脂質ヒドロペルオキシド含有量は、フェロトーシス細胞死の最も一般的に使用される指標です。この記事では、フェロトーシス誘導時の細胞内の脂質ヒドロペルオキシド含有量のフローサイトメトリーの段階的な分析について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
鉄と酸素の相互作用は、地球上の生命の発達に不可欠な部分です。それにもかかわらず、このユニークな化学は魅了され、困惑し続け、新しい生物学的ベンチャーにつながります。2012年、コロンビア大学のグループは、この相互作用が「フェロトーシス」と呼ばれる新しいタイプの制御細胞死につながる中心的なイベントであると認識しました。フェロトーシスの主な特徴は、(1)機能不全の抗酸化防御および/または(2)圧倒的な酸化ストレスによる脂質ヒドロペルオキシドの蓄積であり、これは最も頻繁に細胞内の遊離不安定鉄の含有量の増加と一致します。これは通常、シスチントランスポーターxCT、グルタチオン(GSH)、およびGSHペルオキシダーゼ4(GPx4)を含む標準的な抗フェロトーシス軸によって防止されます。フェロトーシスはプログラムされたタイプの細胞死ではないため、アポトーシスに特徴的なシグナル伝達経路は関与しません。このタイプの細胞死を証明する最も一般的な方法は、親油性抗酸化物質(ビタミンE、フェロスタチン-1など)を使用して細胞死を防ぐことです。これらの分子は、原形質膜の酸化的損傷に接近し、解毒することができます。フェロトーシスの表現型を明らかにする上でのもう一つの重要な側面は、特定の色素BODIPY C11が使用される脂質ヒドロペルオキシドの先行蓄積を検出することです。本稿では、エラスチン、RSL3、鉄供与体などのさまざまな誘導物質を使用して、野生型髄芽腫細胞でフェロトーシスを誘導する方法を示します。同様に、NACの存在下で増殖し、NACが除去されるとフェロトーシスを受けるxCT-KO細胞が使用されます。特徴的な「バブリング」表現型は、フェロトーシスが引き起こされた瞬間から12〜16時間以内に光学顕微鏡で見ることができます。さらに、PI染色法を使用して脂質ヒドロペルオキシドの蓄積とその結果としての細胞死を示すためのBODIPY C11染色とそれに続くFACS分析が使用されます。細胞死のフェロトーシス特性を証明するために、フェロスタチン-1 は特定のフェロトーシス予防剤として使用されます。
概要
フェロトーシスは、新たに状況化された活性酸素種(ROS)依存型の細胞死1です。ROSに加えて、鉄はこのタイプの細胞死において重要な役割を果たしているため、2という名前が付けられています。フェロトーシスの最終的かつ実行的なステップは、鉄触媒による脂質の酸化的損傷の細胞膜への蓄積であり、最終的には膜の完全性と選択的透過性の低下、そして最終的にはバブリングによる細胞死につながります。脂質のヒドロ過酸化イベントは自然に発生する現象です。しかしながら、細胞膜全体へのその伝播は、細胞の抗酸化防御によって妨げられる。この文脈での主要なプレーヤーは、Se-タンパク質グルタチオンペルオキシダーゼ4(GPx4)であり、膜に接近して脂質ヒドロペルオキシドを毒性の低いアルコール誘導体に変換することができます3。GPx4の還元力は、主に非必須アミノ酸(グリシン、グルタミン酸、システイン)で構成されるトリペプチドであるグルタチオン(GSH)によって提供されますが、これに限定されません。GSHの生合成のための律速アミノ酸はシステイン4です。システインは非必須アミノ酸として分類されますが、その必要量は、増殖性の高い細胞(がん細胞など)では容易に内部産生を超える可能性があります。したがって、半必須アミノ酸のグループに再分類されました。システインの必要な輸入は、主にXc-システ....
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プロトコル
本研究は、DAOY野生型(WT)髄芽腫細胞株を用いて実施され、これを37°Cで培養し、5%CO2 含有DMEM培地に8%FBSを添加した。xCT欠失細胞株は、1 mM N-アセチルシステイン(NAC)を添加した培地で実験を行い、同じ条件下で維持しました。細胞は、市販のマイコプラズマ検出キット( 材料表を参照)を使用してマイコプラズマについて定期的にスクリーニングされ、10継 代目まで培養されました。
1. 細胞の収穫と播種
注:すべてのステップは、組織培養層流フードで滅菌無菌技術を使用して実行されます。DAOY髄芽腫細胞は接着性であり、Ca2+ およびMg2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄することにより、付着していないすべての細胞を廃棄できます。
- 細胞の入ったストックディッシュ(シャーレ、直径100mm)を取り、アスピレーターを使用してプレートから浮遊細胞と培地を取り除きます。
- 皿に5〜10 mLのPBSを追加し、皿の円を描く動きで底を洗い、吸引器を使用してPBSをプレートから取り出します。
- トリプシン1mL(10倍希釈)を皿に加えます。プレートを軽くたたくと細胞が取り除かれるまで、プレートを....
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ディスカッション
フェロトーシス細胞死の主な特徴は、原形質膜における脂質ヒドロペルオキシドの制御不能な蓄積です。この酸化的損傷は、酵素的または非酵素的な方法で発生する可能性がありますが、いずれの場合も、反応は鉄依存性/触媒性であり、これがこのタイプの細胞死の名前を説明しています。脂質のヒドロペルオキシドは、4-ヒドロキシ-2,3-トランス-ノネナール(4-HNE)やマロヌアルデヒド(MDA)などの脂質ヒドロパーオキシドの分解生成物を測定することで間接的に推定されることがよくあります。これらの生成物は、多価不飽和脂肪酸の過酸化分解によって生成され、さまざまな高分子と反応し、神経変性疾患、糖尿病、慢性心不全など、さまざまな病状を引き起こす可能性があります。それにもかかわらず、これらは過酸化イベントの結果であり、優れた脂質ヒドロペルオキシド特異的プローブの開発に多大な努力が払われてきました。
頻繁に使用されるプローブの1つはBODIPY 581/591 C11ですが、これにも考慮すべき欠点があります。具体的には、BODIPY 591/581蛍光色は、還元状態(590 nm)と酸化状態(510 nm)の2つ.......
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開示事項
私たちは、ここに提示された研究について利益相反を宣言しません。
謝辞
この活動は、モナコ公国政府、GEMLUC(Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer)、フラヴィアン財団の支援を受け、BD FACS Melodyの購入手段を提供しました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| クエン酸フェロアンミニウム | Acros Organics 211842500 | ||
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| 胎児ボビン血清 (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase 細胞解離試薬 | サーモフィッシャー | 11599686 | |
| N-アセチルシステイン | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest マイコプラズマ検出キット | InvivoGen | rep-pt1 | |
| ヨウ化プロピジウム | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| トリプシン - EDTA 10X - 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
参考文献
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-depende....
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