方法論記事

血小板中のスーパーオキシドアニオン生成を検出するための代替法

DOI：

10.3791/66647

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2024年3月29日

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1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

スーパーオキシドアニオンの生成は、血小板の刺激に不可欠であり、調節不全の場合、血栓性疾患にとって重要です。ここでは、スーパーオキシドアニオンの選択的検出と酸化還元依存性血小板調節の研究のための3つのプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

活性酸素種(ROS)は、非常に不安定な酸素含有分子です。化学的に不安定であるため、非常に反応性が高く、タンパク質、核酸、脂質などの重要な生体分子と反応する能力があります。スーパーオキシドアニオンは、分子状酸素の還元(すなわち、1つの電子の獲得)によって生成される重要なROSです。最初は老化、変性、および病原性のプロセスにのみ関与しているにもかかわらず、最近、重要な生理学的応答への関与が明らかになりました。血管系では、スーパーオキシドアニオンが血管平滑筋細胞の分化と機能、血管新生における血管内皮細胞の増殖と移動、免疫応答、および止血における血小板の活性化を調節することが示されています。スーパーオキシドアニオンの役割は、血小板の調節不全や、がん、感染症、炎症、糖尿病、肥満など、さまざまな症状に関連する心血管合併症において特に重要です。したがって、ヒト血小板によるスーパーオキシドアニオンの生成を効果的に測定し、止血と血栓症のバランスを調節する酸化還元依存性メカニズムを理解し、最終的には血栓症や心血管合併症につながる血小板応答の調節のための新しい薬理学的ツールを特定できることは、心血管研究において非常に重要になっています。この研究では、血小板中のスーパーオキシドアニオンの検出と、止血と血栓症を調節する酸化還元依存性メカニズムの研究に成功した3つの実験プロトコルを紹介します:1)フローサイトメトリーによるジヒドロエチジウム(DHE)ベースのスーパーオキシドアニオン検出。2)DHEベースのスーパーオキシドアニオンの可視化と単一血小板イメージングによる分析。3)電子常磁性共鳴(ESR)による血小板中のスーパーオキシドアニオン出力のスピンプローブベースの定量化。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

スーパーオキシドアニオン(O2•-)は、血小板1で生成される最も機能的に関連性のあるROSです。O2•-は、分子状酸素の還元と多くの異なるROS 2の前駆体の産物です。O2•-の不整化は、水溶液中での自発的な反応またはスーパーオキシドジスムターゼ(SODs3)によって触媒される反応を介して過酸化水素(H 2 O2)の生成につながります。キサンチンオキシダーゼ4、リポキシゲナーゼ5、シクロオキシゲナーゼ6、一酸化窒素シンターゼ7など、さまざまな酵素源が提案されていますが、ミトコンドリア呼吸8,9およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ(NOX)10は、真核細胞におけるスーパーオキシドアニオンの最も顕著な供給源です。これは血小板にも当てはまるようで、ミトコンドリア呼吸からの電子漏れ11,12とNOXの酵素活性13,14がスーパーオキシドアニオン出力の主な寄与者として説明されています。

いくつかの研究はO2•-による血小板の調節に焦点を当てていますが、原因となる分子メカニズムについてはコンセンサスがありません。直接酸化とジスルフィド結合形成による表面受容体活性の調節は、さまざまな血小板受容体に対して提案されています。システイン残基の直接酸化によるROSによるインテグリンαIIbβ3の正の調節が示唆されています15,16,17。同様に、コラーゲンに対する血小板応答は、ジスルフィド依存性二量体化とそれに伴う糖タンパク質VI(GPVI)の二量体化18に依存するため、実験的に完全に証明されていないが、ROS依存性酸化による受容体活性増強が提案されている19。最後に、ROSによる糖タンパク質Ib(GPIb)のスルフヒドリル基の酸化は、炎症中の血小板接着と血小板-白血球相互作用を促進することが示されました20。逆に、スルフヒドリル基の酸化および受容体活性化の減少の結果として考えられるものとして、GPVIおよびGPIbの両方のエクトドメインの脱落は、条件21を減少させることによって減少する。

血小板表面受容体の直接酸化とは無関係の作用機序も提案されています。ROSは、O2•-を含み、Srcホモロジー領域2含有タンパク質チロシンホスファターゼ2(SHP-2)の活性を弱めることにより、コラーゲン受容体GPVIを正に調節することが示されています。これは、この受容体22のシグナル伝達カスケードを負に調節します。さらに、O2•-は、通常はNO感受性グアニルシクラーゼ(NO-GC)を介して血小板を阻害する一酸化窒素(NO)との迅速な反応と、負の血小板調節因子サイクリックGMP(cGMP)の生成により、ONOO-(ペルオキシ亜硝酸塩)を生成することができます23,24。その結果、NOレベルが低下すると、血小板の増強につながる可能性があります。あるいは、NOX2によるO2•-の生成は、血小板の活性化と接着に必須の脂質過酸化とイソプロスタン形成に寄与することが示唆されている25。最後に、血小板26の酸化還元ストレスセンサーとして提案されたプロテインキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の細胞外シグナル調節キナーゼ5(ERK5)は、O2•-によって活性化され、血小板の凝固促進表現型を誘導する(フローサイトメトリーに基づくホスファチジルセリンの外部化測定によって推定される)27。

血小板におけるO2•-および他のROS生成の調節不全は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、肥満、および癌に関連する血栓性心血管合併症につながる誇張された止血反応と関連しています28,29。これらの病理学的設定では、血小板によるROS出力が増加し、それがそれらの接着性および凝集性応答の増強につながります。血小板反応への影響に加えて、血小板のフリーラジカル出力は、他の血液細胞や血管構造に影響を与える可能性があり、これは心血管の健康の十分に理解されておらず、十分に調査されていない領域です30。酸化ストレスと血栓性疾患を結びつける分子メカニズムについての理解は限られていますが、抗酸化物質が心血管疾患に対する防御に臨床的に関連性があることは、かなりの注目を集めています。血漿抗酸化物質のレベルは、心血管疾患を発症するリスクと逆相関することが示されており、食事による抗酸化物質の摂取は冠状動脈疾患から保護することが示されています31,32。その結果、食事性抗酸化物質の使用は、心血管疾患予防の有望なアプローチとして提唱されてきました33,34,35。血小板でのROS生成の影響の中で、アポトーシスの増加は重要な病態生理学的影響を及ぼし得る36,37。全体として、血小板によるO2•-出力を検出および定量するための信頼性の高いプロトコルは、心血管研究においてますます重要性が高まっています。

現在、ROSの検出に利用可能な技術には、特異性(すなわち、検出された酸化分子の化学的性質が不明)および信頼性(すなわち、生体分子および実験試薬との望ましくない相互作用が偏った非生理学的結果につながる)の重要な制限がある38,39。血小板中のROSの検出に最も一般的に使用されるアプローチは、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFDA)の使用に基づいており、これは細胞内エステラーゼによってジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)に変換され、その結果、ヒドロキシルラジカルおよびペルオキシダーゼ-H2O2中間体40,41を含む細胞酸化剤によって高蛍光ジクロロフルオレセイン(DCF)に変換されます.その広範な使用にもかかわらず、細胞内ROSの測定のためのこのアプローチの信頼性に関して深刻な疑問が提起されています38。DCFHのDCFへの酸化は、実際には、ROS42の代わりに遷移金属イオン(Fe2+など)またはヘム含有酵素(シトクロムなど)によって誘導される可能性があります。さらに、DCFDAは、細胞ペルオキシダーゼによってそのセミキノンフリーラジカル型(DCF•-)に変換され、それが次に分子状酸素(O2)との反応によりDCFに酸化され、O2•-が放出され、酸化応答の人工的な増幅につながる41,43,44.したがって、DCFDAによる細胞内ROSの検出は、初期の洞察を得るのに有用であるが、慎重な検討と広範な実験的制御が必要である38,39。

この研究では、血小板機能O2•-1の主要な調節因子の検出と測定のための3つの代替技術を紹介します。最初の手法は、DHEとフローサイトメトリーを使用した検出であり、DCFDAよりも信頼性と特異性に利点があります。ここで提案されている2つ目の手法もDHEを利用していますが、検出方法は生血小板蛍光イメージングであり、血小板シグナル伝達によるO2•-の生成を高速な速度論と単一細胞分解能で研究することができます。最後に、ESR共鳴実験におけるヒドロキシアミンスピンプローブ1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン(CMH)の使用に基づくプロトコルは、血小板によるO2•- 生成の速度を定量化し、異なる条件で比較する可能性を提供します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

同意したボランティアからの末梢血の採取は、地元の倫理委員会と国民保健サービス保健研究局によって承認されています(REC参照:21 / SC / 0215;IRAS ID: 283854).

1. 方法1:フローサイトメトリーによるDHEを用いたスーパーオキシドアニオン検出

  1. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  2. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  3. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  4. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  5. 得られた血小板ペレットを、2 x 108 platelets/mL の密度で、修飾チロード緩衝液 (145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3) (37 °C) に再懸濁します。
  6. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  7. ジメチルスルホキシド(DMSO)にDHEをストック濃度5 mMで調製します。
  8. 最終濃度5 μMで血小板懸濁液にDHEを添加し(ストック溶液を1〜1,000に希釈し、最終DMSO濃度0.1% v/v)、37°Cで15分間インキュベートします。
  9. 刺激の15分間前に、血小板を薬理学的薬剤および/またはROSスカベンジャーで処理し、目的の生理学的刺激と濃度(例:.、0.1ユニット/ mLトロンビンまたは3μg/ mLコラーゲン)。.
  10. 刺激後、血小板懸濁液1〜10を氷冷改変HEPES緩衝液で希釈します。
  11. フローサイトメトリーでは、側方散乱(SSC)と前方散乱(FSC)のゲインをそれぞれ40 mVと220 mVに設定し、対数スケールの散布図を使用して懸濁液中の粒子集団を可視化します( 図1Aの例)。
  12. (オプション)抗CD41抗体を使用して血小板懸濁液の1アリコートを免疫染色し、血小板に対応するイベントの集団を同定します( 図1Bの例)。
  13. 405 nmの励起(紫色レーザー)と580 nmの波長での発光を使用してフローサイトメトリーでサンプルを分析し、スーパーオキシドアニオン特異的生成物である2-ヒドロキシ-エチジウム(2OH-Et+)を選択的に検出します(図2)。
    注:パラホルムアルデヒドによる固定およびサンプルの長期保存はお勧めできません。

2. 方法2:DHEを用いたスーパーオキシドアニオン検出、単板蛍光イメージング

  1. 実験当日に、ウマ腱由来の0.1 mg/mLフィブリルコラーゲンI(ホルムコラーゲン)、0.2 mg/mLフィブリノーゲン、または1 mg/mLポリ-L-リジン(PLL)を修飾チロード緩衝液中で8ウェルμスライドに37°Cで2時間塗布します。
  2. 改質タイロード緩衝液で2回洗浄します(各10分)。
  3. 非特異的接着をクエンチするには、修飾チロード緩衝液と5 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を最低30分間(または実験まで)インキュベートします。
  4. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  5. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  6. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  7. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  8. 得られた血小板ペレットを改変チロード緩衝液(145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3)(37°C)に4 x 107 血小板/mLの密度で再懸濁します。
  9. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  10. ジメチルスルホキシド(DMSO)にDHEをストック濃度10 mMで調製します。
  11. 最終濃度10 μMのDHEを血小板懸濁液に添加し(ストック溶液を1:1,000に希釈し、最終DMSO濃度0.1% v/v)、1分間(37°C)インキュベートします。
  12. DHEとの1分間のインキュベーション後、選択したウェルからブロッキング溶液を取り出し、イメージングの準備が整った顕微鏡ステージにμスライドを配置し、血小板を穏やかに分注します。
  13. 40倍油浸レンズで10秒ごとに画像を収集し、10分間(405/580 nm ex/em)の逆共焦点イメージングにより、DHEの2OH-Et+への変換を監視します。
  14. (オプション)PLLでコーティングされたウェルの場合、水溶性アゴニスト(0.1 unit/mLトロンビンまたは3 μg/mLコラーゲンなど)に応答するスーパーオキシドアニオン生成をモニタリングし、ステップ2.13で説明したように、血小板分注の10分後にアゴニストを添加し、さらに10分間蛍光画像収集を行います。
  15. (オプション)必要に応じて、スーパーオキシドアニオンスカベンジャーまたは選択的阻害剤(NOX阻害剤など)を、時間経過中にウェルの側面に穏やかに分注して追加し、2.13に記載されているようにさらに10分間蛍光画像を収集します。
  16. 代表的な単一血小板を含む 関心領域(ROI) を選択し、イメージングスイートImageJ 1.53t の測定ツールを使用して異なる フレームの蛍光強度を分析することにより、シングルセル蛍光分析を定量化します。

3. 方法3:電子常磁性共鳴(ESR)を用いた血小板によるスーパーオキシドアニオンの検出

  1. クエン酸ナトリウム溶液(47°C)を予熱し、1:7(0.5%w / v最終)の比率で静脈穿刺時に血液に直接添加することにより、抗凝固剤として使用します。
  2. 中央の肘静脈静脈穿刺によって健康なボランティアから末梢ヒトの血液を採取します。
  3. 全血から多血小板血漿(PRP)を、200 x g で20分間の最初の遠心分離ステップにより取得します。
  4. 可逆的血小板阻害剤であるインドメタシン(10 μM)およびPGE1(40 ng/mL)を使用して、PRPを500 x g で10分間遠心分離します。
  5. 得られた血小板ペレットを改変型チロード緩衝液(145 mM NaCl、2.9 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、5 mM グルコース、pH 7.3)(37 °C)に2 x 108 血小板/mLの密度で再懸濁します。
  6. 単離後、血小板を37°Cで30分間休ませます。
  7. 5 μM ジエチルジチオカルバメート (DETC) と 25 μM デフェロキサミンを血小板懸濁液に加えます。
  8. インキュベーションせずに、200 μM 1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン(CMH)を添加します。
  9. アグリゲーションキュベット(テフロンコーティングされた攪拌磁石を含む)内のアグリゴメーターにサンプルをロードします。
  10. 1分後、目的の濃度で刺激を加えます(例:1ユニット/mLトロンビンまたは3μg/mLコラーゲン)。10分間インキュベートします。
  11. (オプション)異なる時点でのスーパーオキシドアニオン生成を得るには、目的の時間にステップ3.12に進みます。
  12. 血小板懸濁液を凝集キュベットから微量遠心チューブに移し、6,000 x g で10秒間迅速にスピンダウンします。
  13. 上清50μLをキャピラリーマイクロピペットにロードし、ESRシーリングワックスでシールします。
  14. サンプルをESRスキャナーに移します。
  15. ESRスキャナーを次のように設定します:センターフィールド3,492.5 G、フィールドスイープ60 G、変調振幅2 G、スイープ時間10秒、スキャン数10、マイクロ波周波数9.39 GHz、マイクロ波電力20 mW、変換時間327.68 ms、時定数5242.88 ms。
  16. 上記のパラメータを使用して、記録された ESR ピークの曲線下面積 (AUC) として CMH 酸化を CM● に推定します。
  17. ステップ 3.16 で測定した ESR 強度を Y 軸に、市販の CM● の濃度を X 軸にプロットする検量線を作成します (例: 0、0.3、1、3、10、30 μM)。
  18. 試料中のCM● 濃度から、試料中の血小板が生成するスーパーオキシドアニオンの量を、代表結果セクションに記載の式を用いて求めます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DHE蛍光のフローサイトメトリー検出では、休止状態(図3A)または0.1ユニット/mLトロンビンで刺激した血小板(図3B)の代表的な結果を示します。O2•- 出力は、0.1 unit/mLトロンビン(図3C)または3 μg/mLコラーゲン関連ペプチド(CRP)(図3D)による刺激で示されているように、血小板平均蛍光強度(MFI)として定量化されました。血小板刺激の結果として、DHE染色の2倍/3倍の増加が観察されました。O2•- が測定されることを確認するために、細胞透過性のO2•- スカベンジャーペグ化スーパーオキシドジスムターゼ(PEG-SOD、100単位/ mL)の使用を提案し、O2•- の発生源を特定するためにNOX阻害剤VAS2870(10μM)を使用しました。コラーゲンとトロンビンの両方について、PEG-SODとVAS2870は血小板の活性化によって引き起こされるDHE蛍光の増加を消失させ、測定がO2•- に特異的であり、これらの条件下でのそれらの供給源がNOX酵素であることが確認されました。

DHE蛍光のイメージング検出については、コラーゲンまたはフィブリノーゲンへの接着の瞬間(および次の10分)でのO2•- の生成を評価する実験からのデータ(図4A)またはトロンビンによる刺激によりPLLに接着した血小板からのO2•- の生成を評価することを目的とした実験(図4B)のデータを示します。予想通り、PLLへの接着はO2•-の堅牢な生成を引き起こさない。おそらく、この形態の接着は、シグナル伝達応答45の開始を伴わない静電相互作用に依存しており、このアプローチが可溶性アゴニストの添加に対するO2•− 出力を測定するのに適しているからである。このプロトコルがO2•-の検出を可能にすることを確認するために、スカベンジャーまたは選択的阻害剤のいずれかを利用することができます。我々は、これらの実験において、N-アセチル-システイン(NAC)がO2•- を除去し、血小板蛍光を消失させることができることを以前の研究で示してきた46。ここでは、選択的NOx阻害剤が、コラーゲンまたはフィブリノーゲンに付着する血小板(図4A)またはトロンビンに応答する血小板(図4B)の蛍光を効果的かつ即座に軽減するVAS2870を示します。これは、これらの実験条件でNOXがO2•- の発生源であることを示唆しています。PLLに付着した血小板のコラーゲンやフィブリノーゲンへの接着、トロンビンによる刺激に応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画を、 それぞれ補足ファイル1、 補足ファイル2、 補足ファイル3として収録しています。注目すべきは、PEG-SODは、O2•- スカベンジャーとして他の実験設定で成功裏に使用されてきましたが、このタイプの実験では効果的ではありません。現時点では、これについて明確な説明はありません。PEG-SODは、イメージングベースのアッセイでO2•- が蛍光の増加を誘導する細胞コンパートメントに到達すると仮定できますが、効率が悪いか、速度が遅いかのどちらかです。この点を明確にするためには、さらに焦点を絞った調査が必要となるかもしれません。

私たちは、以前に発表されたさまざまな研究1,13,47,48,49,50で血小板中のESRによるO 2•-の測定を適用しました。この手法の重要なステップは、市販のCM●(すなわち、スピンプローブCMHとO2•-との間の反応とESRによって測定された共鳴種との間の反応の積)を使用した検量線の作成です。CMHとO2•-の反応を図5Aに、異なる濃度のCM●によって誘発されるESRシグナルの代表的な例を図5Bに示します。さまざまなCM●濃度のデータを使用して、酸化されたCMHの量とサンプル中のESRシグナル強度との間の線形相関を示す検量線を作成しました(図5C)。以下の式は、CM●濃度とESR信号強度の相関関係を表しており、この研究の実験の検量線の計算の出発点です(式1)。

figure-results-1

CM● 濃度とそれに対応するESR強度の両方を実験的に取得したため、検量線の 傾き と Y軸切片 を計算できます。 図 5C に示す例では、 傾き = 1,002,169、 切片 = 596,383 です。したがって、検量線の式は次のように書き直すことができます。

figure-results-2

上記の式を並べ替えると、ESR強度値に基づいて、さまざまなサンプルのCM● 濃度を計算できます(式2)。

figure-results-3

サンプル中のCM● の濃度がわかったら、以下の式(式3)で血小板あたりの生成速度と単位時間を計算することができます。

figure-results-4

式 2 を使用すると、式 3 は次のように書き直すことができます (式 4)。

figure-results-5

図 5C に示す例では、次のように書き換えることができます。

figure-results-6

CMH酸化速度は、血小板毎分生成されるCM●のアトモルとして表されます。この値は、実験とドナー間のO2•-生成速度を比較するために使用できますが、これはDHE(またはDCFDA)のような蛍光プローブでは不可能です。蛍光プローブは一般に、同じ実験内での蛍光強度の変化として、O2•-生成に対する異なる条件の影響の推定のみを許可します。この記事で説明したすべての手法について、検出の特異性は、ROSスカベンジャー(PEG-SOD、NACなど)またはスーパーオキシドアニオンを生成する酵素の選択的阻害剤(NOXを阻害するVAS2870など)で確認されました。ここでは、トロンビン(図6A、C、E)またはコラーゲン(図6B、D、F)による血小板刺激(図6)のデータを示します。両アゴニストについて、PEG-SODを用いてO2•-が検出されることを確認しましたが、PEG-カタラーゼ(PEG-Cat.)に対する効果の欠如は、この手法では過酸化水素が検出されないことを示唆しています(それぞれ図6C、D)。VAS2870は、トロンビン-(図6E)およびコラーゲン誘導性(図6F)のESRシグナルを廃止し、NOXがこれらのアゴニストの両方に対して血小板O2•-の主な供給源であることを示唆しています。

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図1:血小板懸濁液のフローサイトメトリー解析 (A)単離された血小板のフォワード(FSC)プロットとサイドスキャタリング(SSC)プロットの典型的な表示。(B)抗CD41抗体による血小板懸濁液の免疫染色により、調製物中の粒子の>98%が血小板であることが確認される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:DHEとスーパーオキシドアニオンなどのROSとの化学反応、および生成物のスペクトル特性。 DHEとその2つの酸化生成物であるスーパーオキシドアニオンとの反応によって生成される2-ヒドロキシエチジウム(2OH-Et+)と、他の種類のROS(ヒドロキシラジカルや過酸化水素など)との反応によって生成されるエチジウム(Et+)の構造とスペクトル特性。図で青い破線の長方形で強調表示されている405nmの励起ピークは、2OH-Et+に特異的であるため、O2•-の検出/測定に使用できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:DHEおよびフローサイトメトリーによって検出されたトロンビンおよびコラーゲン依存性スーパーオキシドアニオン生成。 (A)安静時血小板および(B)トロンビン刺激血小板のDHE染色の代表的なヒストグラム。このバーは、500未満のDHE染色値を示しており、安静時血小板とトロンビン刺激血小板でそれぞれ70.7%と16.1%です。この手法を利用して、(C)0.1 unit/mL トロンビンおよび (D)3 μg/mL コラーゲン刺激血小板におけるスーパーオキシドアニオン生成を推定しました。この実験では、PEG-SOD(100 unit/mL)を使用してスーパーオキシドアニオンの測定を確認し、10 μM VAS2870を使用してスーパーオキシドアニオンの供給源としてNOX酵素を特定しました。各データポイントは、50,000血小板からの平均蛍光強度(MFI)として計算され、各実験は5回独立して繰り返され(n = 5)、平均±SEMがグラフに示されました。統計的有意性は、ペアワイズ比較のためのテューキー事後検定による一元配置ANOVAによって評価されました(** = p < 0.01、*** = p < 0.001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:DHE蛍光イメージングにより検出されたコラーゲン、フィブリノーゲン、およびトロンビン依存性スーパーオキシドアニオン生成 (A)コラーゲンまたはフィブリノーゲンのいずれかに付着する血小板について、スーパーオキシドアニオン生成速度を評価した。血小板は、イメージング開始から1分後にコーティングされたμスライド上に分注し、画像収集開始から5分後に10μMのVAS2870を追加しました。(B)トロンビンによる刺激による血小板のスーパーオキシドアニオン生成速度。血小板は、画像収集の開始前に10分間、PLLコーティングされたμスライドに接着させました。2分後、0.1ユニット/mLのトロンビンを添加し、さらに5分後に10μMのVAS2870を添加しました(すなわち、イメージング開始から7分後)。実験スキームはパネルの上部に表示され、0分、1分、3分、6分、および9分の代表的な画像がパネルの中央に表示されます。パネルの下部に単血小板DHE蛍光定量が示されており、ImageJを使用した蛍光強度分析によって取得されました。データは、4つの独立した実験で条件ごとに8〜12血小板からのSEM±平均です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:検量線とCMH酸化速度の計算 (A)CMHとCM●の化学構造とESR特性。(B)CM●の濃度(100 nM〜10 μM)の異なるESRデータの代表例。(C)EPR強度とCM●濃度の検量線。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-12
図6:トロンビンまたはコラーゲン刺激による血小板によるスーパーオキシドアニオン産生の検出。スーパーオキシドアニオン出力は、(A)0.1 unit/mL トロンビンまたは (B)3 μg/mL コラーゲンのいずれかで刺激された血小板中のスピンプローブ CMH を用いて ESR によって測定しました。(C、D)100 単位/mL のスーパーオキシドアニオンスカベンジャー PEG-SOD または 100 単位/mL の過酸化水素スカベンジャー PEG 化カタラーゼ (PEG-Cat.) の濃度を、両方のアゴニストについて試験した条件に含めました。スーパーオキシドアニオンの発生源は、NOX阻害剤VAS2870(10μM)との共インキュベーションによって調査されました。(E)トロンビンと(F)コラーゲンはどちらも、スーパーオキシドアニオンの生成をNOx活性に依存しています。図全体を通して、CMH/スーパーオキシドアニオン反応速度は、原稿に記載されているように、ESRトレースから計算されました(式4)。データは、5 (C,D) および 4 つの独立した実験 (E,F) からの SEM ±平均です。統計的有意性は、ペアワイズ比較のためのテューキー事後検定による一元配置ANOVAによって評価されました(** = p < 0.01、*** = p < 0.001)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1: コラーゲンへの接着に応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2: 接着フィブリノーゲンに応答したDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3: PLLに付着した血小板をトロンビンで刺激するDHE蛍光(405 nm励起)の代表的な動画です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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この論文では、O2•-の選択的検出を介して血小板機能の酸化還元依存性調節を調査する能力を進歩させる可能性のある3つの異なる手法を紹介します。最初の 2 つの方法は、使用される酸化還元プローブ (より一般的であるが信頼性が低い DCFDA の代わりに DHE を使用する) により、既存の手法を改良したものです。したがって、これらの技術は簡単にアクセスでき、ほとんどのラボでは、特定の機器やトレーニングコストなしで効果的に採用できます。3つ目の手法は、ESRによるスピンプローブCMHの酸化分析に特殊な装置を使用することに基づいています。この技術には、特殊な機器や試薬の購入、およびラボのユーザーによる専用のトレーニングが必要です。したがって、血小板(または他の細胞)における酸化還元依存性事象の研究に特に焦点を当てている研究室に適しているようです。

DHEを利用する技術では、O2•-の特異的検出を得るためには、励起の波長選択が重要です。DHEとO2•-との反応によって生成された2-ヒドロキシ-エチジウム(2OH-Et+)は405 nmで励起されますが、DHEとROSの一般的な反応によって生成されたエチジウム(Et+)(ヒドロキシルラジカルや過酸化水素など)は、520 nm付近に励起ピークがありますが、405 nmでは励起されません(図1)51。DCFDAの代わりにDHEを使用すると、このプローブとペルオキシダーゼ、他のヘム含有酵素、および金属イオン還元剤42,43,44などの細胞成分との直接反応によって引き起こされるアーチファクトから保護する。DHEは、細胞酸化還元研究のためのより安全なツールとして提案されています38,39。ここでは、1)フローサイトメトリーと2)蛍光イメージングの2つの異なる読み出し技術によるDHEの使用を提案します。

フローサイトメトリーは、一般に、低から中程度のスループットで複数のサンプルを同時に処理できる技術である52。残念ながら、この研究で使用されたアプローチでは、サンプルの固定は許可されていません。氷冷改質タイロードバッファーでサンプルを希釈すると、サンプル中の蛍光が最大30分間安定しますが、この時間枠ですべてのサンプルの分析を実行する必要があります。これにより、実験あたりのサンプル数が大幅に制限されます。同じ日に、同じ血小板調製物を使用して、複数の内部制御実験を実行することは可能ですが、結果は対照に対して正規化されるべきであり、独立した実験とは見なされません。この手法は、この論文の著者によって、さまざまなアゴニストおよびモジュレーター46,50に対する応答における酸化還元依存性血小板調節の役割を強調するために使用されてきた。この方法は、NOX254に焦点を当てた血小板研究に使用されてきたミトコンドリア(すなわち、Mitosox)53の標的化を可能にする化学的に修飾されたバージョンのDHEの使用を採用することによって変更することができます。これは、私たちの研究室ではまだ追求されていない興味深い機会です。

ここで提案されているDHEを用いた蛍光イメージング技術は、接着時(イメージングウェルの表面に吸収されるアゴニスト)または刺激(懸濁液中のアゴニスト)による血小板中のO2•- 生成の時間経過を決定するという利点があります。これにより、血小板活性化プロセスの異なる段階の相互作用を解釈し、異なるO2•- 源(例えば、異なるROS生成酵素、例えば、NOXs)の寄与を評価することができる。この種の調査は、既存の手法では許可されていません。これにはアッセイのスループットの点でコストがかかり、各試験条件には30分かかります(これにはμスライドのセットアップ、フォーカスとフィールドの選択、イメージング、データ保存が含まれます)。したがって、この手法では、営業日ごとに少数の条件(つまり、10未満)のテストが可能になります。ここで示したデータには共焦点顕微鏡を使用しましたが、励起能力が405 nmの落射蛍光顕微鏡でも同様に良好な結果が得られることを確認しました。これにより、高価な共焦点顕微鏡のセットアップの必要性が減り、この技術がより手頃な価格になります。

ESRプロトコルは、異なる細胞タイプ55における先行研究に基づいて開発された。この手法は、ROS生成の研究および細胞内の酸化還元依存性事象の研究のための最も信頼性の高いツールとして広く認識されている38。ESRは、ヒドロキシルアミンスピンプローブと酸素フリーラジカルとの反応の特異性により、他の技術と比較して優れた信頼性に加えて、O2•- の生成速度の定量化と、異なる個人間および実験間での比較を可能にする。これは、1回の実験と血小板調製で選択した条件が蛍光強度に及ぼす影響を推定することしかできない蛍光ベースの技術では不可能です。このEPRプロトコルは、血小板活性化とO2•- 第1世代を並行してモニタリングするために血小板凝集と組み合わせる技術として開発されましたが、これらの実験は凝集の並列分析なしで実行できます。血小板凝集の並行分析を行わなくても、効果的な血小板刺激を保証するために、アグリゴメーターでインキュベーションを行うことをお勧めします。これには、連続的な攪拌によるせん断応力が必要です。1.5 mLの微量遠心チューブで攪拌せずに実験を行う必要がある場合、O2•- 産生のレベルは大幅に低くなります。したがって、この実験的アプローチを選択する場合は、回転ホイール上で、より高密度の血小板(すなわち、1 x 109/mL)でCMHインキュベーションを行うことを提案します。これにより、ESR分光計による検出に十分な強度のシグナルが得られます。

要約すると、ここでは、血小板中のO2•- を検出するための3つの検証済み技術を紹介します。これらの製品にはさまざまな利点があり、実験の目的や優先順位に応じて選択することができます。フローサイトメトリーによるDHEの使用に基づく最初の手法は、最も手間と時間をかけないため、エントリーレベルの分析として選択できます。2つ目の手法は、蛍光顕微鏡によるDHEの使用に基づいており、O2•- 生成の高速速度論を理解し、さまざまなシグナル伝達カスケードが秒単位の時間スケールで酸化応答にどのように影響するかを研究することができます(他の手法では、刺激から数分以内に発生するイベントのエンドポイント調査のみが可能です)。最後に、ESRはO2•- の生成速度の定量化と、実験と個人との比較を可能にします。このため、後者の手法は、異なる個体の血小板における酸化応答を特徴付けることを目的とした臨床研究に特に有用です(例:患者間または患者 と 健康な対照との比較)。全体として、これら3つの手法は、既存の方法に比べて大きな利点を提供し、血小板の酸化還元依存性事象を研究するための実験ツールを大幅に進歩させています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、英国心臓財団(PG/15/40/31522)、アルツハイマー研究英国(ARUK-PG2017A-3)、および欧州研究会議(#10102507)のG.プーラへの助成金によって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgEPR用試薬 (スピンプローブ)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAフローサイトメーター
ウシ血清アルブミンメルク/シグマA7030μ-スライドコーティング用
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES ESR分光器
カタラーゼ–ポリエチレングリコール(PEG-Cat.)メルク/シグマC4963過酸化水素スカベンジャー (特異性制御)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM ラジカルNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg ESR用試薬(キャリブレーションコントロール)
デフェロキサミン Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg EPR用試薬
ジエチルジチオカルバメート(DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g EPR用試薬
ジヒドロエチジウムサーモフィッシャーサイエンティフィックD11347スーパーオキシドアニオンプローブ
ジメチルスルホキシドメルク/シグマ34869原液調製用 
EPRシーリングワックスプレートNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMEPR
グレードの水Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L EPR用試薬
ヒト血漿由来フィブリノーゲンメルク/シグマF4883μ-スライドコーティング
FITC抗ヒトCD41BioLegend303704フローサイトメトリー用血小板特異的染色
ガラスキュベット Labmedics/Chronolog P/N 312凝集計でのインキュベーション用消耗品
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385血小板刺激用
ImageJ 国立衛生研究所 (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
インドメタシンメルク/シグマI7378血小板分離用
マイクロピペット DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLEPR用消耗品
ポリ-L-リジン塩酸塩メルク/シグマP2658mu;-スライドコーティング用
プロスタグランジンE1(PGE1)メルク/シグマP5515血小板分離用
エン酸ナトリウム(4%w/v溶液)メルク/シグマS5770血小板分離用
攪拌棒(テフロンコーティング)Labmedics/ChronologP/N 313凝集計スーパーオキシド
ジスムターゼ&ndashでのインキュベーション用の消耗品。ポリエチレングリコール (PEG-SOD)メルク/シグマS9549スーパーオキシドアニオンスカベンジャー(特異性制御)
ヒト血漿からのトロンビンメルク/シグマT6884血小板刺激およびμ-スライドコーティング用
VAS2870エンツォライフサイエンスBML-EI395NOX阻害剤
ツァイス510 LSM共焦点顕微鏡ツァイスNA共焦点顕微鏡
用消耗品 抗体 &ク

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