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Ambystoma mexicanumのプレート固定による大腿骨骨切り術の安定化

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DOI:

10.3791/66648

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2024年4月12日

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1Research Institute of Molecular Pathology, 2Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Berlin Institute of Health Centre for Regenerative Therapies, Berlin Institute of Health at Charité - Universitätsmedizin Berlin

この記事について

サマリー

成熟したウーパールーパーの内部プレート固定を使用した大腿骨骨切り術手術のプロトコルが提示されます。この手順は、水生両生類の四肢の再生と骨折治癒に関する比較研究を行うために使用できます。

要約

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、手足、脳、心臓、尾などの失われた臓器や損傷した臓器を再生する優れた能力を備えているため、再生医療の有望なモデル生物です。ウーパールーパーに関する研究は、前駆細胞の活性化と損傷後の組織回復を支配する細胞および分子経路に光を当てます。この知識は、骨の非結合などの再生不能な損傷の治癒を促進するために適用できます。現在のプロトコルでは、内部プレート固定システムを使用した大腿骨骨切り術の安定化が説明されています。この手順は、水生動物(ウーパールーパー、 Ambystoma mexicanum)での使用に適応されました。≥20 cm の鼻から尾までの軸生ルーパーを使用し、完全に骨化したマウスサイズの同等の大腿骨を使用し、プレートの位置決めと固定、および術後のケアに特別な注意が払われました。この外科的技術は、標準化され安定した骨固定を可能にし、ウーパールーパーの四肢再生との直接比較や、両生類と哺乳類の骨治癒の類似の研究に役立つ可能性があります。

概要

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、尾、脊髄、脳、心臓、鰓、および四肢を含む臓器再生の重要なモデルです1,2,3,4,5。ウーパールーパー四肢の再生に関する詳細な研究により、細胞の脱分化のメカニズムと、切断部位での幹細胞プールである芽球の形成が明らかになりました。胞子細胞が、パターン化された骨格6,7を含むすべての欠損肢部分を再構築する能力があるため、ウーパールーパーは骨治癒研究のための魅力的なモデル生物であるように思われる。最近、いくつかの研究がウーパールーパーの骨生物学に焦点を当て、骨格の形態、細胞組成、および骨化ダイナミクスについて説明しています。

哺乳類では、長骨の骨治癒過程は軟骨内骨化 を介して 発生し、血腫、肉芽組織、軟骨形成、硬骨と織骨へのカルス骨化、骨リモデリングのいくつかの段階で構成されることがわかっています8。最近の研究では、ウーパールーパーの骨治癒9でも同様の段階が観察できることが示されています。

これまで、ウーパールーパーの骨折は、虹彩切除ハサミで骨を単純に切断する非安定化システムで研究されていました。大きな骨折はzeugopodで作成され、骨切り術は骨の1つで行われ、もう1つはサポートとして機能します10,11。対照的に、ラットやマウスなどの哺乳類では、骨折のサイズを制御し、骨のアライメントを確保するために、髄内ピンや骨整列プレートなどの信頼性の高い固定システムを使用して、骨折が日常的に研究されています。

したがって、この方法は、骨切り術の前にウーパールーパー大腿骨の安定した均一な固定を確保することを目的としています。ウーパールーパー研究をマウスやヒトを含む哺乳動物とより同等にするために、髄内ピン12、外部プレート固定器13,14、および内部骨整列プレート15,16,17固定が検討された。後者は、適切な骨の固定を確保し、特定の直径のジグリーソーで1つまたは2つのカットを使用することにより、特定のサイズのギャップを作成できることが示されました。ウーパールーパーはAmbystoma mexicanumの水生幼虫を表しているため、創傷が開いており、水と接触しているため、外部固定具が術後の合併症を引き起こした可能性があります。ウーパールーパーは、その発達の非常に遅い時期(20歳18歳)まで二次骨化中心を発達させず、したがってマウスに使用される標準的な髄内釘が骨端に穴を開けるのを防ぐことができない可能性があるため、大きなウーパールーパーに内部プレート固定法を適用することが決定されました。大型のウーパールーパーでは、大腿骨のサイズと骨化の程度が成体マウスに似ているため、チタンプレート固定による中骨端骨切り術が可能になります1。

骨折のギャップ サイズは、治癒のダイナミクスと結果を大きく左右します。例えば、マウスでは、0.25mmの安定化骨折は、その小さなサイズと剛性のある安定化により、主に膜内骨化によって治癒します。0.7 mmの骨折は、軟骨内骨化によって治癒し、骨折の周囲に軟骨カルスが形成されます。3.5 mm の臨界サイズの欠陥などの大きな欠陥は完全には治癒しないため、骨折の非癒合16 をモデル化するために使用されます。この研究では、骨切り術前のウーパールーパー大腿骨のプレート固定プロトコルを確立しました 0.7 mm 骨折ギャップの例を使用して、ウーパールーパーの骨の治癒をマウスの治癒と比較することを最終目標としています9.

骨切り術後、骨折は、マウスよりも遅いものの、おそらくウーパールーパーの水生生活様式と細胞分裂速度の遅さのために、軟骨内骨化の過程を経ました。ここで紹介する方法では、硬質プレート固定による0.7mmギャップ骨切り術が示されています。ただし、他のギャップサイズや半柔軟な固定具、および異なる材料のプレートが可能になる可能性があります。全体として、ここで紹介する方法は標準化された骨固定に使用でき、ウーパールーパーの四肢再生と骨の治癒を比較する研究や、標準化された骨折固定を確保するためにさまざまな条件下でのウーパールーパーの骨治癒の研究に役立ちます。

プロトコル

次の手順は、ウィーンの治安判事(GZ:MA 58-65248-2021-26)の承認を得て行われました。5〜8歳≥、鼻から尾の先端まで20cmの長いウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)を骨折手術と切断に使用しました。手術には男性と女性の両方が使用されました。ウーパールーパーは分子病理学研究所の施設で飼育されました。疼痛と感染症のリスクは、適切な鎮痛薬と抗生物質で管理し、良好な結果を確保した。本試験に使用した試薬および機器は、 資料表に記載されています。

1.動物の調理

  1. 動物を0.03%ベンゾカイン溶液に約15〜20分間浸漬し、完全な鎮静に達し、ピンセットで手足に触れても反射的な動きがなくなるまで待ちます。
  2. 0.03%ベンゾカイン溶液に浸した濡れたペーパータオルの上に腹側を下にして動物を置き、ベンゾカインを染み込ませたペーパータオルで覆います。.ウーパールーパーなどの水生動物の皮膚は乾燥に弱いため、脱水症状を防ぎ、皮膚(皮膚)呼吸を確保するためには体表を覆うことが不可欠です。
  3. リング鉗子を使用して操作する後肢を伸ばします。エタノールなどの消毒試薬は、ウーパールーパーの皮膚が化学物質に敏感で刺激を受けやすいため、塗布しないでください。代わりに、0.7x PBS(A-PBS)と50 U / mLペニシリンおよび20μg / mLストレプトマイシンを使用して、四肢の洗浄とその後の鋸引き時の骨洗浄に使用します。.
    注:感染は一般的に、ウーパールーパーで行われる手術では問題になりません。ただし、これらの動物の水生性および皮膚表面に縫合糸が配置されるため、手術部位の汚染を防ぐために抗生物質の使用をお勧めします。

2. 手術

注:すべての手術器具を滅菌します。この目的には、熱滅菌、オートクレーブ、70%エタノールでの洗浄、その後のアルコール残骸の徹底的な除去などの一般的な滅菌方法が適しています。複数の動物を操作する場合は、ホットビーズ滅菌器または70%エタノールを使用して、その間にツールを滅菌します。

  1. 大腿骨の上のメスで、後肢上部の大腿部全体に広がる横方向の縦切開(1.5〜2cm)を行います。これを行うには、皮膚を切る前に骨を触診します。
  2. 筋肉と神経を手術部位から慎重に変位させ、切断せずに行います。それを効率的に行うために、曲がった鉗子を使用してください。
  3. 大腿骨の下に曲がった鉗子をそっと置き、手術のために大腿骨を露出させます。
  4. 剛性のある7.75mmの4穴固定プレートを大腿骨骨幹と一緒に置き、関節に触れないようにし、鉗子で整列した位置に固定します。
  5. 2mmのチタン製ネジを4本使用して、骨をプレートに取り付けます。
    注:このプロトコルで使用されるネジは複雑な設計で、主要部分(骨にねじ込まれる)、ネジヘッド(四角いボックスレンチを使用してネジとプレートを取り外すことができる)、狭いネック(ネジが骨で締められると破断点として使用される)、およびネジハンドル(ドライバーとのこぎりガイド装置に取り付けるために使用)。
  6. ネジの取り付け順序は重要です。最初に内側のネジから始めて、次に外側の2本のネジから始めて、プレートが骨の軸と位置合わせされていることを確認します。手動ドリルを使用して、ネジを簡単に挿入できるように骨に最初の穴を開け、次に1本目の ネジを配置します。骨の周囲中央にドリルを開けて、片側の細い骨を避けます。これは自然に骨折する可能性があります。掘削中は、0.7x PBS + 1%ペン/連鎖球菌による灌漑を使用します。1st (オプション:1st および2nd)ネジのハンドルを折らないでください。
  7. のこぎりガイド装置を1番目 (オプション:1番目 と2番目 )のネジに取り付け、骨とプレートに合わせます。
    注:このプロトコルでは、プレート、ネジ、のこぎりガイド装置、およびのこぎりが同じメーカーから提供され、互いに適合するように最適化されています。のこぎりガイド装置は、さまざまなプレートやのこぎりサイズと互換性を持つために、さまざまなサイズで提供できます。
  8. のこぎりガイド装置を使用して、残りのネジをドリルで穴を開けて挿入します。プレートと骨の位置合わせを確認します。ネジのハンドルを折ってください。
  9. プラスチックフィルム(6〜7 mm x 4〜5 cm)を70%エタノールで拭いて滅菌し、大腿骨の下にオートクレーブ滅菌または加熱滅菌(140°Cで4時間)して、骨切りプロセス中の軟部組織の損傷を防ぎます。
    注:この目的のために、熱滅菌用の袋を切り取ったプラスチックフィルムを使用することができます。
  10. 骨と保護フィルムの間にGiglyワイヤーソーを置きます。
  11. 0.66mmのGiglyワイヤーソーを使用して骨を切断し、大腿骨に0.7mmの単一の切断を作成します。鋸引き中は、0.7x PBS + 1%ペン/溶連菌による一定の灌漑を使用して、組織の損傷と摩擦を最小限に抑えます。
  12. のこぎりとのこぎりガイドを取り外し、ドライバーを使用してネジのハンドルをネジから切り離します。
  13. 保護フィルムをはがし、0.7x PBS + 1%ペン/連鎖球菌で手術部位を洗浄します。
  14. プレートの上部とネジを滅菌骨ミツバチワックスで覆い、ネジの端による刺激から皮膚と筋肉を保護します。
  15. 骨のミツバチワックスの上に筋肉と皮膚を置きます。
  16. 7.0合成(ポリプロピレン/ポリエチレン)縫合糸で切開部位を閉じます。合成縫合糸は、水に由来する細菌や真菌による汚染を最小限に抑えるために使用されます。

3. 術後管理

  1. 動物を再び目覚めさせるには、50 U / mLペニシリン、20 μg / mLストレプトマイシン、および鎮痛剤ブトルファノール(0.5 mg / L水)を補充した新鮮な人工池の水を入れたタンクに入れます。.
  2. 動物を観察して、えらを動かし、歩みを始め、泳ぎ始めます-通常は手術後1時間以内に。
  3. 動物を50 U / mLペニシリンと20μg / mLストレプトマイシンを入れた人工池の水に3日間保管してから、保持タンクに戻します。.鎮痛を確実にするために、ブトルファノール(0.5 mg / L水)を追加します。.
  4. 縫合糸が所定の位置に留まり、適切な創傷治癒が行われることを確認します。

結果

ここで説明する外科手術(図1)は20分から30分続き、外科医と助手が必要です。オプションで、双眼解剖顕微鏡または虫眼鏡システムを使用します。

figure-results-1
図1:外科的処置と実験セットアップの概略図(A)大腿骨は、皮膚の解剖と手術野から筋肉を引き離すことによって露出します。(B)チタンプレートが大腿骨と整列しています。(C)1番目の内側の穴は、手動ドリルを使用して作成されます。(D)1番目の穴にネジを入れます。(E)のこぎりとドリルガイドを1本目のネジのハンドルに挿入して取り付けます。(F)残りのネジは、指定された順序で取り付けられます。(G)のこぎりとドリルガイドは慎重に取り外し、ねじの首に比べて骨の剛性が高いため、ドライバーを回すときにねじのハンドルが折れます。(H)安全ホイルとギグリーソーは骨の下に置かれています。(I)骨切り術は、切断部位の絶え間ない灌漑下で行われます。(J)スクリューヘッドは、筋肉を交換して皮膚をステッチで閉じる前に、滅菌骨ミツバチワックスで覆われています。(D、E、F):数字は、穴を開けてネジを配置する順序を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プレートとボーンのアライメントとプレートの取り付け手順には、特別な注意を払う必要があります(図2)。ウーパールーパーの年齢のばらつきは、大腿骨のサイズ、形状、および骨化グレードにわずかな違いをもたらします。そのため、ネジを取り付けるための十分なスペースを確保するために、適切なプレート位置を見つけるのが難しいケースもありました。合計すると、23.5%の動物で固定不全が観察されましたが、これは若い動物の骨が狭くなったり骨化しなくなったりした結果である可能性があります(図3)。固定の失敗は、骨切り術を受けた骨のずれをもたらしました。これは、ネジの外れ、骨軸からのずれによる骨片の変位>20°、または顕著な横方向の変位によって検出できました。最初のものはサンプルを採取するときに観察できますが、他のものはマイクロCT分析が完了するまで明らかでない場合があります。適切に整列した四肢では、肉芽組織は手術後3週間で骨折の隙間に位置していましたが、位置がずれたサンプルでは、骨を安定させようとして、はるかに大きく見えました。

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図2:手術手順の概要とその結果得られた動物、左後肢骨切り術 (A)手術の主なステップが表示されます:大腿骨の露出、チタンプレートの正しい位置合わせ、手動ドリルを使用して骨に穴を開けるための鋸ガイドの使用、ネジの塗布、骨切り術用の保護フィルムと鋸ガイド(黄色の矢印)の使用、 0.7 mm の大腿骨骨折 (白い矢印)、スクリューヘッドを滅菌骨の蜂ワックス (紫の矢印) で覆い、最終結果を閉じた手足で覆います。(B)手術後の動物。矢印は骨切り術が行われた左後肢を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

皮膚縫合前に滅菌骨ミツバチワックスを使用すると(図2)、固定プレートの上の皮膚の術後再開放が減少しました。手足は機能を続けており、麻酔が抜かれた直後から立ったり歩いたりするために使用できるようになった。

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図3:ウーパールーパープレート固定骨切り術の代表的な結果(A)無傷および骨折した大腿骨のMicroCTスキャン。骨折後3週間で骨に隙間があることに注目してください。手足の23.5%が固定に失敗し、骨のずれを引き起こしました。固定されたサンプルでは、骨折後6〜9か月で硬いカルスが形成されます。(B)無傷および骨折した大腿骨のサフラニンO /ライトグリーン染色。骨折後3週間で骨の肉芽組織にギャップがあることに注意してください。骨折後6ヶ月で、硬いカルスは編まれた骨と軟骨で構成されています。スケールバー:1 mmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

マイクロCTと組織学的解析(サフラニンO/ライトグリーン染色)により、骨片の位置と骨折ギャップサイズ、および骨の治癒状態を視覚化することができました。MicroCTデータは、市販の試料スキャナーで公称分解能10.05μmで取得し、Polikarpova et al.9に記載されているように、互換性のあるソフトウェア(材料の表を参照)を使用して分析しました。手術後3〜5週間で同じサイズ(0.7mm)の骨折が軟骨と骨のカルスで閉じられる哺乳類とは対照的に、ウーパールーパーでは手術後3週間でカルスは観察されませんでした。通常、軟骨カルスは術後3ヶ月で見え9、骨化した骨カルスは術後6ヶ月で見えました(図3)。

ディスカッション

現在記載されている大腿骨プレート固定術と骨切り術の方法は、 Ambystoma mexicanum (ウーパールーパー)などの水生動物への適用を可能にします。この外科的方法は、最近、ウーパールーパーの骨折治癒と四肢再生をマウス9の骨折治癒と比較するために使用されました。マウスと同様に、4穴の固定プレートを自己破壊ネジで骨に取り付けることができ、Giglyのこぎりを使用して均一なサイズ15の骨折を作成できます。プレート固定により、ギャップサイズの保持が容易になり、骨片のアライメントが確保されます。鎮痛法は、(カルプロフェンのように)骨治癒に影響を与えることが報告されていない(ブプレノルフィン注射と比較して)侵襲性が低いため、ブトルファノール入浴を実装することによっても最適化されました。しかし、両生類の一般的な疼痛管理、特に術後疼痛についてはほとんど知られていないため、先制鎮痛治療の使用は、手順のさらなる改良として提案できます。ここでは、他の両生類種で使用されるプロトコルの適応は19と考えることができます。手術後の動物の健康状態をさらに客観的に評価するために、介入の定義とヒトのエンドポイントのための特定のスコアシートの実施と適用が推奨されます。

マウス16について記載した方法とは異なり、骨切り術の前に、プラスチックフィルムを使用して下層組織を保護する。また、水生生物であり、四肢の筋肉組織があまり目立たないため、ウーパールーパーはプレートとネジの上部に蜜蝋保護パッチが必要であり、バイオフィルムが吸収性縫合糸(ポリグラクチン910ベース)に収集されるため、合成皮膚ステッチの使用に特別な注意を払う必要がありました。ペニシリン-ストレプトマイシンは、創傷や縫合糸の汚染を防ぐために術後治療の一部として利用されます。

この方法は、5〜8歳の≥20cmの鼻から尾までのウーパールーパーに最適化されているため、大型でかなり高齢の動物に限定されていました。これは、このような高齢動物の細胞増殖速度が全体的に低いため、哺乳類よりも骨の治癒が遅い理由である可能性もあります。ただし、これは、骨治癒20のより細かいステップを解決する必要がある場合に有益かもしれません。この方法のもう一つの重要な特徴は、プロトコールで使用される主要な消耗材料である固定プレート、ネジ、およびGiglyのこぎりの商業的性質です。これらのデバイスの最適化された互換性により、信頼性の高いサイズと骨の端からの距離の骨欠損が作成されます。現在のプロトコルでは、ウーパールーパーの骨にチタン金属板を適用する方法が説明されています。マウスについては、サンプル17のマイクロCTイメージングを容易にするために、PEEKプラスチックプレートを開発した。ウーパールーパーのPEEKプレートも同様の結果でテストされました。ただし、金属プレートと比較してプラスチック固定プレートの体積がわずかに大きいため、より大きな動物にのみ適用できます。

本研究では、5-8歳の動物を使用し、全手術の23.5%で固定失敗が観察され、若い動物ほど失敗率が高いことが観察されました。したがって、骨の骨化の度合いが高い高齢の動物を使用することをお勧めします。失敗率は性別とは無関係でした。したがって、男女ともに等しく資格があります。サンプルサイズ計画では、好ましくない結果によるサンプル損失を約20%計算する必要があります。動物の正確な数は、実験計画と分析する条件の数によって異なります。ただし、グループごとの推奨される最小動物数は5 + 20% = 6匹である必要があります。

全体として、この方法は、以前に使用されていた非固定手術または隣接する骨固定手術よりも大幅に改善されます。さらに、この方法を使用すると、マウスの研究で使用されるものとサイズと成熟度が類似した骨を持つ大きなウーパールーパーを研究することができます。マイクロCTは骨化の程度により、大きなウーパールーパーでのみ可能であるため、これは重要です。

この方法は、アホローパー四肢の再生と骨折治癒を直接比較することができるため、この分野では重要な進歩であり、ギャップサイズを制御し、適切な骨のアライメント(実施された手術の76.5%)を実現します。また、PEEKプラスチック固定プレートでは、マイクロCTやX線を用いて骨の治癒過程の評価を行うことができます。最後に、ここで説明する手術は、イモリやカエルなどの他の水生両生類にも適応させることができ、骨折治癒の種間研究をさらに促進します。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

著者は、優れた技術サポートを提供してくれたSabine Stumppと、手術の支援を提供してくれたLidiaGrösserに感謝します。この研究は、Austrian Science Fund [Hertha Firnberg Fellowship number T-1219]、ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems]、DFG [CRC 1444]の助成を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.66 mm ジグリー ワイヤーソー RISystemRIS.590.120
7.0 Optilene 縫合糸 ブラウン・C3090538
・ベンゾカイン Sigma-AldrichE15010.03%に希釈  
使用前に Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)Richter Pharma AG-0.5 mg/L  使用前に
ドリル ビット 0.30 mmRISystemRIS.590.200
Dumont #5 鉗子 - 標準/Inoxファイン サイエンス ツール11251-20
ハンド ドリルRISystemRIS.390.130少なくとも3個持っている方が良い
マイクロCTデータアナライザーブルカー、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国SkyScan NReconソフトウェア
マイクロCT標本スキャナーブルカー、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国SkyScan 1172 
モリアMC31bアイリス鉗子 - 滑らか、湾曲、10 cmファインサイエンスツール11373-12FST2個
MouseFixドリル-&鋸ガイド1.75 mm、硬質RISystemRIS.301.102
MouseFixプレート4穴、硬質RISystemRIS.401.110
MouseFixネジ、L = 2.00 mmRISystemRIS.401.100は骨ごとに4つ必要
ナローパターン鉗子VWRFSCI11002-12
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140-122
リング鉗子ファインサイエンスツール11103-09
#15B ブラウン、サーモフィッシャーサイエンティフィック5518032
スクエアボックスレンチ 0.50 mmRISystemRIS.590.111
滅菌骨ワックス、2.5 gEthicon、Johnson &ジョンソンW810
学生用ファインハサミ-ストレート/ 11.5cmファインサイエンスツール91460-11
メス

参考文献

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