副作用のリスクが低いラットにおける皮内注射

サマリー

このプロトコルは、中央角膜切開と前房への長いトンネルを使用したラットの皮内房内注射の技術を説明しています。この注入方法により、不注意による組織損傷を誘発するリスクが最小限に抑えられ、精度と再現性が向上します。

要約

皮内注射は、眼科における標準的な投与ルーチンです。げっ歯類への皮内注射の研究への適用は、小さな房水量、水晶体の湾曲、水晶体の厚さなど、眼の寸法と解剖学的構造に制限があるため、困難です。前房内注射中の潜在的な損傷は、悪影響と実験のばらつきをもたらします。このプロトコルは、ラットでの皮内注射の手順を説明しており、精度と再現性を可能にします。

実験モデルとしてSprague-Dawleyラットを使用しました。ラットの水晶体の位置は前房に突き出ているため、ヒトのように周辺から注射することは好ましくありません。したがって、31ゲージの0.8mmスティレットブレードを使用して角膜中央領域に切開を作成し、前房へのセルフシールトンネルを形成します。フラットに近い角度での切開は、長いトンネルを作り出すことを可能にし、これにより房水の損失と前房の浅さが最小限に抑えられます。34ゲージのナノニードルをトンネルに挿入して注入します。これにより、摩擦抵抗を最小限に抑えた貫通が可能になり、レンズへの接触を回避できます。トリパンブルーの注入により、スリット顕微鏡による前房内の色素の存在を可視化し、漏れを排除することができます。角膜内皮層へのバイオアベイラビリティは、注射後に角膜内皮細胞の核を染色したヘキスト色素の注射によって実証されます。

結論として、このプロトコルは、ラットでの正確な皮内注射の手順を実装します。この手順は、実験ラットモデルにおけるさまざまな薬物や化合物の皮内導入に使用でき、眼科研究の効率と再現性を向上させます。

概要

局所投与によって眼の表面に送達される化合物のバイオアベイラビリティは非常に限られており、通常は<5%¹です。.点眼薬で投与される化合物は、主にドレナージ、誘発性流涙、涙液代謝回転、および結膜吸収によって排除されます。さらに、眼表面を通る化合物の透過は、角膜結膜バリア^1,2,3によって高度に制限されています。角膜は、最も外側の上皮、中間間質、および最も内側の内皮の3つの主要な層で構成されています。表在性角膜上皮は、強力なタイトジャンクションによって相互接続されており、物質透過性に対する主な障壁である高い傍細胞抵抗性を生み出します。複数の上皮層は、角膜上皮の細胞間空間を通る親水性分子と高分子の透過をさらに制限します。上皮の後継として、間質はコラーゲン繊維で構成され、水性の細孔を含んでいます。角膜上皮とは対照的に、間質は親水性薬物の移動を可能にします。しかし、親油性化合物^1,2,3に対しては非常に不透過性です。角膜上皮と間質層は一緒になって、薬物の吸収を制限する主要な組織障壁を示します。角膜内皮は薬物輸送を制限するとは考えられていません。.

角膜分娩ルートに代わるのは、結膜ルートです。結膜は、まぶたの内側と強膜の前部を覆う多重上皮層です。結膜は、角膜上皮よりもタイトジャンクションが少ないという特徴があり、親水性薬物の透過性が向上します。しかし、結膜の血管新生は、投与された分子の大部分が全身的に吸収されることになり、前房に送達された化合物のバイオアベイラビリティを再び大幅に制限します^1,2。外側の眼透過性障壁を回避する効率的な方法は、薬物を関心領域に直接送達することです。例えば、硝子体内注射は、硝子体液⁴への送達に一般的である。同様に、前房内注射は、前房⁵への送達に利用される。前房での効率的な濃度を確立することは、抗生物質の皮内注射による感染症の治療や白内障手術の術後抗炎症治療など、さまざまな臨床状況にとって重要です。前房内注射によって物質のバイオアベイラビリティが向上するという利点があるにもかかわらず、考慮すべき重大な安全性上の懸念があります。例えば、皮内眼内薬物注射は、眼圧上昇、中毒性前眼部症候群、および毒性性内皮細胞破壊症候群を誘発する可能性があります^5,6。したがって、前臨床試験では、治療効率を最大化し、患者への潜在的な副作用を最小限に抑えるために、前臨床試験で前皮内注射によって送達される薬物の有効性と安全性を慎重に評価することが不可欠です。

新しい治療法を検討するための前臨床試験には、実験動物モデルが不可欠です。マウスやラットなどの小さなげっ歯類は、そのような目的のために最も一般的に使用される実験動物です。これらの動物は、人間の解剖学や生理学と多くの類似点を示しており、貴重な洞察を提供しています。さらに、それらの使用は、サイズが小さく、メンテナンスが容易で、妊娠が速く、多数の子孫を産む能力があるため、経済的に有利です⁷。

眼疾患モデルでは小型のげっ歯類が広く使用されているにもかかわらず、そのユニークな眼の寸法と解剖学的構造は、実験操作中に大きな課題をもたらします。例えば、皮内注射のような手技は、人間では比較的簡単ですが、マウスやラットでは技術的に厳しいものになります。課題は、房水の量が少ないこと、水晶体が比較的大きく柔軟性に欠けていること、げっ歯類の眼内での水晶体の位置と湾曲が邪魔になることなどの要因に起因しています(図1)⁸。これらの課題は、げっ歯類の皮内注射中の損傷のリスクを高め、潜在的な悪影響を引き起こし、研究結論の妥当性に影響を与える可能性のある実験的ばらつきをもたらします。私たちの研究では、ラットに安全な皮内注射を施す方法の開発に成功しました。この技術には、角膜に前房への長くて平らなセルフシールトンネルを作成することが含まれます。この方法は、精度を確保するだけでなく、実験の再現性も向上させ、小型げっ歯類の注入技術に関連する問題に対処します。

図1:ラットと人間の目の解剖学的前部の特徴の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この議定書の実験は、動物科学のための国家許可委員会によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に準拠しています。8〜10週齢の雌Sprague-Dawleyラットを本研究に使用し、12/12時間の明暗サイクルに曝露しました。動物は商業的な供給源から入手しました( 資料の表を参照)。

1.動物の調理

1. ケタミン(0.8mL中80mg/kg体重)とキシラジン(0.2mL中4mg/kg体重)の麻酔薬混合物を調製し、ラットに麻酔をかけるために1回注射で腹腔内注射する。
2. 鎮痛剤のブプレノルフィン(0.03 mg / kg)を1回の注射で腹腔内に注射します。.
3. 局所眼科麻酔薬0.4%オキシブプロカインを両眼に適用します。.

2. セルフシール性角膜トンネルの作製

1. 外科用眼鉗子を備えた角膜強膜接合部の横にある垂直正中線に上強膜を保持することにより、目を安定させます。
2. 手術用顕微鏡下で、滅菌済みの0.8 mm、31 Gスティレットブレードを、垂直正中線(瞳孔の中心より上)の傍中心角膜領域に、水平にできるだけ近い角度で平坦な位置に置きます(図2)。
3. この位置で、角膜を穿刺して切開し、前房の中央領域に貫通するまで長いトンネル(2〜3 mm)を作成します。レンズには触れないでください(図2)。
   注:トンネルが成功しても、房水の漏れや前房の浅さは引き起こされません。
4. 注射した眼に局所0.3%のオフロキサシンと0.1%のデキサメタゾンを塗布します。.
5. 以下のようにスリット顕微鏡で調べます。
   1. 注射された眼の前房の深さを、注射されていない眼と比較して観察します。
      注:深さはほぼ同じである必要があります。
   2. 注射された眼と非注入眼の眼の水晶体を観察します。
      注意: レンズは透明である必要があります。不透明度は、外科的処置中のレンズの損傷を反映する可能性があります。

Figure 2: Schematic Representation of the blade and incisition angle and position. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

3.オプション1:前房への成功した注射を評価するためのトリパンブルーの皮内注射

1. 5 μL のトリパン ブルーを、34 G の鈍い針を備えた滅菌済みの 10 μL ガラス製ハミルトン シリンジに入れます。
   注: トリパン ブルーの注入は、モデルのキャリブレーションまたはセットアップ段階での注入の成功を評価する手段として説明されています。実験設定では、シリンジに選択した化合物の溶液を装填することができます。
2. 装填したシリンジ針をセクション2で作成したトンネルを通して前房に挿入します。
3. 注射後、すべての液体が透明になるまで2〜3秒間針を所定の位置に注入して保持します。
4. 角膜トンネルからの漏れを防ぐために、針を優しくゆっくりと引き抜くようにして取り外します。
5. スリット顕微鏡で観察します。前房の深さを評価して浅瀬を除外し、前房にトリパンブルーが存在することを確認します。
6. 24時間後、48時間後、72時間後にスリット検査を繰り返します。

4.オプション2:内皮細胞層に注入された材料のバイオアベイラビリティを評価するためのHoechstの皮内注射

1. 5 μL の Hoechst を、34 G の鈍い針を備えた滅菌済みの 10 μL ガラス製 Hamilton シリンジにロードします。
   注:Hoechstの注入は、内皮細胞層への取り込みによって注入された材料のバイオアベイラビリティを評価する手段として説明されており、モデルのキャリブレーションまたはセットアップ段階で役立ちます。実験設定では、シリンジに選択した化合物の溶液を装填することができます。
2. 装填したシリンジ針をセクション2で作成したトンネルを通して前房に挿入します。
3. 注射後、すべての液体が透明になるまで2〜3秒間針を所定の位置に注入して保持します。
4. 角膜トンネル切開部からの漏れを防ぐために、針を優しくゆっくりと引き抜くようにして取り外します。
5. 注射後約15〜20分で、500 mg / kgのペントバルビトンナトリウムの腹腔内注射によりラットを安楽死させます。.
6. 両眼を摘出し、角膜を分離します。注射されていない角膜をコントロールとして収集します。.
7. メーカーの指示に従って、両方の角膜を0.5%アリザリンレッドSで染色し、内皮細胞を同定します。
8. 光学顕微鏡で調べて内皮細胞のアリザリン赤色染色を画像化し、蛍光顕微鏡でヘキスト染色を観察します。これは、コントロールとして非注射された角膜と比較して観察されます。

結果

Sprague Dawleyラットに、上記のプロトコルに従って5μLのトリパンブルーを皮内注射しました。注入直後のスリットランプ検査では、チャンバー内にトリパンブルーが染色されており、注入された物質が前房に到達したことが示されました(図3)。さらに、前房の深さは無傷であり、注射によって房水の漏れや房の浅さを引き起こさなかったことが示唆されています。

図3:皮内注射後の無傷の前房。 トリパンブルーをラットの前房に注射しました。...

ディスカッション

前臨床研究モデルは、所見の信頼性と適用性を確保するために、制御された再現性のある環境を提供する必要があります。眼科研究では、疾患モデルの確立、新しい治療法の試験、組織反応や潜在的な副作用の評価など、さまざまな研究面で眼注射モデルが一般的に使用されています。

前房内注射は、実験眼科における一般的な手法として機能し、外側の眼組織バリア5を回避しながら、房水への化合物の直接送達^{を促進します。}この前房内注射による標的型アプローチにより、最適な濃度の薬物が水晶体、海綿網、角膜内皮などの意図した作用部位に到達することが保証され、治療効果が最大化されます。

小型のげっ歯類で皮内注射を行うことには、実験の再現性と成功に影響を与える可能性のあるいくつかの技術的課題があります。まず、げっ歯類の目の寸法が小さいため、眼の構造に損傷を与えることなく、アクセスと操作が困難になります。この文脈では、ラットは目が大きいため、マウスよりもいくつ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アリザリンレッド	アルファ エーザー	042040.5
ブプレノルフィン	リヒターファーマ	102047
デキサメタゾン0.1%	フィッシャーファーマシューティカル	393102-0413
ハミルトンガラスシリンジ10 μL	ハミルトン(株)
Hoeschst	Merck	B2261
Ketamine	Bremer pharma GMBH (medimarket)	17889
オフロキサシン 0.3% 点眼薬	アラガン	E92170
オキシブプカイン 塩酸塩 0.4%	Fisher Pharmaceutical	N/A
ペントバルビタールナトリウム 200 mg/mL	CTS	N/A
スリット顕微鏡	Haag-streit bern	b-90019115
Sprague-Dawley Rats	Envigo	N/A
スティレットブレード 31 G 0.8 mm	Tecfen medical (skymed)	QKN2808
手術用顕微鏡	Zeiss	OPMI-6 CFC
Trypan Blue	Sartorius	03-102-1B
Xylazine	Eurovet Animal Health

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