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方法論記事

マウスの腸内微生物代謝物を評価するための下大静脈からの逐次採血とそれに続く門脈

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DOI:

10.3791/66673

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2024年6月21日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital

責任著者： Daisuke Maruyama <daisuke.maruyama@ucsf.edu>, Arun Prakash <arun.prakash@ucsf.edu>

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウスから門脈と下大静脈から血液を順番に採取して、腸内微生物代謝産物の産生と吸収を評価する方法を示しています。

要約

腸内微生物産物は、腸内で局所的に作用するだけでなく、循環に吸収されることが知られており、その影響は多数の遠隔臓器系にまで及ぶ可能性があります。短鎖脂肪酸(SCFA)は、難消化性食物繊維の発酵中に腸内細菌によって生成される代謝産物の一種です。彼らは現在、腸内細菌叢が宿主全体の腸-肺、腸-脳、およびその他の腸-臓器軸を介して腸外臓器系にどのように影響するかに重要な貢献者として認識されています。SCFAは結腸から腸組織を介して門脈(PV)に吸収されます。その後、肝臓を通過し、脳、筋肉、脂肪組織、肺などのさまざまな臓器で消費されます。SCFAは、排出された糞便物質で最も簡単に測定されますが、結腸内の糞便内容物からより正確な測定値が得られています。ここでは、マウスのSCFAの吸収、輸送、および全身レベルの研究には、単一の被験者のPVおよび全身循環血漿のサンプリングが好ましい可能性があることを提案する。PVおよび下大静脈(IVC)からの効率的な採血のための新しい技術を提示します 門脈および体循環からの比較的大量の血液の収集を可能にします。これは、PVをライゲーションすることによって達成され、それによってPVがそれに流れ込む腸間膜静脈から埋め戻されるときにPVの拡張または拡大を可能にします。この方法により、採血成功率と総採血量(IVCから最大0.3mL、PVから最大0.5mL)を向上させることができました。

概要

短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢によって産生される代謝産物の主要なクラスです。腸内細菌叢と他の遠隔臓器との相互作用におけるそれらの重要な役割1は、それらが炎症を調節し、専用の受容体を介してシグナルを送り、細胞代謝の基質として機能する方法を説明する研究によって裏付けられています2,3,4,5。私たちのグループの最近の研究では、SCFAが腸-肺軸6,7を介してin vivoで肺免疫緊張の重要なin vivo炎症調節因子であることが提案されています。追加の報告では、腸-脳軸8,9を介した代謝に対するそれらの機能的影響が説明されています。全体として、SCFAが宿主の生理学と病理学に及ぼす影響は、幅広い疾患プロセスにまたがる多数の研究グループによって積極的かつ集中的に調査されています。

酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、および酪酸(C4)は主要なSCFAであり、盲腸および大腸で摂取可能な食物繊維の発酵を通じて腸内細菌叢によって生成されます。3つのSCFAはすべて食事から直接摂取することもでき、哺乳類の細胞によってもアセテートのみが産生される可能性があります。SCFAは結腸に吸収され、腸上皮細胞によって部分的に利用されます(エネルギー源として、局所組織の免疫調節および腸バリアの維持をサポートします)。それらはまた、腸間膜静脈系10を介して門脈に運ばれる。酪酸は主に腸上皮で消費され、プロピオン酸は肝臓で消費され11,12、酢酸は末梢循環に入った後に筋肉や脂肪組織に作用することが報告されています13,14。

SCFAの産生、吸収、および機能活性を包括的に評価するには、結腸内腔内、門脈循環、および末梢血中のSCFAレベルの知識が必要です。これは、門脈(PV)からの採血と、同じ動物内での全身循環を同時に、または連続的に行うことで達成できます。SCFAは揮発性であるため15、排出された糞便ペレット中のSCFAのレベルを測定することは、結腸内のレベルを正確に反映していない可能性があります。さらに、結腸内容物からの測定と比較して、PVに存在するSCFAのレベルは、宿主によって吸収された定常状態レベルと腸内細菌叢によって生成される不均一なレベルとの正味の合計をより正確に反映している可能性があります11。したがって、これらのPV SCFAレベルは、腸内の局所的な影響を超えて、宿主の生理学および病理に対するSCFAの影響を研究するためにより関連性があり、適切である可能性があります。

PVと全身循環血液の協調的かつほぼ同時に収集を行うには、正常な血液循環を維持し、自発呼吸をサポートするために、横隔膜を無傷のままにしておく必要があります。したがって、下大静脈(IVC)は、PV血液を採取しながら体循環血液を得るのに理想的な部位です。このIVC血液は、全身性炎症を評価するための循環サイトカインの測定など、他の目的にも使用できます。

現在、体循環とPVの両方から血液を採取する方法は、より大きなげっ歯類で報告されているのはごくわずかです16,17。ラットの血管のカニューレ挿入を必要とする従来の方法は、マウスで行うのは技術的に困難です。さらに、これらの方法によって収集される血液の最大量は、通常、0.3mL以下である18。

この論文では、マウスIVCから同じ動物でPVに続く二重採血のプロセスを簡素化する新しい方法を紹介します。この方法のユニークな特徴は、PV採血の直前に肝門の近くでPVをライゲーションすることです。このアプローチにより、PVの寸法を拡大できるため、成功率が大幅に向上し、最大収集可能な血液量が最大0.5mLまで増加します。

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プロトコル

この非生存手順のすべてのステップは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。マウスの性別と系統は、C57BL/6Jマウスの雄(体重25-35g、生後12-15週齢)とした。雌および/または他の標準的なマウス系統も使用できます。

1.麻酔

  1. マウス腹部の下半分を70%エタノール綿棒で拭きます。トリブロモエタノール(250-400 mg / kg)の腹腔内注射を行うことにより麻酔を投与します。ケタミン/キシラジンまたはイソフルラン麻酔も使用できます。角膜の損傷を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。
  2. 鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05-0.1 mg / kg)を腹腔内に注射します。.
    注:開腹術に伴う痛みのため、ブプレノルフィンが必要です。

2.開腹術

  1. 麻酔をかけたマウスを手術面(下に加熱パッドがある)の仰臥位に置きます。すべてのマウスの手足を手術用ボードにテープで固定します。ペダル離脱反射を伴わずにつま先をつまむことにより、適切な麻酔の深さが達成されたことを確認します。
  2. 皮膚を持ち上げ、臍から剣状突起までの正中線に沿って、そして腹部の基部(外性器)に向かって尾側に解剖ハサミで縦方向に切開します。
  3. 腸、横隔膜、または肝臓に穴を開けたり損傷したりすることなく、解剖ハサミで腹膜に同様の切開を行います。
  4. 臍の両側にハサミで全長横切開(腹部の幅を伸ばす)を行い、術野を広げます。
  5. 温かいPBSに浸した清潔なガーゼを使用して、大腸と小腸を外科医の右側に移動し、下のIVCを露出させます。

3. PVのための合字の準備

  1. 手術野内の腸管を綿棒で優しく操作し、腸間膜の根元にPVを配置します。
  2. 解剖顕微鏡を使用して血管および他の腹部構造を視覚化し、7-0プロレン縫合糸をPVの後ろの肝門付近(十二指腸静脈と脾静脈の間)19 に慎重に通過させ、ステップ5(図1)で結紮する準備が整うようにする。
    注:このステップ以降、顕微鏡を使用することは必須ではありませんが、全体的な手順の成功率が大幅に向上します。

4. IVCからの血液サンプル採取

  1. ヘパリン処理された1ccインスリン注射器の28G1/2インチ針をIVCに挿入します。0.2〜0.3mLの血液サンプルを採取します。
    注:このステップで除去する血液が多すぎると、ステップ5で収集されるPV血液の量が少なくなります。
  2. 抜去時に発生する出血を避けるために、針をIVCの中に置いておきます。

5. PVからの血液サンプル採取

  1. 7-0プロレン結紮糸をPVの周りにそっと結びます。PVは、埋め戻すときに膨張および拡張する必要があります。別のヘパリン処理された1ccインスリン注射器の28G 1/2インチ針をPVに挿入します。
  2. ゆっくりと吸引して、PVから最大0.3〜0.5 mLの血液を収集します。PVは崩壊する可能性がありますが、腸間膜静脈系からの血液補充により、徐々に再拡大する必要があります。

6. サンプルの保存

  1. 採血後、IVCとPVから針を取り外してください。
  2. シリンジから血液サンプルを1.5 mLのヘパリン処理エッペンドルフチューブに移し、氷上に置いて、後で血漿に処理し、必要に応じて保存および分析します。
  3. 麻酔薬の過剰摂取とそれに続く子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させます(UCSF IACUC承認のガイドラインによる)。

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結果

上記の方法を用いることで、IVCとPVから血液サンプルを同じマウスで順次採取することができ、成功率は95%を超えています。採取される血液サンプルの平均量は、IVCで0.25 mL、PVで0.35 mLです。

ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)を用いて、糞便、PV血液、IVC血液中のSCFAsの濃度を測定し、腸内細菌の発酵によって生成される大腸コンパートメントからアセテート(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸(C4)の吸収と通過を追跡できました。

具体的には、これらの実験では、マウスのSCFAs産生に及ぼす食物繊維の摂取の影響を調査しました。マウスに高繊維食(食物繊維35%)を1週間または2週間与え、食物繊維を含まない食餌を与えられたマウスと比較しました。高繊維グループでは、繊維発酵細菌分類群の増加が予想され、観察されました(データは示されていません)。次に、結腸内容物、PV血、および全身循環(IVC)血液のSCFAsレベルを調べました(ミシガン大学のメタボロミクスコアファシリティのGC-MSで定量化)

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ディスカッション

この論文では、同じ実験マウスでIVCとPVから血液サンプルをほぼ同時に採取するための革新的な in vivo 法について説明します。この方法は、門脈循環を通過するSCFAなどの腸内細菌叢生成産物のレベルを測定するのに役立ちます。マウス(体重25〜30g)の終末処置中に収集できる血液の平均最大量は、マウスあたり約1mLであり、これは総循環血液量の50%に相当する18。しかし、相互作用し隣接する2つの静脈系から目的の実験的測定に十分な血液を得ることは困難な場合があります。マウスのPVの血管内圧は、IVC25の血管内圧よりもわずか3〜5mmHg高いため、PVの圧力が低下するとIVCの圧力が低下する可能性があり、 その逆も同様です。さらに、マウスの門脈系は、腸間膜と脾臓26からの複数の血管枝から構成されており、比較的小さく、壊れやすい。これらの理由から、PVとそれに関連する枝を正確に同定し、PVとIV...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

APは、NIH / NHLBI(1R01HL146753)からのR01賞によって資金提供されています。DMは、NIHのT32フェローシップと、UCSFベニオフマイクロバイオーム医学センターの研修生/スタッフパイロット賞によって資金提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2,2,2トリブロモエタノール、97%(アバーチン)シグマアルドリッチ T48402-25G麻酔薬 
ブプレノルフィン塩酸塩注射剤0.3mg / mLPAR医薬品 NDC 42023-179-05鎮痛剤
ドレッシング鉗子ミルテックス 6-100解剖 
グレーフ鉗子ロボズRS-5136解剖 
ヘパチンナトリウム 1000 USP 単位/mLHikmaNDC 0641-0391-12血液サンプルシリンジ/チューブ ヘパリン化
Prolene 7-0Ethicon8696G門脈結紮は
さF.S.T14058-11解剖 
学生ハルステッド-モスキート止血剤F.S.T 91308-12剖 
サージカルテープ 3M Transpore1527-1マウス肢固定
U-100 インスリン注射器 28G1/2EXEL26027血液サンプル採取 
み 解

参考文献

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