方法論記事

デキストラン硫酸ナトリウムを用いた直腸結腸切除術および回腸嚢肛門吻合後の嚢炎のラットモデル

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DOI:

10.3791/66623

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2024年5月31日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、嚢炎のラットモデルを確立するための方法を説明しています。回腸嚢モデルは、マイクロサージェリー技術を使用して回腸嚢-肛門吻合術(IPAA)手術を行うことによって作成されました。手術後、ラットを4%デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)で4日間治療しました。

要約

潰瘍性大腸炎(UC)は、結腸と直腸全体に影響を及ぼし、再発して寛解する慢性免疫介在性疾患であり、生涯にわたる罹患率を引き起こします。治療が効果がない場合、特に大量の消化管出血、穿孔、中毒性メガコロン、または発がんの場合、手術はUCを治すための最後の砦になります。全結腸直腸切除術と回腸嚢肛門吻合術(IPAA)は、長期治療の最良の機会を提供します。嚢炎は、最も一般的で厄介な術後合併症です。この研究では、マイクロサージェリーを使用して、IPAA手術 を介して 実験ラットの回腸ポーチモデルを作成します。続いて、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) で回腸袋の炎症を誘発することにより、嚢炎の持続的なラットモデルが確立されます。ラット嚢炎の成功した確立は、術後の全身状態、体重、食物と水の摂取量、糞便データ、および嚢組織の病理学、免疫組織化学、および炎症因子分析の分析を通じて検証されます。この嚢炎の実験動物モデルは、病状の病因と治療を研究するための基礎を提供します。

概要

嚢炎は、回腸嚢に影響を与える非特異的な炎症であり、潰瘍性大腸炎 (UC) の個人における全直腸結腸切除術および回腸嚢肛門吻合 (IPAA) に続く一般的な合併症です1,2,3。この状態は、最大 50% と比較的高い発生率を示し、下痢、腹痛、糞便失血、発熱など、さまざまな臨床症状を引き起こす可能性があります。嚢炎の正確な原因は依然として不明ですが、一部の研究者は、嚢内細菌叢の変化が免疫活性化とその後の炎症を引き起こす可能性があると考えています4,5,6,7。

嚢炎の臨床試験の実施には課題があるため、動物モデルは嚢炎の薬剤やメカニズムを研究するための貴重なツールとして役立ちます。ラット回腸嚢の作成に関する懸念が高まっており、炎症の可能性を示す報告があります8。しかし、この分野の研究は、製造プロセスの複雑な性質のためにまばらなままであり、明確なガイドライン9,10が欠けています。1998年、リヒトマンは、ルイスラットとスプレイグ・ドーリー(SD)ラットで回腸嚢モデルを確立した最初の人でした11。その結果、これらのラットでは、マクロファージの浸潤、粘膜潰瘍形成、腸内の嫌気性細菌叢の増加が観察され、回腸嚢炎に関するさらなる研究の確固たる基盤となりました。ラット嚢炎のこの実験モデルは、ヒト嚢炎で観察される身体的徴候と根本的なメカニズムを密接に模倣しています。

一般的に適用される前臨床潰瘍性大腸炎モデルには、DSSモデルとTNBSモデルが含まれます。誘導化学物質である2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)は、通常、クローン病をシミュレートします12。DSSモデルは、その有効性、安全性プロファイル、および手頃な価格で高く評価されており、観察された明らかな症状により、UC導入の信頼できるツールとしてよく使用されます。嚢組織のコロニー形成を考慮して、DSS13,14を使用して嚢炎モデルを誘導することに成功しました。

本研究では、マイクロサージェリーを使用して、IPAA手術 を介して 実験ラットの回腸ポーチモデルを作成することに成功しました。その後、DSSで回腸嚢の炎症を誘発することにより、持続的なラット嚢炎モデルが確立されました。手術中の精度は、モデル形成を成功させるために不可欠であり、術後のケアも重要です。このモデルは、嚢炎の病因を調査し、潜在的な治療薬を評価し、この複雑な状態の理解を深めるために使用できます。この研究は、回腸パウチの製造手順を合理化し、手術時間を短縮し、効率を高めることで、術後パウチ障害の基礎研究のための強固な基盤を確立します。

プロトコル

すべての動物実験は、天津医科大学総合病院倫理委員会の方針に従って行われました。この研究では、体重約320〜360 gの9〜12週齢の雄のSprague-Dawleyラットを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 動物の選別と維持

  1. 健康な動物(体重220~240g)を選択します。
  2. 特定の病原体を含まない(SPF)15 レベルの基準を満たし、適切な換気(1時間あたり8〜12回の空気交換)、快適な温度(20〜25°C)、適切な湿度(40%〜70%)、最小限の騒音(70デシベル未満)、自然光サイクル(12時間の光と12時間の暗闇)のある環境で最低2週間適応的に飼育されていることを確認してください。
  3. この期間中は、ケージあたり3〜5個の密度で標準的な清潔なケージに収容し、週に2回寝具を交換します。実験用ラットに餌と水、および標準的なメンテナンス飼料への 自由な アクセスを提供します。

2. 術前準備

  1. 体重が約320 gから360 gの健康なラットを選択します。手術の8-12時間前にラットを絶食し、生理食塩水と5%グルコースの溶液を1:1の比率で自発的に消費できるようにします。
  2. オートクレーブ滅菌された顕微手術器具(術前にアルコールに1時間浸漬)、顕微鏡、ラット解剖台、8-0を準備します非吸収性高分子縫合糸、4-0非吸収性縫合糸、滅菌ガーゼ、滅菌綿棒など

3. ラット回腸パウチモデルの確立

  1. 1% ペントバルビタールナトリウム溶液を 6 mL/kg の用量で腹腔内に注入し、0.5% ロピバカインによる局所麻酔の切開浸潤をラットに麻酔します。麻酔中は電灯でラットを快適な温度に保ちます。
  2. 以下の手順に従って、結腸直腸全切除を実施します。
    1. ラットを解剖学的ベンチに背側横臥位に固定し、満足のいく麻酔プロトコルに従います。つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。シェービングクリッパーを使用して髪の毛の破片を取り除き、ヨードフォア溶液を2回塗布して手術野滅菌を行います。
    2. 長さ約6cmの正中線切開を行い、皮膚、白線筋膜、腹膜を解剖し、腹腔内に入ります。リトラクターを使用して腹膜表面を露出させ、静菌生理食塩水をまぶした滅菌ガーゼで覆います。
    3. 終末空腸の血管の流れを分離し、8-0を使用してその起源を結紮します糸を縫合し、その後それを切断します。回盲弁から1〜2 cmのところにある盲腸の切り株を静止状態に置き、切断します。
    4. 右半結腸切除を開始し、右半結腸と中疝痛静脈を保存的に結紮します。
    5. 下腸間膜動脈をさらに分離し、下直腸動脈を分離します。肛門の縁から2センチメートルに相当する間隔まで、直腸を下って隔離を続けます。術後の狭窄を避けるために、遠位直腸を約45度で斜めに切除します。
  3. Jパウチ施工を行います。
    1. ミクロトームメスを使用して、回腸末端の横断面を腸間膜腸から分離します(これは約6〜7 cmを測定する必要があります)。
    2. 回腸末端をJ字型に折りたたんで、回腸用の袋を作ります。インターロッキングステッチ を介して 後壁吻合を行います。修正されたコネルステッチを使用して前壁を増強し、遠位直腸断端の断面サイズに一致するように適切な腸を保持します。
    3. J字型ポーチを8-0で補強必要に応じてステッチします。Jポーチの長さは2.5cmから3.5cmの範囲に収まる必要があります。
  4. 回腸嚢-肛門吻合、IPAAを行います。
    1. 腸間膜にねじれがないことを確認し、ポーチの開口部のアリの側壁と直腸の切り株の側壁を8-0の間隔で縫合します牽引力のための縫合糸。
    2. 最終的には、前壁と後壁の両方に全層の連続ロック縫合糸を適用します。
    3. 活発な出血がないことを確認し、生理食塩水で腹腔を生理学的に洗浄します。腹筋筋膜と皮膚を4-0縫合糸で順次閉じます。
  5. 術後管理を行います。
    1. 術後鎮痛薬としてケトプロフェン(40 mg / kg、皮下)を腹部閉鎖後、すべてのラットに投与します。.復元が行われるまで、電灯を使用してラットが温められていることを確認してください。
    2. 腸閉塞のリスクを減らすために、術後最低72時間、動物を食物摂取から制限します。エネルギーと体液をすばやく補充するために、5%グルコースの食事療法を自由に利用できるようにし、排便パターンに応じて摂食頻度を調整します。
    3. 手術の1週間後、限られた栄養から始めて、消費する量を徐々に増やします。次に、ラットに定期的にげっ歯類の飼料を提供して自由に消費し、食事摂取量、水分摂取量、体重を毎日記録します。

4. DSSを用いたラット回腸嚢炎モデルの確立

  1. 実験的なグループ化を実行します。
    1. 大腸全切除術とIPAA手術を受けた12匹のラットを、IPAAグループ(グループA、n = 6)と嚢炎グループ(グループB、n = 6)にランダムに割り当てます。
    2. 毎日新たに調製する純水100mLに4gのDSSを加えて、4%DSS溶液を調製します。
    3. IPAA グループと嚢炎グループを、術後 31 日目から 35 日目にそれぞれ純水または 4% DSS で投与します。ラットが投与の4日間連続してラットの餌を自由に飲んだり食べたりできるようにします。
  2. パウチのサンプリングを行います。
    1. 手術後の 35 日目の朝、ラットに 1% ペントバルビタールナトリウム溶液の腹腔内注射で麻酔をかけ、6 mL/kg の用量を投与します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
    2. パウチのストーマから各グループの入力パウチと出力パウチの接合部まで垂直にパウチを切断します。パウチの標本を入手します。
    3. 前壁縫合線に沿ってポーチを開き、生理食塩水で腸管を洗います。
    4. パウチ組織の断片をマイクロ遠心チューブに入れ、すぐに-80°Cで冷蔵します。 この部分は、炎症性指標のELISA検出に使用します。残りのパウチ部分を10%ホルムアルデヒドで固定し、病理組織学的スコアリングおよび免疫組織化学的染色を行います。
    5. 最後に、深い麻酔下で空気塞栓術によってラットを安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。

5. 組織学的解析

  1. ラットから袋組織を取得した後、4%パラホルムアルデヒドに24時間浸します。その後、脱水症と埋め込みのプロトコルを進めます。組織学的検査のために処理された組織を切片にする 16.
  2. ヘマトキシリンおよびエオシン染色を適用して、グループ間の病理組織学的差を特定します。サンプルを顕微鏡で調べ、文書化のために写真を撮影します。

6. 免疫組織化学アッセイ

  1. ティッシュ切片を慎重に脱ろうし、脱水します。次に、クエン酸ナトリウム溶液中の切片を冷却し、ブロッキング血清で20分間ブロッキングすることにより、抗原賦活化を行います。
  2. その後、スライスを一次抗オクルージン抗体に曝露し、4°Cで一晩インキュベートします。 その後、ヘマトキシリン対比染色16の前に、二次抗体で30分間それらを処理します。
  3. スライスが乾いたら、光学顕微鏡で観察し、写真を撮ります。

7. ELISAテスト

  1. 7.1 ソニケーションを使用して溶解緩衝液中の組織片をミンチして均質化し、完全な均質化を確保します。得られた上清を検出に利用します。
  2. グループごとにブランク、サンプル、および反復のウェルを割り当てます。450 nmでの吸光度(OD値)を読み取り、線形回帰分析16を行うことにより、タンパク質濃度を決定します。

結果

作出後の回腸袋モデルラットの全身状態評価
オペレーターがIPAAの外科的学習曲線を通過した後、ラットは手術によく耐え、手術時間は192.94分±27.15分で、術後合併症の発生が少なくなりました。ラットは術後早期に食事摂取量の減少を経験しましたが、術後10日から14日で術前の食欲は回復しました。術後早期の活動はわずかに減少し、目や鼻からの明らかな分泌物はありませんでした。手術前後の体重減少は1.59g±21.17gでした。術後初期体重は減少傾向を示し、最大で 69.58 g ± 33.19 g 減少しました。手術後8.25±2.53から安定した成長が始まり、手術後31日目には 手術翌日の体重の9.35%±4.7%を超えた。ラットは手術後24時間以内に排便することができ、便は緩んでいましたが、血便はありませんでした。軟便の形成は、手術後9日目から 12日目に 起こりました。

回腸パウチの代償的増加
手術後35日目に 麻酔下でラットの腹腔が開かれ、回腸嚢と骨盤腔との間に重度の癒着が明らかになりました。パウチと周辺組織との接着を慎重に分離した後、回腸パウチの代償的拡大、腸壁の肥厚、遠位小腸の軽度の拡張が観察されました(図1)。回腸袋の長さは手術時は2.89cm±0.28cmであったが、術後35日目には 3.86cm±0.87cm)となり、 P =0.000の有意な統計学的差を示した。回腸嚢の粘膜面積(cm2)も、外科的測定と比較して有意に増加しました(6.46 ± 0.85 対 17.02 ± 4.61、 P = 0.000)。IPAA群と回腸嚢炎群との間に有意差は認められなかった(P > 0.05)。

回腸嚢炎のラットの全身状態評価と糞便スコア
手術後31日目 に、回腸嚢炎グループにDSSが投与されました。投与開始当初、IPAA群と回腸嚢炎群の体重は同等(352.00g±30.03g対352.00g±25.92g、 P =1)で、概ね良好な状態であった。しかし、回腸嚢炎群では食物や水分の摂取量が減少し、精神的疲労、毛髪の抜け落ち、目や鼻の分泌物、運動性の低下が生じ、IPAA群では大きな変化は認められませんでした。術後35日目 には、回腸嚢炎群の体重はIPAA群よりも有意に低かった(322.83g±29.24g 対364.83g±30.13g、 P =0.028)(図2)。

回腸嚢炎群は、DSS投与後1日目に著しい下痢を呈し、DSS投与後2日目には粘液、膿、血便が出た(図3)。術後35日目の 便スコアは、IPAA群と回腸嚢炎群の便スコア11 でした(4.33 ± 0.82 vs 2.17 ± 0.75、 P = 0.001)。IPAA群のラットは清潔で汚染のない肛門を持っていましたが、回腸嚢炎のラットは肛門の腫れが粘液、膿、血便の付着を伴っていました。

回腸パウチの病理組織学的変化

回腸袋標本の巨視的観察
IPAA群では、回腸嚢の腸壁が肥厚し、びらん、潰瘍、出血点は認められませんでした。回腸嚢炎群では、収納袋腸間膜の血管が厚くなり、回腸嚢の粘膜が広範囲または局所的に炎症を起こし、目に見えるびらん、潰瘍、出血点が認められ、その一部は顕著な遠位小腸拡張を伴います(図4)。

回腸嚢組織の顕微鏡観察
IPAA群のラットでは、嚢組織の一部腸絨毛の先端が鈍くなり、少量の好中球浸潤を伴い、時折、粘膜表面に少量の滲出が観察されました。

対照的に、回腸嚢炎群のラットの回腸嚢組織における腸絨毛の配置は極めて乱れていた。一部の腸絨毛が欠落しており、筋肉層を関与させることなく、広範な侵食と複数の斑点性潰瘍が見られました。これには、多数の好中球とリンパ球の浸潤、過剰な滲出、および目に見える陰窩の炎症が伴いました。回腸嚢炎群の回腸嚢組織の病理学的スコアは、IPAA群の病理学的スコアよりも有意に高く、有意な統計的差が観察されました(8.50 ± 1.76 対1.33 ± 0.52、 P = 0.000)(図5)。

腸管バリア機能タンパク質オクルージンの発現量
オクルジンは、腸管バリアの重要な機能タンパク質であり、ラットのIPAA群と回腸嚢炎群の両方で回腸嚢組織の細胞膜に発現している11。しかし、回腸嚢炎群のオクルージンタンパク質の発現レベルは、IPAA群よりも有意に低かった(0.25 ± 0.03 対 0.15 ± 0.02、 P = 0.000)(図6)。

回腸パウチにおける炎症性因子の検出
回腸嚢炎群のラットの回腸嚢組織におけるIL-6、IL-17、TNF-α、およびINF-γの発現レベルは、IPAA群の発現レベルよりも有意に高かった(ELISA試験16で決定)。逆に、IL-10は逆の結果を示し、統計的な差が観察されました(P = 0.000)(表1)。

figure-results-1
図1:回腸パウチの状態。 矢印は、(A)の手術時の回腸袋と(B)手術後35日目( 検体採取時)の回腸袋の代償性肥大を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:IPAA手術後のラットの体重変化の傾向。 エラーバーは、各グループの標準偏差n = 6に関連しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:ラットの糞 の写真 (A)IPAAグループ。(B)回腸嚢炎グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:回腸袋標本の巨視観察 (A)IPAAグループ。(B)回腸嚢炎グループ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:ラット回腸嚢組織の病理学的変化 (A)IPAA群。(B)回腸嚢炎グループ。スケールバー:60μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:ラット回腸袋組織におけるオクルージンタンパク質発現の免疫組織化学的検出。(B)回腸嚢炎グループ。スケールバー:60μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

群nIL-6IL-10IL-17TNF-αINFのγ
IPAAグループ62.60 ± 0.365.81 ± 0.6617.48±4.8186.94±24.064.08±0.56
嚢炎グループ66.94 ± 1.182.77 ± 0.6034.82±2.41213.00±26.119.67±1.70
P00.0000.0000.0000.0000.000

表1:ラット回腸袋組織における炎症因子の発現レベル(pg / mL)。

ディスカッション

潰瘍性大腸炎(UC)は、再発性上腹部痛、下痢、粘液性血便を特徴とする慢性腸の炎症です。それは主に直腸に影響を及ぼし、さまざまな程度で進行する結腸に関与する可能性があります。手術は、UC 17,18,19の管理において重要な役割を果たします。Parks et al.20 が 1978 年に回腸嚢肛門吻合術 (IPAA) による全結腸切除術を導入し、変化した組織を切除して腸の連続性を回復させて以来、この手術は UC の外科的治療の国際標準となっています。パウチの炎症性疾患は、IPAA手術後の最も一般的な合併症です。

嚢炎の臨床試験を実施する際に直面した課題のため、動物モデルは嚢炎に関連する薬剤やメカニズムを研究するための補完的な実験として使用されてきました。1998年、Lichtmanら11 は、大腸の完全除去とパウチの直腸への再接続を含むラットモデルを開発しました。このモデルは、術後4週間以内に単核細胞浸潤、管腔滲出、粘膜潰瘍、漿膜炎症などの炎症の徴候を示しました。炎症のレベルは、ポーチ内の細菌数の増加と相関しており、明確な宿主の遺伝的感受性が観察されました。2002年、Shebaniら21 は、SDD を介して IPAA外科用ラットモデルの構築に成功し、嚢炎を効果的に誘発しました。このモデルは、動物を使用して嚢炎の病因を研究することの有効性を確認し、嚢炎の基礎研究のための堅牢な実験プラットフォームを提供しました。また、ヒトとげっ歯類の両方のリザーバーで細菌が大量に増殖する同様のパターンを同定し、腸内細菌の不均衡を調査し、嚢炎に関連する潜在的な病原体を特定する上での有用性を検証しました。

マウスのフィーディングとIPAA手術モデリングの経験から、学習曲線を約10被験者に圧縮することは可能です。このプロセスの重要なステップは、Jパウチの構築と吻合です。マウスの腸管が比較的細いことを考えると、8-0縫合糸には縫合糸を使用しました。連続ロッキング縫合糸とコンネルステッチは、ポーチの後壁と前壁の縫合糸に別々に採用されました。ポーチと肛門管の吻合中に、傾斜した表面を作成することで、直腸の断端を例にとると、吻合部での狭窄を効果的に減らすことができます。最初に、吻合部位の両側に2針を固定し、次に連続的なロック縫合を進めて後壁と前壁を個別に縫合することで、吻合の完全性を確保し、手術時間を短縮します。

術後管理も、モデリングを成功させる上で極めて重要な役割を果たします。術後72時間の絶食期間は、腸閉塞の発生を効果的に減らすことができます。一方、初期の適度な流動食は、マウスの栄養と水分の必要量を確保することができます。学習曲線を習得した後、外科医はモデル確立においてより効率的で一貫した成功率を達成することができます。

この研究は、この基盤の上に構築され、予備的な調査と改良を通じて、マイクロサージェリーを使用してラット回腸ポーチモデルを確立することに成功しました。次に、このモデルを使用して、ポーチの炎症と腸のバリアインジケーターの状態を調べました。その結果、ラットはDSSに曝露された後、血便、下痢、体重減少などの顕著な症状を示したことが示されました。これにより、嚢粘膜の浮腫とびらん、病理組織学的スコアリングで示される炎症、インターロイキン-6(IL-6)、IL-17、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)、インターフェロンガンマ(INF-γ)などの炎症誘発性因子のレベルの増加、抗炎症因子インターロイキン-10(IL-10)のレベルの低下が引き起こされました。さらに、腸バリア指標であるオクルージンのタンパク質発現は減少しました。これらの知見は、先行研究11 と一致しており、ラット嚢炎モデルの成功裏の確立を裏付けるものであり、その後の薬物およびメカニズム研究のための強固な基盤を提供するものである。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノール天津Fengchuan化学試薬技術有限公司ヘマトキシン-エオシン染色
デキストラン硫酸ナトリウム  イェーセン 60316ES76炎症を誘発するために使用される
ホルムアルデヒド溶液天津 Zhiyuan 試薬会社中国ヘマトキシン-エオシン染色
ガーゼ江西省中安医療機器会社中国動物顕微鏡手術に使用
ヘマトキシリン北京中山金橋会社中国ヘマトキシン-エオシン染色
インターフェロン &ガンマ; 検出試薬キットCloud-cloneSEA049Ra炎症性因子の検出
インターロイキン-10検出キットCloud-cloneSEA056Ra炎症性因子の検出
インターロイキン-17検出キットCloud-cloneSEA063Ra炎症性因子の検出
インターロイキン-6検出キットCloud-cloneSEA079Ra炎症性因子の検出
IodophorTangpai Medical Equipment Co., Ltd中国動物顕微鏡手術に使用
顕微鏡操作器具Aesculapドイツ動物顕微鏡手術に使用
Occludinabcamab216327免疫組織化学検査
ミシン針揚州富田医療機器有限公司中国動物顕微鏡手術に使用
腫瘍壊死因子&α;検出試薬キットCloud-cloneSEA133Ra炎症性因子の検出
2人用双眼手術顕微鏡OPTONドイツ動物顕微鏡に使用
キシレン天津 Yingda 希少で貴重な試薬工場中国ヘマトキシン-エオシン 染色
中国 袋の

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デキストラン硫酸ナトリウムを用いた直腸結腸切除術および回腸嚢肛門吻合後の嚢炎のラットモデル
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