方法論記事

脳血管の解剖学的構造を損なうことなく中大脳動脈閉塞・再灌流のラットモデル

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DOI：

10.3791/66635

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2024年5月17日

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1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

この記事について

サマリー

現在のプロトコルは、損傷を引き起こすことなく脳血管の解剖学的構造を保存する中大脳動脈閉塞/再灌流のラットモデルを記述しています。

要約

虚血性脳卒中は、世界中の成人の長期的な障害と死亡の主な原因となっています。虚血性脳卒中の動物モデルは、その病理学的メカニズムの理解と潜在的な治療法の開発に大きく貢献しています。現在、フィラメント (血管内縫合) 技術を含む 2 つの一般的な方法があり、脳虚血の動物モデルを誘導しています。ただし、これらの方法には、脳への血液灌流の減少、外部頸動脈系の損傷、食物や水分の摂取障害、顔の感覚機能障害など、固有の制限があります。この記事では、脳血管の解剖学的構造を損なうことなくラット虚血性脳卒中モデルを誘導する新しい方法を紹介します。この研究では、Sprague-Dawleyラットの総頸動脈(CCA)が露出し、切開が行われました。次に、切開部からフィラメントを内頸動脈に挿入して、中大脳動脈を閉塞しました。誘発された虚血の1.5時間後、閉塞フィラメントは内頸動脈とCCAの両方から完全に除去されました。.その後、CCA の切開部を顕微鏡下 11-0 顕微縫合糸 (倍率 4 倍) を使用して縫合しました。この研究では、CCAを修復するための顕微手術技術の利用を通じて、脳血管の解剖学的完全性を維持しながらラットに虚血性脳卒中モデルを誘導する独自の方法の開発に成功しました。

概要

脳卒中は、世界中の成人の死亡および長期の神経機能障害の主な原因であり、様々なタイプを包含しており、虚血性脳卒中が症例の約81.9%を占め、脳出血とくも膜下出血がそれぞれ14.9%と3.1%を占めています1.虚血性脳卒中は、アテローム性動脈硬化症または中大脳動脈(MCA)の閉塞に起因し、局所的な脳血流の減少とそれに続く脳の損傷につながります。虚血細胞への栄養供給のこの減少は、エネルギーの枯渇を引き起こし、膜の完全性の喪失、細胞の腫脹、そして最終的には溶解を引き起こします。さらに、細胞内カルシウムの増加、興奮性アミノ酸の放出、フリーラジカル産生の増加、炎症性細胞の活性化などの要因が、脳卒中後の脳組織の損傷2に寄与します。

虚血性脳卒中の治療目標は多面的です。進行中の神経学的損傷を減らし、死亡率と長期的な障害を減らすこと、不動と神経機能障害から生じる合併症を予防すること、そして脳卒中の再発リスクを最小限に抑えることです。虚血性脳卒中の病態生理学の複雑さを考えると、虚血性脳卒中を標的とする治療法の研究開発には、堅牢な脳卒中モデルが不可欠です。

現在、中大脳動脈閉塞症(MCAo)は虚血性脳卒中の一般的な動物モデルです3です。MCAoは通常、シリコンチップまたは炎鈍化モノフィラメントを頸部血管に挿入して、中大脳動脈(MCA)の起点に到達するまで挿入することによって実行されます。1986年、小泉らは、総頸動脈(CCA)の切開部からシリコン先端のモノフィラメントを挿入する技術を開発し、MCAの入り口に到達して血流を遮断できるようにしました4。1989年、ロンガのグループは、外頸動脈(ECA)の切開部からモノフィラメントを導入する別のMCAo法を報告しました。その後、モノフィラメントは内頸動脈(ICA)とECAの分岐部を横切り、MCA5の始点に到達します。

MCAoを誘導するための2つの既存の方法の限界は明らかです。小泉の方法は、同側CCAの永久的な閉塞を必要とし、再灌流がWillis4の円のみに依存するため、MCA灌流の減少につながります。逆に、ロンガの方法はECAを切断することを含み、ECAシステムに損傷を与え、その結果、顔の筋肉機能5の障害を引き起こします。この損傷は、食物や水の摂取に影響を与えるだけでなく、顔の感覚機能障害を引き起こし、虚血性脳卒中後のリハビリテーションと神経機能の評価に影響を与える可能性があります6。

現在のプロトコルは、脳血管の解剖学的構造を損傷することなく虚血性脳卒中モデルを誘発する新しい方法を開発することにより、これらの制限に対処しようとしています。この新しいアプローチは、マイクロサージェリー技術を利用してCCAを修復するため、以前の方法に関連する欠点を回避できます。

プロトコル

この実験手順は、煙台大学の動物施設管理委員会(承認番号:YTDX20230410)から承認を受け、国立衛生研究所の実験動物の世話と使用に関するガイドラインを遵守しています。この研究では、体重300〜350 gの雄のSprague-Dawleyラットを利用しました。使用した動物、試薬、機器の包括的なリストは、材料表に記載されています。

1. 動物の調理法

  1. 12時間の明暗サイクル、制御された温度、湿度を維持する環境に動物を収容します。彼らが食料と水に無制限にアクセスできるようにします。

2. 麻酔

  1. ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(20 mg / kg)を含む混合物を使用して腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます><。 注:ラットの頭と体を下向きに傾けます。注射部位は、動物の腹部の右下腹部にあります。注入する前にプランジャーを引き戻してください。平均注入量は0.4mLです。
  2. 後足の離脱反射とまばたき反射を評価することにより、麻酔の導入を確認します。麻酔の適切な深さが達成されない場合は、外科的処置中にイソフルランを補給します。.

3. 虚血モデリングの手順

  1. オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。手術台および関連機器を70%エタノールで消毒します。
  2. 予想される切開部位の周りの毛皮を剃ることにより、手術部位を準備します。手術部位の皮膚をベタジンと70%エタノールで3回消毒します。
  3. 腹側に約1.5cmの長さの正中線切開を行い、表在筋膜を開きます。
  4. 鋭く鈍い解剖を行い、前述の方法に従って、外頸動脈(ECA)、内頸動脈(ICA)、および総頸動脈(CCA)を露出させます7。
  5. CCAの周りに3つの4-0シルク縫合糸を配置し、ICA分岐部近くのECAを介して別のシルク縫合糸を配置します。近位CCAに取り外し可能なスリップノットを結びます。止血器を使用して遠位CCAの縫合糸を締め、血流を遮断します。縫合中にCCAの周りに別のスリップノットを緩く結び、血管が閉塞しないようにします。
    注:スリップノットは血管縫合中に解放する必要があるため、スリップノットがきつすぎず、血流をブロックするのに十分なだけであることを確認してください。
  6. はさみを使用して、近位のシルク縫合糸とCCAの中央の縫合糸との間に0.5mmの切開を行います.
    注意: 切開部がフィラメント(シリコンコーティングされた先端)がCCAに入ることができることを確認してください。
  7. 長さ3cmの4-0フィラメント(シリコンコーティングチップ)をCCAに導入します。CCAの周りの絹の縫合糸を締めて、管腔内フィラメントを固定し、出血を防ぎます。次に、遠位CCAから縫合糸を取り出します。
  8. フィラメントをMCAの内腔に挿入し続け、ECAの周りの縫合糸を制御して、フィラメントがECAに入らないようにします。挿入長さは通常18mmから20mmです。
  9. タイマーを開始し、オクルージョンが開始された時間を記録します。首の切開部を3-0シルク縫合糸で縫合し、動物を慎重に回復ケージに入れます。0.5 mLの生理食塩水を腹腔内投与します。.

4. CCAの顕微手術用縫合

  1. 虚血の1.5時間後にラットに再麻酔をかけます。.切開部位を70%エタノールで3回消毒し、切開部を再度開きます。
  2. CCA切開部の近くに白い先端がはっきりと見えるまで、閉塞フィラメントをゆっくりと引き抜きます。マイクロクランプを、CCA分岐部の近くの固定された管腔内縫合糸の結び目の近くに水平に配置します.
    注意: シリコンの剥離とその後の血栓症を防ぐために、白いフィラメントの先端を固定しないでください。
  3. 固定されている管腔内縫合糸の結び目を緩め、フィラメントを完全に取り外します。
  4. 近位CCAノットの心臓端側の近くに別のマイクロクランプを配置します。続いて、近位CCAの周りの縫合糸の結び目を外します.
    注:クランプの適切な配置は、微小血管縫合を容易にするために後のステップで固定血管を持ち上げるために重要です。滑りを防ぐために、周囲の筋肉にクランプを水平に置きます。
  5. 切開部位を通常の生理食塩水で洗い流し、滅菌綿球でその部分を乾燥させて血液を取り除き、明確な手術野を実現します。
  6. 顕微鏡下(倍率4倍)で、11-0の顕微手術用縫合糸を断続パターンでCCA切開部を縫合します(切開部のサイズにもよりますが、通常は2針必要です)。
  7. 縫合後、CCAの両端からマイクロクランプを取り外して血流を回復させます。
  8. 滅菌コットンボールでCCA縫合部位に30秒間圧力をかけ、出血が発生しないようにCCAを2分間観察します。ラットの首の切開部を縫合し、動物をケージに戻す前に麻酔回復のために35°Cのケアボックスに入れます
    注:術後鎮痛のために、メロキシカムを2 mg / kgの用量で腹腔内投与します。.

5. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)による染色

  1. 虚血再灌流の3日後、4%イソフルランと子宮頸部脱臼による深い麻酔下で動物を安楽死させます。
  2. 脳を取り出し、メスの刃8を使用して、厚さ2mmの冠状切片に切ります。
  3. 脳切片を2% TTCで37°Cで20分間インキュベートします。
  4. 脳切片を10%ホルマリンで2回すすぎ、10%ホルマリンで室温で30分間固定します。
  5. 連続スライスのデジタル写真を撮影し、Image Jソフトウェアを使用して梗塞領域を定量的に測定します。

6. 神経機能検査

注:神経学的機能は、以前のレポート9に続いて、ガルシアテストを使用して評価されました。

  1. 自発的な活動、4 つの手足すべての動きの対称性、前足の伸ばし、登り、身体の固有受容感覚、および振動の接触に対する反応を評価します。ガルシアテストの基準に基づいてスコアを割り当て、最大スコアは18ポイントで、正常な神経機能を示します。

7. 統計分析

  1. GraphPad Prismを使用して、Studentのt検定を使用して統計分析を行います。データを平均±標準偏差として表します。Pが0.05の場合、統計的に有意な平均<差を考慮します。

結果

微小縫合の手順
白色のフィラメントの先端が見えるまで、総頸動脈（CCA）の切開部付近からフィラメントを引いた（図 1A）。次に、CCAにマイクロクランプを装着した（図 1B）。4倍の倍率の顕微鏡下で、微小外科用縫合糸を用いてCCAの切開部を結節縫合した（図 1C）。その後、CCAからマイクロクランプを取り除き、解剖学的構造と血流を復元させた（図 1D）。

TTC染色および死亡率
計12匹の成体雄ラットを、シャム群とモデル群の2群にランダムに分けた（各群n = 6）。残念ながら、シャム群の1匹が麻酔の過剰投与により死亡し、モデル群の1匹が24時間以内に死亡した。脳虚血に起因する梗塞が、線条体と皮質の両方で観察された（図2A）。虚血性脳卒中後3日において、全梗塞率は脳半球の29.3% ± 1.6%と測定され（図2B）、術後の死亡率は16.7%であった。

神経機能の評価
虚血性脳卒中後1日および3日において、モデル群のスコアはシャム群と比較して有意に低下した（それぞれ 17.8 ± 0.4 vs. 8.2 ± 1.5、Figure 3A；17.6 ± 0.9 vs. 9.6 ± 1.3、Figure 3B）。

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図1マイクロサージャリーによる縫合の手順。 (A) フィラメントを総頸動脈（CCA）から抜去する。青色の矢印は微小血管クランプを示す。 (B黒色の矢印は、フィラメントを完全に除去した後の切開部位を示す。青色の矢印は、微小血管クランプを示す。C顕微鏡下（4倍率）で、共通頸動脈（CCA）の切開部を1-0マイクロサージカル縫合糸を用いて断続縫合した。青色の矢印は微小血管クランプを示し、黒色の矢印は縫合後の切開部を示す。Dマイクロクランプを取り除き、総頸動脈（CCA）の血流を再開させる。黒色の矢印は、CCAの縫合部位を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2虚血モデルのTTC染色結果。 (A) 脳虚血後の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）染色脳切片の代表的な画像。生存組織では、TTCが脱水素酵素によって酵素的に還元され、赤色の1,3,5-トリフェニルホルマザンとなる。壊死領域の組織は、このような酵素活性がないため、白色のままである。(B脳虚血後3日目におけるラットの虚血領域の割合。Sham群と比較して、**P < 0.01. データは平均値として的に表される ± 標準偏差。各群のラットは5匹であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3神経機能の評価。 (A脳虚血後1日のGarciaスコア。B脳虚血から3日後のGarciaスコア。Sham群と比較して、**P < 0.01. データは平均値として的に示す ± 標準偏差。各群に5匹のラットを用いた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

MCAo は、脳卒中の動物モデルを作成するために広く使用されている方法であり、虚血後の血流を回復させることにより、患者に観察される脳卒中プロセスを効果的に再現します10、11、12。当研究室では、ECAに損傷を与えることなくCCAからの再灌流を可能にする虚血性脳卒中モデルを開発しました。虚血の誘発に続いて、CCA の顕微手術修復が行われます。CCA血流の直接測定は行われませんでしたが、実験者は再灌流を進める前にCCAの血管脈動を観察しました。この技術は、患者の脳卒中プロセスによく似ながら、首の血管の解剖学的完全性を維持します。さらに、神経機能と脳虚血領域の評価により、この外科的アプローチによって誘発された脳卒中の妥当性が確認されました。

前述の虚血性脳卒中モデルは、さまざまな要因の影響を受ける可能性があります。Koizumi et al.4 による方法では、血液再灌流は CCA の結紮によりウィリス輪に大きく依存しています。ただし、脳血管系の変動は最終的な脳梗塞容積に影響を与える可能性があり、血液灌流が低いため脳卒中モデルの死亡率が増加する可能性があります13,14。さらに、ECA の虚血は顔の筋肉や神経の機能を損ない、さまざまな神経機能の評価に影響を与える可能性があります15,16。

現在の方法は、次の 3 つの重要なステップを通じてこれらの課題に対処します。(1) CCA 切開をできるだけ小さく保ち、フィラメント挿入に十分な大きさに保ち、血管縫合に伴う時間と損傷を軽減します。(2) シリコーン剥離や血栓症につながる可能性のある白色フィラメント先端のクランプを防ぐために、遠位 CCA をクランプするときは、微小血管クランプを CCA 分岐部にできるだけ近づけて配置します。(3) 血管修復後に正中線頸部切開部を縫合する前に、脈動が再開され、実質的な出血がないか CCA を観察します。

現在の方法にはいくつかの制限があります。まず、縫合部位に塞栓が形成される可能性があり、塞栓が剥がれるとさらなる脳虚血につながる可能性があります。このリスクは、将来の実験で慎重に検討し、管理する必要があります。第二に、この研究ではラットの体重を監視していなかったため、この方法が食物摂取量に影響を与えたかどうかを判断することが困難になりました。食物摂取量はこの方法の利点の直接的な指標であり、その評価は貴重な洞察を提供する可能性があります。最後に、現在の方法では顕微手術の技術的熟練度が必要であり、適切なトレーニングと専門知識がなければ、その広範な使用が制限される可能性があります。

要約すると、MCAo モデリング手法は高い生理学的関連性と構造的完全性を提供しますが、より堅牢な実験を行うには対処する必要がある制限があります。首の血管の解剖学的完全性を維持し、患者の脳卒中プロセスを厳密にシミュレートすることは、この方法の大きな強みです。このアプローチは間違いなく虚血性脳卒中の研究に大きく貢献し、実験モデルの信頼性と精度を向上させるでしょう。最終的には、これにより治療効果をテストするために必要な実験グループが減り、より信頼性の高い実験結果が得られる可能性があります。

開示事項

著者には、開示する潜在的な相反する利益はありません。

謝辞

この作業は、2023年に河北省外国情報導入プロジェクトの支援を受けました。この原稿の草稿の英語テキストを編集してくださったLiwen Bianji(Edanz)(www.liwenbianji.cn)のLisa Kreiner博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10%ホルマリン北京Labgic Technology Co.、Ltd.BL913A
11-0顕微手術用縫合糸Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3月8日 1回;
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)SIGMAT8877
3-0シルク縫合Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3-0
4%イソフルラン  天津玲浦生物科技有限公司 Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.
6-0シルク縫合糸波医療縫合針有限公司6-0
70%エタノール東Lierkang医療技術有限公司
フィラメントXinong Technologies Co Ltd.2838-A5
ケタミン  江蘇恒瑞製薬有限公司230613BL
雄 Sprague Dawley ラット済南 Pengyue 実験動物育種有限公司SCXK(Lu)20190003
マイクロクリップ上海Jinzhong医療機器工場W40150
顕微鏡ZEISSS100 OPMIピコ
看護ボックス北京Fuyi電器有限公司FYL-YS-100L
キシラジンSIGMAPHR3263
5糸 20221102寧山20230408

参考文献

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