細菌は、酸素と鉄のバイオアベイラビリティが異なる宿主組織にコロニーを形成しますが、細菌を研究するほとんどのアプローチでは、曝気されたリッチ培地を使用します。このプロトコルは、ヒトの病原体である エルシニア偽結核 をさまざまな鉄濃度と酸素張力の下で培養し、重要な病原性因子である エルシニア III型分泌システムの活性を定量化することを説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
多くのグラム陰性病原体の主要な病原性メカニズムは、細胞傷害性または免疫調節性エフェクタータンパク質を宿主細胞に移す針状の付属器であるIII型分泌システム(T3SS)です。T3SSは、細胞外からアクセス可能であり、非病原性細菌にはほとんど存在しないため、抗菌薬創薬キャンペーンの標的となっています。最近の研究では、 エルシニア 菌と サルモネラ 菌のT3SSは、哺乳類の感染時に遭遇する重要なニッチ特異的シグナルである鉄と酸素に反応する因子によって制御されていることが示されました。ここで説明するのは、 エルシニア偽結核の鉄飢餓の方法と、その後の無機鉄の任意の補充です。酸素の利用可能性の影響を評価するために、この鉄欠乏プロセスは、好気性および嫌気性の両方の条件下で実証されています。最後に、哺乳類の宿主温度である37°Cで培養物をインキュベートすると、T3SSの発現が誘導され、上清に放出されたエフェクタータンパク質を可視化することで 、エルシニア T3SS活性の定量が可能になります。ここで詳述する手順は、鉄飢餓がない場合の鉄キレート剤の使用よりも利点があり、これはおそらく効率的な エルシニア 鉄吸収および掃気システムによる堅牢な鉄飢餓を誘発するには不十分です。同様に、酸洗浄実験用ガラス器具は、強力な鉄飢餓を誘発するために不可欠な残留鉄を確実に除去するために詳細に説明されています。さらに、キレート剤を使用して培地から残留鉄を除去し、鉄の非存在下で細菌を数世代培養して細菌の鉄貯蔵を枯渇させることが記載されている。この手順では、トリクロロ酢酸誘導タンパク質沈殿、SDS-PAGE、および銀染色の標準プロトコルを組み込むことにより、T3SS活性を測定するためのアクセス可能な方法を示します。この手順は Y.偽結核 に最適化されていますが、同様の堅牢な鉄取り込みシステムを持つ病原体での研究のフレームワークを提供します。抗生物質耐性の時代では、これらの方法を拡張して、宿主に関連する条件下でT3SSを標的とする抗菌化合物の有効性を評価することができます。
概要
エルシニア、ビブリオ、エシェリヒア、シュードモナス、赤痢菌など、臨床的に重要な多くのグラム陰性病原体は、エフェクタータンパク質を宿主細胞に注入するためのIII型分泌系(T3SS)をコードしています1。多くの細菌種では、T3SSは厳格な規制管理下にあります2。例えば、Yersinia T3SSエフェクタータンパク質の標的細胞への転座は、宿主防御メカニズムを破壊し、宿主組織の細菌のコロニー形成を可能にするために重要です。しかし、エルシニアT3SS活性は代謝的に負担が大きく、宿主免疫受容体による認識を引き起こす可能性があります3。したがって、特定の環境手がかりを感知する制御因子は、多くの細菌種でT3SS遺伝子の発現を制御しています。エルシニアのような病原体は、感染サイクル中に重要な病原性因子の発現に影響を与える環境変化を経験するため、細菌性病原体が占める宿主ニッチの顕著な特徴を模倣した実験室条件を開発することが重要です。具体的には、酸素張力と鉄の利用可能性は、さまざまな組織部位間で時空間的に異なり、T3SS 4,5,6などの病原性遺伝子の発現に影響を与えます。したがって、この方法の目標は、酸素と鉄がエルシニアT3SSの発現にどのように影響するかを評価することです。これにより、宿主と病原体の相互作用のダイナミクスに関する洞察が得られます。
ここで説明する方法は、エルシニア偽結核を好気的および嫌気的に培養する方法、および好気性または嫌気性成長中にエルシニア鉄貯蔵を枯渇させる方法を詳しく説明しています。ここでは、これらの変動する条件下で細菌をうまく培養することに関して、いくつかの重要な考慮事項を強調しています。まず、嫌気性培養には追加のグルコース補給が必要であり、これは培地レシピに記載されている変更です。第二に、Y. pseudotuberculosisは、環境から鉄を強力に除去できるシデロフォアやその他の鉄取り込みシステムを採用しているため、培養培地と実験用ガラス器具に鉄ができるだけ含まれていないことを確認することに特別な注意が払われています7。これまでの研究では、ジピリジルなどの鉄キレート剤を使用して、リッチメディア細菌培養物から鉄を枯渇させ、鉄飢餓を模倣していました8,9。しかし、鉄飢餓を誘発するためにエルシニアの鉄貯蔵を枯渇させるには、ガラス製品やメディアに残っている鉄を取り除くだけでなく、鉄がない場合でも長期にわたって成長する必要があります。このプロトコルでは、ガラス器具とキレート媒体を酸性洗浄して残留鉄を除去する方法、さらにバクテリアを数世代にわたって培養して鉄を完全に飢餓状態にする方法を詳しく説明しています。鉄飢餓は、yfeAおよびbfdで示されているように、条件を問わず、十分に特徴付けられた鉄応答性遺伝子の相対的な転写レベルを測定することによって確実にすることができます。
このプロトコールの集大成は、培養上清をトリクロロ酢酸(TCA)で処理し、分泌されたタンパク質をSDS-PAGEを通じて視覚化することにより、これらの各条件から分泌されたT3SSエフェクタータンパク質を沈殿させる方法を示しています。最後に、銀染色によって分泌されたタンパク質を可視化し、 Yersinia 外部タンパク質(Yops)10と呼ばれるT3SSエフェクタータンパク質の相対レベルを定量化することにより、相対的なT3SS活性を評価する。
T3SS活性アッセイは、一般に特異的抗体を使用して、培養上清中のT3SSエフェクタータンパク質レベルを検出します。しかし、T3SSエフェクタータンパク質用のウェスタンブロッティング抗体は、市販されていないことが多いです。したがって、この方法でのT3SS活性の最終的な可視化には特定の抗体を必要とせず、代わりに銀染色を活用できるため、分泌されたすべてのタンパク質を可視化できるという特別な注意が払われています。この方法は 、Y. pseudotuberculosis(偽結核菌)に特化して最適化されていますが、他の細菌種にも適応させることができますが、正確な培地条件やインキュベーション時間は異なります。
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プロトコル
試薬、培地組成、プライマー配列、および装置の詳細は、 材料表に記載されています。 図1 は、実験の全体的なワークフローを示しています。
1.酸洗浄ガラス器具とキレートM9培地の調製
注:開始する前に、使用する正確な試薬とレシピについて、材料のセクションを参照してください。M9培地は、Cheng et al.11のYersinia T3SSアッセイに初めて使用されました。
- 100 mLの6 N HClを250 mLのガラスフラスコに注ぎます。
注意:HClは非常に危険です。本物質を取り扱う際には、適切な予防措置が講じられていることを確認してください。 - ガラス容器の口をガラス栓で密閉し、フラスコを1分間慎重に回転させて、HClを完全に分散させます。
- 6 N HClは適切に廃棄してください。
- 脱イオン化H2O100mLを加えてガラス容器をすすぎ、口を密閉し、20秒間振とうしてから水を捨てます。
- すすぎステップを合計3回繰り返します。
- 風乾させます。滅菌するためのオートクレーブ。
- キレート媒体をキレート化するには、M9成分をキレート試薬と混合し、マグネチックスターバーで室温で~18時間攪拌します。MgSO4 をフィルター滅菌し、最終濃度1 mMまで添加します。
2. Y . pseudotuberculosis の鉄分濃度と酸素濃度の変化下での培養
- Lysogeny Broth(LB)寒天プレート上でStreak Y. pseudotuberculosis (本研究ではIP2666pIB1株を使用)をインキュベートし、室温でインキュベートします。
注:エルシニアを37°Cでインキュベートすると、特に低カルシウム培地で、T3SS活性、増殖停止を引き起こし、最終的にはT3SS12をコードするエルシニアviルーレンス(pYV)のプラスミドの損失を選択します。したがって、このプロトコルでは、T3SS活性を測定する必要があるまで、Yersiniaの26°Cインキュベーションを使用します。 - 48時間後、コロニーが形成されると、0.2%グルコース、1mg / L FeSO4.7H 2Oを含むM9培地4 mLを接種し、単一の単離コロニーからカサミノ酸(ここではM9培地と呼ぶ)を補給し、26°Cで一晩培養し、250rpmで約18時間曝気します。
注意: 次の手順から始めて、次に進むと、酸で洗浄されたガラス器具を使用してください。 - 以下の手順に従って、キレート化されたM9メディアにサブカルチャーします。
注:後続のすべてのステップでは、標準の0.2%グルコースではなく、0.9%グルコースのM9培地を使用します。- 分光光度計を使用して、一晩培養した試料の光学密度(OD600)を測定します。
- 鉄を補給せずに、250 mLの酸洗浄フラスコに0.9%グルコースを含み、FeSO4.7H 2Oを含まない滅菌キレートM9培地の合計14 mLで、一晩培養物をOD600値0.1に希釈します。
- 250 rpmで曝気しながら、26°Cで8時間インキュベートします。
- 好気性培養と嫌気性培養への継代培養を並行して行います。
- 成長している文化のOD600 を測定します。
- 好気性インキュベーションを継続するには、250mLの酸洗浄フラスコで0.9%グルコースとFeSO4.7H 2Oを含まない滅菌キレートM9培地14mLで、成長培地をOD600値0.1まで継代培養し、鉄補給なしで26°Cで12時間曝気して培養します。
- 嫌気性培養の場合は、滅菌キレート化M9培地14mL中OD600 値0.1まで、酸洗浄ガラス管2本に継代培養します。最初のチューブに、フィルター滅菌済み(0.22 μmポリエーテルスルホン膜を使用)FeSO4.7H 2Oを加えて、最終濃度を1 mg / L(「高鉄」と呼びます)にします。2本目のチューブにFeSO4.7H 2Oを添加し、最終濃度を0.01 mg/Lにします(「低鉄」と呼びます)。これは、10 mg/mL FeSO4.7H 2Oストック溶液を使用して行うことができます。両方のチューブを嫌気性チャンバー内で室温で12時間嫌気的にインキュベートします。
注:1 mg/L FeSO4.7H 2Oは、エル シニア の堅牢な成長のための鉄を豊富に含む条件を提供します。逆に、嫌気性培養物に0.01 mg/L FeSO4.7H 2Oのみを添加すると、嫌気性条件下での十分な増殖が確保されますが、鉄飢餓反応は依然として可能になりますが、好気性培養物は、T3SS活性の刺激前に鉄飢餓反応を刺激する鉄が添加されていない状態で12時間増殖します。
- III型分泌系の活性を誘導します。
- 嫌気性培養物を37°Cにシフトし、嫌気性インキュベーションを4時間続けてT3SSを誘導します。
- 好気的に成長している培養物のOD600 を測定します。
- 2つの酸洗浄フラスコに、好気的に成長する培養物を、14 mLの滅菌キレート化M9培地でOD600値0.2まで継代培養します。第1フラスコにフィルター滅菌したFeSO 4.7H 2Oを加えて最終濃度を1 mg/Lに、第2フラスコにFeSO 4.7H2Oを加えて最終濃度を0.01 mg/Lにします。両方のフラスコを26°C、250 rpmで2時間曝気してインキュベートします。
- 2時間後、好気性培養物を250rpmで曝気して37°Cにシフトし、4時間インキュベートしてT3SSを誘導します。
3. T3SSエフェクタータンパク質のトリクロロ酢酸(TCA)沈殿
- 嫌気性インキュベーションが完了したら、培養物のOD600 を測定します。
- すべての嫌気性サンプルを正規化して、細胞量が等しくなります( 表1の例を参照)。嫌気性培養の場合、一般的にOD600 の値は、鉄が不足している培養物では~0.5、鉄分が豊富な培養物では~1であると予想されます。この場合、鉄飢餓培養物6mLと鉄補充培養物3mLを使用します。
注:残りの培養物は、全RNAの回収や定量的PCRを使用して標的mRNAの定常状態レベルを測定するなど、他の目的に使用できます(ここでは説明しません)。 - 各培養物の正規化された容量を15 mLチューブに移します。
- 分泌タンパク質沈殿の効率を制御するには、0.5 mg/mL のウシ血清アルブミン(BSA)を 4 μL 各チューブに加えます。
- ペレットを3200 x g で4°Cで15分間培養します。
- 0.22 μm PVDF フィルターを 10 mL シリンジに取り付け、ペレット化した各培養物の上清を新鮮な 15 mL チューブにろ過します。
注:このろ過ステップにより、サンプル中に不要な細胞質タンパク質が生じる可能性のある細菌細胞全体を移動させる可能性が最小限に抑えられます。 - 上清量6.1 N TCAの10%を各サンプルに加えます。
- 1分間激しく渦巻きます。チューブを氷上で4°Cの冷蔵室で一晩インキュベートします。
注:インキュベーションの期間は、必要に応じて最適化できます。わずか1時間のインキュベーションで、分泌が活発な条件や菌株に対応できます。 - 4時間のインキュベーションが完了したら、好気性培養物でペレット収集とTCA沈殿ステップを繰り返します。
注:同等の細胞量でボリュームをペレット化することにより、好気性培養物を正常化します。 - 各サンプル2 mLを新鮮な2 mLチューブに加え、21,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 真空アタッチメントを使用して上清を吸引し、チューブの底や側面に触れないように注意してください。
注:ペレットは視覚化が難しく、チューブの長さに沿ってかすみとして現れる場合があります。 - 各沈殿反応のすべての内容物が単一の2 mLチューブに沈殿するまで、ステップ3.10と3.11を繰り返します。これには3つまたは4つの連続した遠心分離ステップが必要な場合がありますが、各サンプルから分泌されたすべてのタンパク質を2 mLチューブに濃縮することができます。
- ペレットを洗浄するには、氷冷した100%アセトン1mLを各チューブにそっと加えます。サンプルの損失を防ぐため、再懸濁したり、チューブの側面に触れたりしないでください。
- サンプルを21,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、チューブの底や側面に触れないように注意してください。
- 氷冷アセトン洗浄手順3.13と3.14を繰り返します。
- 最後に上清を吸引した後、チューブを開き、ペレットをベンチで約1時間完全に乾かします。
- 各乾燥サンプルに50 μLのFSB:DTT溶液を加えます。タンパク質の損失を防ぐため、再懸濁しないでください。
- 各サンプルを1分間完全にボルテックスし、FSB:DTT溶液がチューブ全体の壁をコーティングすることを確認します。これは、一度に複数のチューブを保持できるボルテックスアタッチメントを使用することで最適化できます。
- サンプルを95°Cで15分間煮沸します。
- サンプルを室温で最高速度で30秒間短時間遠心分離します。
- 将来の使用まで-80°Cで保管してください。
4. SDS-PAGEと銀染色によるT3SSエフェクタータンパク質の可視化
- 各嫌気性サンプル15 μLおよび各好気性サンプル10 μLを12.5% SDS-PAGEゲルにロードし、市販の未染色標準物質3 μLをラダーとしてロードします。
- ゲルを100Vで約90分間泳がせます。これらの設定は、使用する機器によって異なる場合があります。
- 製造元の指示に従って銀染色プロトコルに従うと、 図2に示すようにゲルが得られます。
5. 相対的なT3SS活性の定量化
- ゲルをイメージングシステムに配置し、定量するすべてのバンドが画像フレーム内にあることを確認します。
注:BSAの分子量は~66 kDaで、T3SSエフェクタータンパク質YopEの分子量は~23 kDaです。 - ソフトウェアで、すべてのウェルのすべての YopEバンド を選択します。
- 参照 YopE バンドを適切なサンプルに設定します。
- ソフトウェアによって計算されたすべてのYopEバンドの相対定量値をエクスポートします。
- ソフトウェアに戻り、すべてのウェルのすべてのBSAバンドを選択します。
- 参照BSAバンドを設定して、参照YopEバンドと同じサンプルからのものであることを確認します。
- ソフトウェアによって計算されたすべてのBSAバンドの相対定量値をエクスポートします。
- YopEの相対発現レベルを計算するには、各サンプルのYopE相対量値をBSA相対量値で除算します。
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結果
この方法により、さまざまな条件で分泌されたヨップを、関心のある参照条件に対して相対的に比較できます。実験の全体的なワークフローを図1に示します。表1は、各培養条件のインスタンスで細胞培養の正常化が通常どのように起こるか、および各上清に添加されるTCAの量を示しています。ここでは、代表的な結果を野生型(WT)Y.偽結核IP2666pIB1と、ΔyscNUとΔyopEの2つのコンジェニック変異体を使用して示しています。ΔyopE変異体はYopEを欠くコントロールとして使用され、ΔyscNU変異体は機能的なT3SSを組み立てることができないため、完全なT3SSネガティブコントロールとして使用されます13,14。銀染色した12.5% SDS-PAGEゲルの代表的な画像を図2に示します。上述...
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ディスカッション
T3SSは、多くの病原性細菌にとって重要な病原性因子です。したがって、その制御を研究するための実験室技術を開発することは、病因を理解し、潜在的な治療法を開発するために重要です1。鉄と酸素は、細菌性病原体がT3SSの発現を調節するために感知する重要な宿主の手がかりであることが知られています5。したがって、この方法は、嫌気性または好気性の条件下で、鉄欠乏または補充を伴うY .偽結核 を培養するための戦略を提示し、分泌されたYopE T3SSエフェクタータンパク質レベルの相対量を評価することにより、これらの異なる条件下での相対的なT3SS活性を定量化する方法を示します。
この実験のワークフローは比較的単純ですが、結果を最適化するために綿密に考慮する必要がある点がいくつかあります。TCAを介したタンパク質沈殿ステップでは、タンパク質ペレットの吸引を避けることが重要です。これは見づらい場合があります。アスピレータ...
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開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
謝辞
BioRender.com を使用して作成されたグラフィック画像。この研究は、国立衛生研究所(www.NIH.gov)の助成金R01AI119082の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10 mL Luer-Lokチップシリンジ | BD | 301029 | |
| 10x SDSランニングバッファー | 0.25 M トリス塩基、1.92 M グリシン、1% SDS 1 L 容量 | ||
| 12.5% SDS-Page ゲル | 自家製 | ||
| 15 mL 培養チューブ | ファルコン | 352059 | 最初の一晩用 |
| 15 mL ファルコンチューブ | ファルコム | 352196 | 上清採取用 |
| 250 mL 培養フラスコ | Belco | 251000250 | |
| 500 mL フィルターシステム | コーニング | 431097 | |
| 6 N 塩酸溶液 | フィッシャーサイエンティフィ | 7732185 | |
| アセトン | フィッシャーケミカル | A949-4 | 4 L |
| バイオラッド ChemiDoc MP イメージングシステム | バイオラッド | モデル番号:ユニバーサルフードIII | |
| ホウケイ酸ガラス培養チューブ | フィッシャーブランド | 14-961-34 | 嫌気性培養用 |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-1253 | |
| Chelex M9 +0.9% グルコース培地 | 自家製 | 6 g/L Na2HPO4、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH4Cl、1%カサミノ酸、 0.9% デキストロース、0.0005% チアミン、5 g/L Chelex 100 樹脂。室温で18時間培地を撹拌し、500 mL Corningろ過ユニットを使用してろ過し、1 mM MgSO>4 <sub>を添加します MgSO | |
| 最終サンプルバッファー(FSB) | 自家製 | 0.1 M Tris-HCl、4% SDS、20% グリセロール、0.2% ブロモフェノールブルー | |
| FSB:DTTソリューション | ホームメイド | FSB+0.2M DTT | |
| イメージラボソフトウェア | バイオ・ラッド | https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z | ソフトウェア |
| Isotemp ヒートブロック | フィッシャーサイエンティフィック | 88860021 | |
| LB寒天プレート | ホームメイド | 10 g トリプトン、5 g酵母抽出物、10 g NaCl、15 g 寒天、総容量1 L。オートクレーブ | |
| M9+0.2% グルコース培地 | ホームメイド | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4、1 mg/L FeSO47H2O、1%カサミノ酸、0.2% dextrose、0.0005% チアミン | |
| シリンジ用Millex-GP PES 0.22umフィルターアタッチメント | Millipore | SLGPR33RS | FeSO47H2Oろ過用 |
| Millex-GV PVDF 0.22umシリンジ用フィルターアタッチメント | Millipore | SLGVR33RS | 上清ろ過用 |
| Precision Plus Protein 未染色 標準 | Bio Rad | 1610363 | |
| SDS-PAGEゲル装置 | Bio Rad | 型式番号:ミニプロティアンテトラセル | |
| SilverXpressシルバーステインキット | Invitrogen | LC6100 | |
| The BellyDancer Shaker | IBI Scientific | BDRAA1155 | |
| Trichloroacetic acid solution 6.1N | Sigma Aldrich | T0699 | |
| ビニール嫌気性チャンバー | Coy Lab 製品 | ||
| https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#detailsqPCR Primer sequences | |||
| yfeA フォワード - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T | |||
| yfeA リバース - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A | |||
| bfd フォワード - ccagcatcagccccatacag | |||
| bfd リバース - tggcttgtcggatgcacttc | |||
| yopE フォワード - CCATAAACCGGTGGTGAC | |||
| yopEリバース - CTTGGCATTGAGTGATACTG |
参考文献
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