持時間、Y 軸はカウント(イオン存在量)です。(A) D. stramonium種子 のメタノール/水抽出物のベースピーククロマトグラムビューでの全イオンクロマトグラム(B) m/z 124のPrISクロマトグラム。(C)は m/z 140のPrISクロマトグラムを示しています。残りのクロマトグラムは 補足図2にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7: D.stramonium 種子の新しいアルカロイドの注釈。 すべてのクロマトグラムについて、X 軸は保持時間、Y 軸はカウント(イオン存在量)です。(A)ベースピーククロマトグラムビューでの、 D. stramonium 種子 のメタノール/水抽出物の全イオンクロマトグラム。r.t. = 13.7 分における特徴が示されています。(B)Q1(サーベイスキャン)は、このピークの 質量がm/z 436であることを示しています。すべてのスペクトルについて、X軸は質量、Y軸は強度です。(C) m/z 436イオンのフラグメンテーションを示すDDプロダクトイオンスキャン。(D)このモノ置換TA化合物は、 m/z 124 PrISチャネルに現れます。(E)この新しいTAの高分解能MS/MSスペクトル、提案された構造および正確な質量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:追加のネガティブコントロールプリカーサーイオンおよびニュートラルロススキャン。(A-C)m/z の PrIS クロマトグラム (A) 140、(B) 156、および (C) 138。(D-F)60 Da(アセチル、D)、100 Da(チグロイル、E)、および 166 Da(フェニルル乳酸/熱帯酸、F)の NLS クロマトグラム。使用されるスケールは、図 2 と同じです。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:MS/MS法のD.stramonium種子への適用。追加のクロマトグラム。(A-C)は、m/z (A) 140、(B) 156、(C) 138 の PrIS クロマトグラムです。(D-F)60 Da(アセチル、D)、100 Da(チグロイル、E)、および 166 Da(フェニルル乳酸/熱帯酸、F)の NLS クロマトグラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:アルカロイドの注釈に使用される空白のスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:D. metel var. 'fastuosa'根のアルカロイド注釈と構造のスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:D.stramonium種子のアルカロイドアノテーションと構造のスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

プロトコールで提供される機器パラメータは満足のいく性能を可能にしますが、このメソッドをうまく使用するには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払ったり、最適化したりする必要があります。ステップ 2.2 で示した HPLC 溶媒グラジエントは、一般的にトロパンアルカロイドに適していますが、検査対象のサンプルまたは植物種のトロパンアルカロイドプロファイルによっては、変更が必要な場合があります。サンプル注入量は、装置の感度やメソッドの使用方法によっても変更できます。「深い」代謝プロファイリングまたはデレプリケーションでは、より多くの注入量(この研究では15〜20μLを使用)を使用する必要がありますが、アルカロイドの単純な検出では少量を使用できます。大量のサンプルを使用する場合は、(a)イオン源を定期的に洗浄する、(b)HPLCカラムの圧力変化や目詰まりを監視する(常に適切なガードカラムを使用すべき)、(c)サンプル間のキャリーオーバーを防ぐ、(d)上記のようにクロマトグラムに潜在的な「同位体漏れ」がないか調べるように注意する必要があります。インターフェースの温度と電圧は、ソース内の早期フラグメンテーションを避けるために、メソッドで指定されているものから大幅に変更しないでください。さらに、コリジョンセル電圧を 20 V にすることが推奨されますが、すべての TA に最適なクロマトグラムシグナル(または診断用 DD 製品のイオンスキャンフラグメント)が得られるとは限りません。一部のMS機器および機能には、「コリジョンエネルギーランピング」機能、または複数のまたは最適化されたコリジョンエネルギーでスキャンを収集する機能があり、これもこのような方法で有用性を見出すことができる30。

このMS法自体も容易に変更可能です:チョウセンアサガオ種ではチグリ酸エステル、酢酸エステル、フェニルルアク酸/熱帯酸エステルが一般的ですが、TAエステル置換パターンは他の植物やサンプルでは異なる場合があります。NLS質量は、他のエステル基を検出するため(例えば、プロピオン酸エステルの74 Daの損失)または潜在的にグリコシル化を検出するため(例えば、ヘキソースの162 Daの損失)に変更することができます。PrISの質量も変更することができます。例えば、両方のチョウセンアサガオサンプル(r.t. = 12.5 min; Supplementary File 1 および Supplementary File 2 を参照)の TA には、その DD 生成物イオンスキャンフラグメント (m/z 110 および 93) に基づいてノルヒオシアミンまたはノルリットリン (ヒヨスチアミン/リットリンからトロパン N-メチル基を除いたもの) としてアノテーションが付けられ、文献スペクトル31 と一致しました;このTAは、トロパンフラグメントのPrISチャネルのいずれにも現れませんでした。これら 2 つの質量にチャネルを追加して、ノルトロパンを検出できます。m/z 93フラグメントは、ほとんどのモノ置換TA17にも存在する。このチャネルを追加すると、モノリプレースされた TA の存在がさらに確認され、誤検出を減らすのに役立ちます。

さまざまなタイプのTAへの適応性に加えて、このプロトコルの(既存のアルカロイドアノテーション法に対する)大きな利点の1つは、その速度です。MS メソッドの設定方法(および使用される HPLC ランタイム)にもよりますが、サンプルのすべての MS/MS データを 60 分から 90 分以内に収集できます。例えば、私たちの研究では、一置換および二置換された TA PrISs が 1 つの分析法に組み込まれ、三置換された TA PrIS が別の分析法に組み込まれ、NLS が 3 番目の分析法に組み込まれました(すべての分析法に DD プロダクトイオンスキャンが含まれていました)ため、それぞれ 30 分で合計 3 回の注入が行われました。MS/MSデータの組み合わせを利用したサンプルの完全なアノテーションは、すべてのピークを手動で検査したり、目的の多数のピークについて個々の製品イオンスキャンを収集したりするよりもはるかに高速です。この方法は、プロダクトイオンスキャン、PrIS、およびNLSモードを備えた任意の装置で実行でき、迅速な定性評価(TAが存在するか存在しないか)に使用でき、異なる植物属、種、品種または品種、器官、または成長段階を区別または「フィンガープリント」し、観察されたTAと報告されたTAとの比較(デレプリケーションワークフローの一部として)に使用できます。実証されているように、このプロトコルは、単離、精製、またはバイオアッセイのリードとして新しいTAの発見、およびそれらを単離するための候補種および組織の同定にも使用できます。この手法は、植物生化学の理解や創薬初期段階の検討など、天然物やメタボロミクスの分野に応用できます。その他の用途としては、食品の安全性や法医学(食品、サプリメント、生体液中のTAの検出など)などがあります。

この方法には、議論が必要ないくつかの欠点があります。まず、使用する装置やプロトコールを使用する目的によっては、大量のサンプル注入が必要になる場合があり、装置の性能に問題が生じ、場合によっては偽陽性が発生する可能性があります(上記のとおり)。次に、この方法は低分解能のQQQ装置で開発されたため、低分解能から偽陽性が発生する可能性があります(たとえば、TAではないネガティブコントロールにm/z 124フラグメントを含む特徴)。高分解能の装置はより優れた診断能力を提供し、提案された新しいアルカロイドについては精密質量MS/MSスペクトルを取得する必要があります。この方法のその他の欠点は、MS/MS分析全体の欠点です。MS/MSは、メタボロミクススタンダードイニシアチブ32で指定されている構造の提案(「アノテーション」)には役立ちますが、分子の結合性(「同定」)の具体的な割り当ては提供していません。例えば、Daturaの両試料には、m/z 124とm/z 140の両方の断片があると思われるm/z 306 TAの異性体がいくつか見つかり(補足ファイル2)、置換パターンの決定的な割り当てが困難でした。これは、まだ発見されていない断片化メカニズムを表している可能性があり、別の手法(核磁気共鳴分光法など)が曖昧さの解決に役立つ可能性があります。MS/MSベースの方法は、しばしば異性体と格闘します:フェニル乳酸エステルリットリン(またはその誘導体)はヒヨスチアミン(熱帯酸エステル)と区別するのが困難であり、他のナス科植物には、異性体のチグロイル基、セネシオイル基、およびアンジェロイル基で置換されたTAが含まれています33,34。標準物質がない場合、これらの化合物は、不可能ではないにしても、区別するのが難しい場合があります。また、この方法では、鏡像異性体(例:3,6-対3,7-ジヒドロキシトロパン、番号付けについては図1を参照)や位置異性体(例:標準なしで3-アセチルと7-アセチルを区別する)を区別しません。我々は、チョウセンアサガオ属および他のナス科植物17,35で報告された以前のパターンに基づいて、ほとんどの単置換トロパンを3置換として割り当てた。つまり、研究された生物に関する生化学的知識や文献(利用可能な場合)は、機器分析と常に並行して参照する必要があります。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、Faculty Research Grant(ノーザンミシガン大学、M.A.C.に授与)、学部研究フェローシップ(ノーザンミシガン大学、J.C.に授与)、および化学科によって資金提供されました。著者らは、植物組織調製の支援を提供してくださった John Berger 氏 (NMU)、LC-MS のメンテナンスとトラブルシューティングの支援を提供してくださった Hannah Hawkins 氏 (NMU)、アセチルトロピン混合物の調製についていただいた Dr. Ryan Fornwald 氏と彼の CH 495 (Natural Products Synthesis) の学生に感謝します。また、高分解能 MS/MS スペクトルを取得してくださった Daniel Jones 博士 (ミシガン州立大学) にも感謝いたします。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトニトリル、UHPLC用、質量分析に適していますSigma-Aldrich900667HPLC溶媒
アルゴンガスAirGas AR UHP300CIDガス
ギ酸、分析用99%Thermo ScientificAC270480010 HPLC添加剤
ガードカラムホルダーRestek25812
HPLC、島津製作所 LC-2030C 3D Plus島津製作228-65802-58HPLCカラム
LCMS, Shimdazu LCMS-8045島津製作所 225-31800-44質量分析計; 島津製作所の標準的なLabSolutionsソフトウェアを実行し
液体窒素AirGasNI 180LT22
メタノール, HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400抽出溶媒
微量遠心分離機を作るため VWR2400-37
微量遠心チューブ、1.5 mLフィッシャー・サイエンティフィック05-408-129
迫撃砲 フィッシャーサイエンティフィックFB961C植物組織の粉砕用
乳棒フィッシャーサイエンティフィックFB961M植物組織の粉砕用
ピペット 1000mLギルソン 
ピペットチップ 1000 mLフィッシャーサイエンティフィック02-707-404
植物組織様々なソースN/A野生でも栽培でも何でも構
ポリプロピレンコニカルチューブ、15mLフィッシャーサイエンティフィック05-539-4
ポリスチレンクーラーULINES-18312分子生物学用試薬が出荷されるクーラーの種類は次のとおりです。適切な
Roc C18 3 & マイクロ;m、100 mm x 4.6 mmRestek9534315HPLCカラム
Roc C18、10 mm x 4 mmRestek953450210Guard カラム
ロッキングシェーカーThemo Scientific11-676-680
スクリュースクリューバイアルコンビニエンスキット (9 mm)Fisher scientific13-622-190LCMS オートサンプラーバイアル
シリンジ、3 mLFisher Scientific03-377-27
シリンジフィルター0.45 µm Avantor/VWR76479-008
水、液体クロマトグラフィーおよび質量分析JT Baker9831-03抽出溶媒水溶液を作るため
、0.1% v/v ギ酸を含有、UHPLC 用、質量分析Sigma-Aldrich900687-1LHPLC 溶媒
所ました F144059Mいません 用 に適しています

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天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド
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