電気生理学的記録のめったに使用されない方法である塩基記録は、従来の記録方法では調べることができなかった味覚コーディングの特徴を分析することができます。塩基記録により、従来の電気生理学的手法では研究できない疎水性刺激に対する味覚応答の分析も可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
昆虫は、先端に毛穴がある味毛(センシラ)を通して外界を味わっています。センシラムが潜在的な食料源と接触すると、食物源からの化合物が細孔から入り、内部のニューロンを活性化します。50年以上にわたり、これらの応答はチップ記録と呼ばれる技術を使用して記録されてきました。しかし、この方法には、刺激接触の前後に神経活動を測定できないことや、味覚が水溶液に溶ける必要があることなど、大きな制限があります。ここでは、これらの制限を克服するベースレコーディングと呼ばれる手法について説明します。塩基記録により、刺激前、刺激中、刺激後の味覚ニューロンの活動を測定できます。したがって、味覚刺激後に発生するOFF応答の広範な分析が可能になります。水への溶解度が非常に低い長鎖フェロモンなどの疎水性化合物の研究に使用できます。要約すると、塩基記録は、ニューロン活動を測定する手段として単一感覚電気生理学の利点を提供し、遺伝的ツールを必要とせずに高い空間的および時間的分解能を提供し、従来の先端記録技術の主要な制限を克服します。
概要
ショウジョウバエを含む昆虫は、周囲から複雑な化学情報を抽出できる洗練された味覚システムに恵まれています。このシステムにより、さまざまな物質の化学組成を識別し、栄養価の高い物質と有害な物質を区別することができます1,2。
このシステムの中核となるのは、味毛またはセンシラと呼ばれる特殊な構造であり、体のさまざまな部分に戦略的に配置されています。ショウジョウバエでは、これらのセンシラは、ハエの頭1,2,3,4の主要な味覚器官であるラベルと、脚と翼1,2,5,6にあります。ラベルは吻の先端に位置し、2つの葉4,7,8
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プロトコル
以下のプロトコルは、イェール大学のすべての動物飼育ガイドラインに準拠しています。
1.ハエ
- 10〜15匹の新しく出現したフライを、25°Cおよび60%の相対湿度で、12:12時間の明暗サイクルで新鮮な標準培養バイアルに入れます。
- 生後3〜7日でハエを使用してください。
2. 化学感覚刺激
- 利用可能な最高の純度の化学感覚刺激を得る。使用するまで、ベンダーの推奨に従って保管してください。
- 化学感覚刺激を溶解し、水またはパラフィン油などの別の所望の無毒溶媒で所望の濃度に希釈する。調製した溶液を、溶解した固体化合物の場合は最低1時間攪拌する。
3.ガラス刺激毛細管
- ピペットプーラー装置を使用して、ガラスキャピラリーを引っ張り、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(長さ100 mm、外径1 mm、内径0.58 mm)からの刺激を保持します。先端径3μm〜10μmを目標にしてください。
- マイクロローダーピペットチップを使用して、ガラスキャピラリーに好みの刺激溶液を充填します。気泡は軽く叩くことで取り除くことができますので、ご注意ください。
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結果
図4Aは、感覚から生じる自発的なスパイクを示しています。それらは振幅に基づいて2つのクラスに分類され、大きなスパイクは苦味化合物に敏感なニューロンに由来し、小さなスパイクは糖に反応するニューロンに由来します。スパイク振幅と機能特異性の関係は、遺伝子実験によって裏付けられています4,14,37,38,39。
図4B は、DEETの匂いに対するS5感覚の苦味感受性ニューロンの応答を示しています。この応答は、DEET溶液と感覚の間に接触することなく起こりました。1つのスパイクは中程度の振幅であるように思われ、糖ニューロンからのスパイクと機械感覚ニュ.......
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ディスカッション
ある種のセンシラからの記録では、異なるニューロンのスパイクを区別することが困難な場合がある。例えば、S感知器とI感知器の糖ニューロンと機械感覚ニューロンは、同様の振幅のスパイクを生成し、それらを区別することを困難にする4,14。非常に鋭いタングステン記録電極を使用すると、記録電極の賢明な配置と同様に、機械感覚ニューロンの発火が減少することがわかりました。記録電極をセンシラムソケットのカラー(つまり、ベースに挿入するが深くない)すると、機械感覚刺激が減少することがよくあります。さらに、記録に機械感覚ニューロンの発火レベルが高い場合、記録電極を引っ込めて感覚に対して異なる位置に配置すると、発火レベルが低下することが多いことがわかりました。
実験全体を通して記録電極の安定性を確保することも重要な問題です( 図4Eを参照)。機械的な乱れや電極位置のずれは、記録の品質に悪影響を与える可能性があります.......
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
サポートしてくれたZina Berman、原稿にコメントしてくれたLisa Baik、そして議論をしてくれたCarlson研究室の他のメンバーに感謝します。この研究は、H.K.M.D.へのNIH助成金K01 DC020145を支援しました。NIHはR01 DC02174、R01 DC04729、およびR01 DC011697をJ.R.C.に付与します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 50倍対物レンズ(LMPLFLN 50X、オリンパス)と10倍接眼レンズを装備した | 顕微鏡 | リンパス | BX51WI |
| 防振テーブル | TMC | 63-7590E | |
| 電動マイクロマニピュレーター | ハーバード装置およびMärzhäユーザー マイクロマニピュレーター | マイクロマニピュレーター PM 10 ピエゾマイクロマニピュレーター | |
| マニュアル マイクロマニピュレーター | Märzhäユーザー マイクロマニピュレーター | MM33 マイクロマニピュレーター | |
| マグネティックスタンド | ENCO | Model #625-0930 | |
| リファレンス および録音 電極ホルダー | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 刺激ガラスキャピラリーホルダー | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| ユニバーサルシングルエンドプローブ | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4チャンネルUSBアクイジションコントローラー、IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 刺激コントローラー | Ockenfels Syntech GmbH | 刺激コントローラー CS 55 | |
| パーソナルコンピュータ | Dell | Vostro | デジタルアクイジションシステムおよびソフトウェアとの互換性を確認 |
| タングステンロッド | A-M Systems | Cat#716000 | |
| アルミホイルおよび/またはファラデーケージ | 電磁ノイズシールド | ||
| ホウケイ酸ガラス毛細血管 | 世界精密機器 | 1B100F-4 | |
| ピペットプーラー | サッター機器 会社 | モデル P-97 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー | |
| 実体顕微鏡 | オリンパス | VMZ 1x-4x | フライ調製用 |
| p200ピペットチップ | 汎用 | ||
| マイクロローダーのヒント | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml シリンジ | ジェネリック | ||
| クロコダイル クリップ | |||
| パワー トランスフォーマー | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | P1000 ピペット チップ、フレキシブル プラスチック チューブ、メッシュ |
| モデリング クレイ | ジェネリック | ||
| 鉗子 | ジェネリック | ||
| プラスチックチューブサンゴ | バン | タイゴンS3™E-3603 | |
| 標準培養バイアル | Archon Scientific | Narrow 1-oz ポリスチレンベイル、それぞれに 10 mL のグルコース培地、酢酸セルロースプラグをあらかじめ充填 | |
| ベルベリン (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| 安息香酸デナトニウム (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat#36542 |
参考文献
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics.
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再版と許可
