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方法論記事

アドベンチアル塩化カルシウムとエラスターゼ浸潤によるマウス腹部大動脈瘤モデル

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DOI:

10.3791/66674

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2024年8月2日

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1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Key Laboratory of Birth Defects and Related Diseases of Women and Children of MOE, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Second University Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この原稿では、塩化カルシウムとエラスターゼを使用してマウス腹部大動脈瘤モデルを確立するためのプロトコルを提示し、以前のモデリング方法の利点を組み合わせています。このモデルは、腹部大動脈瘤の根底にある病態生理学的メカニズムを調査するために利用できます。

要約

腹部大動脈瘤(AAA)は、高い死亡率に関連する生命を脅かす疾患です。これは、動脈径が少なくとも50%増加する腹部大動脈の永久的な拡張を特徴としています。AAAの様々な動物モデルが導入され、病態生理学的変化を模倣し、AAAの根底にあるメカニズムを研究しています。これらのモデルの中で、塩化カルシウム(CaCl2)およびエラスターゼ誘導AAAモデルは、マウスで一般的に使用されています。ただし、これらの方法には一定の制限があります。従来のブタ管腔内膵臓エラスターゼ (PPE) 灌流は、高い技術的困難と高い破裂率に関連していますが、PPE の傍静脈周囲投与では一貫性のない結果が得られます。さらに、CaCl2誘導AAAモデルには、アテローム血栓症や動脈瘤破裂などのヒトAAAの特徴がありません。したがって、CaCl2 とPPEの併用アプリケーションは、AAA動物モデルで成功率を高め、より大きな直径の増加を誘発するアプローチとして提案されています。この原稿は、腹部大動脈の腎下部分におけるPPEおよびCaCl2 の大動脈周囲浸潤を通じてマウスAAAモデルを確立するための包括的なプロトコルを提示します。このプロトコルに従うことで、技術的なシンプルさと再現性で約90%のAAA形成率を達成することができます。さらなる超音波検査および組織学的実験により、このモデルがヒトAAAで観察された形態学的および病理学的変化を効果的に再現することが確認されています。

概要

腹部大動脈瘤 (AAA) は、腹部大動脈の直径が 50% を超えるか、最大大動脈直径が 3 cm を超えることと定義されます。この状態は生命に重大な脅威をもたらし、動脈瘤破裂時の死亡率は約90%です1,2,3。現在、開腹手術による修復と血管内大動脈弁修復術 (EVAR) が、AAA 患者 4,5,6 に対して利用可能な唯一の介入です。しかし、外科的適応がない患者において、動脈瘤形成を阻害したり、腹部大動脈の成長速度を遅らせたりする治療の有効性を裏付けるエビデンスは不十分である7。それにもかかわらず、動脈瘤の最大直径の持続的な監視、血圧制御、抗血小板療法、スタチンなどの非特異的治療は、突然の動脈瘤破裂や潜在的な心血管および神経学的イベントのリスクを可能な限り減らすために使用されます。それにもかかわらず、動脈瘤破裂の予防における抗血小板薬とスタチンの役割は依然として議論の余地があり、さらなる研究が必要です5,7,8,9,10。

AAAの病因を調べるためには、安定なAAA動物モデルが不可欠であり、そのようなモデルを確立するために多くの方法が導入されています11,12,13。現在、塩化カルシウム(CaCl2)、エラスターゼ、アンジオテンシンII(Ang II)、異種移植片、およびトランスジェニックモデルがげっ歯類のAAAモデル11,12,13の確立に使用されている。これらのうち、Ang IIはマウスで最も一般的に使用され、一方、CaCl2およびエラスターゼはマウスおよびラットでも広く使用されている11,12,13,14。Ang II誘発AAAモデルは、ヒトのAAA病理によく似たアテローム性動脈硬化症を誘発できる唯一の動物モデルであり、シンプルで再現性があり、開腹術の必要性を排除します11,12,13。しかし、CaCl2 またはエラスターゼによって誘導されたモデルとは対照的に、Ang II によって誘発された動脈瘤の部位は不確実であり、下行大動脈または上行腹部大動脈で頻繁に観察され、破裂のリスクが高くなります 11,12,13,14。遺伝子欠損マウスにおけるAng II誘導AAAモデルの動脈瘤発生率は100%にもなるが、C57BL/6マウスの39%のみが動脈瘤を発症し、遺伝子欠損マウスの入手にかかる時間と経済的コストは高い13,15。

Gertzらによって最初に導入されたCaCl2は、頸動脈における動脈瘤形成を誘導するために利用され、後にChiouらによって改変され、マウス16,17においてAAAモデルを確立するために改良された。しかし、CaCl2は、弾性線維の破壊、血管の炎症、および細胞外マトリックスの分解を誘発する能力があるにもかかわらず、アテローム血栓症、管腔内血栓(ILT)、動脈瘤破裂など、いくつかのヒトAAAの特徴を欠いています12,18。さらに、大動脈周囲CaCl2アプリケーションの形成速度と直径増加率は不安定なままです13,19。AAAを誘導するための最初のブタ管腔内膵エラスターゼ(PPE)灌流モデルは、1990年にAnidjarらによって開発され、続いてBhamidipatiらのマウスモデルにおける外膜周囲PPE浸潤に関する報告が行われました20,21。今日では、エラスターゼ誘発AAA動物モデルの大部分は、その実現可能性と低侵襲性のためにBhamidipatiのプロトコルを利用しています。ただし、AAAの発生率と最大直径はさまざまであり、一般に大動脈内PPE灌流よりも低いことに注意することが重要です。さらに、エラスターゼの大動脈周囲適用によって誘発された動脈瘤は、自然に治癒する傾向を示します11,12,20,21,22,23。

これらの制限に対処するために、田中らは、ラットにおけるAAAモデルを確立するために、管腔内PPE灌流とCaCl2浸潤を含む組み合わせアプローチを提案し、満足のいく結果をもたらしました24。さらに、Zhuらは、PPE+CaCl2モデルが、単一のPPE群およびPPE+BAPN群の両方と比較して、より高い生存率および増加した動脈瘤形成率などの利点を提供することを実証した25。この組み合わせたアプローチは、優れた安定性と再現性も示します。さらに、Biらは、大動脈周囲CaCl2とエラスターゼインキュベーションの組み合わせにより、ウサギAAAモデルを確立することに成功しました。平均拡張率は5日目±65.3%8.9%で、15日目には86.5%±28.7%にさらに増加し、30日目には203.6%±39.1%に大幅に上昇しました26。ただし、現在、大動脈周囲CaCl2とエラスターゼの適用を組み合わせることにより、げっ歯類にAAAが誘導されたことを報告している既存の文献はありません。

この原稿は、外膜周囲CaCl2 とエラスターゼ浸潤の併用によりマウスAAAモデルを確立するための標準プロトコルを提示します。次のセクションでは、詳細な外科的手順を提供し、マウスAAAモデルの代表的な結果を示します。

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プロトコル

動物実験プロトコルは、National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(NIH Pub No. 86/23, 1985)に準拠し、四川大学西中国病院の動物管理委員会によって承認されました(承認番号202311300012)。この研究では、8〜10週齢のC57/B6J雄マウスを使用しました。使用した試薬や機器の詳細は 、資料表に記載されています。

1. 術前準備

  1. 動物を入手し、標準条件(温度24°C、湿度40%-50%、12時間の明暗サイクル)できれいな水で通常の食事を与えます。
  2. 綿パッドを40 mm x 4 mmのストリップにカットし、はさみ、鉗子、その他の手術器具と一緒に滅菌します。
  3. 動物を麻酔器の誘導室に入れ、3%〜3.5%のイソフルランを使用して迅速に麻酔を誘発します(施設で承認されたプロトコルに従います)。さらに、先制鎮痛薬としてブトルファノール(1 mg / kg、筋肉内注射)を処方します。.
    1. マウスが痛みの刺激に反応しなくなったら、マウスをチャンバーから取り出し、マウスにマスクを置き、1%〜1.5%のイソフルランで麻酔の深さを維持します。5〜10分ごとに呼吸数と呼吸深度を監視します。
  4. マウスを加熱パッドの仰臥位に置き、粘着テープを使用して手足を固定し、乾燥を防ぐために目の軟膏を塗布します。
  5. 電気シェーバーまたは脱毛ローションを使用して腹部の毛を完全に取り除き、ポビドンヨードとエタノールに浸した綿棒でこの領域を円を描くように少なくとも3回消毒します。

2.外科的処置

  1. マウスを実体顕微鏡の下に置きます。はさみを使用して、腹部の正中線に沿って約2〜2.5cmの縦方向に切開します。
  2. linea alba(経腹部アプローチ)から腹腔に入り、リトラクターを配置して腹腔を露出させ、通常の生理食塩水に浸したガーゼを使用して腸と結腸を腹部の右半分に詰めます。
  3. 鉗子と綿棒を使用して、腹部下大動脈と下大静脈(IVC)に隣接する結合組織と脂肪組織の鈍的分離を行います。腹部大動脈を静かに解剖し、腹部大動脈とその上にある大腰筋との間の隙間を露出させます(前述の25)。
    1. 滅菌したコットンパッドストリップをその隙間に挿入し、腰部の動脈や静脈を傷つけないように細心の注意を払います。腹部大動脈をIVCから分離する必要はありません。
  4. コットンボールを0.9M CaCl2 に浸し、腹部大動脈の外壁に15分間置きます。浸潤の過程で腹腔を覆うために滅菌されたガーゼを使用してください。
  5. CaCl2に浸したコットンボールを静かに取り出し、浸潤したセグメントを0.9%生理食塩水で洗います。
  6. エラスターゼをddH2Oで2 mg / mL(8 U / mL)に希釈します。インスリン注射器を使用して、希釈したエラスターゼ50 μLを腹部大動脈の腎下部分に適用し、綿パッドストリップを包んで腹部大動脈とIVCを覆います。.浸潤の過程で腹腔を覆うために滅菌されたガーゼを使用してください。シャムグループでは、0.9%の生理食塩水を使用してCaCl2 とPPEを置き換えます。
  7. 15分後、ガーゼとコットンパッドを慎重に取り外します。腸と結腸を元の位置に戻し、治療した大動脈を腸間膜で覆い、腸を湿らせて癒着を防ぎます。
  8. 6-0非吸収性ポリプロピレン縫合糸を使用して、筋肉層と皮膚を別々に閉じます。手術部位をポビドンヨードとエタノールで消毒します。
  9. マウスを加熱パッドに置き、意識を取り戻すまで呼吸状態を監視します。運転時間と実験動物の数を記録します。獣医師の推奨に従って、手術後少なくとも 3 日間、術後鎮痛剤としてカルプロフェン (5 mg/kg、皮下) を処方します。

3.超音波検査

  1. 手術の21日後に超音波検査を行い、AAAの発生率を評価します。
  2. マウスに麻酔をかけ(施設で承認されたプロトコルに従って)、前述のように腹部の毛を取り除きます。
  3. マウスをげっ歯類の超音波装置の加熱パッドに置きます。超音波接触媒質を腹部に塗布し、動脈瘤の最大直径と腹部大動脈の正常セグメントの直径を測定します。
    1. 腎下腹部大動脈の増加率を計算します。AAA形成を成功させるための基準は、AAAの最大直径が、腎下腹部大動脈の正常セグメントの直径と比較して50%以上増加していることです。
  4. 検査後、ナプキンを使用して残りの超音波カプラントを拭き取り、マウスが完全に回復するまでマウスを加熱パッドに置きます。

4. 腹部大動脈採取と病理実験

  1. 超音波検査の翌日にイソフルランの過剰摂取によってマウスを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)。
  2. 胸腔と腹腔を開き、以前の文献27に記載されている手順に従って、肺と肝臓が白くなるまで左心室から1x PBSで灌流を行います。
  3. デジタルノギスを使用して、腎下大動脈の外径を測定します。実体顕微鏡で腹部下大動脈を採取し、血管を4%パラホルムアルデヒドに24〜48時間保存します。
  4. 腹部大動脈を囲む結合組織と脂肪組織を取り除きます。大動脈をパラフィンに埋め込んで切片を調製し、前述したように切片を3〜5μmのスライスに切断します18,28。
  5. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)、Massonのトリクローム、およびElastic-Van Gieson(EVG)の脱パラフィンスライスの染色を、メーカーの指示に従ってそれぞれの染色キットを使用して行ってください。
    1. H&E染色による血管構造と炎症の解析、Massonのトリクローム染色による細胞外マトリックス(ECM)の分解とコラーゲン線維の観察、EVG染色による弾性線維の観察が可能です。

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結果

この研究では、合計24匹のマウスが含まれ、ランダムに割り当てられました:それぞれShamグループに12匹、PPE + CaCl2 グループに12匹。すべてのデータは、特に明記されていない限り、平均±標準偏差として示されています。平均運転時間は55.67分±4.08分でした。術中の死亡や動脈瘤の破裂はなく、術後21日以内の生存率は100%でした。腹部大動脈解離に関連する重度の腸癒着や合併症は観察されませんでした。

PPE+CaCl2 群では、手術後21日でマウス12匹中11匹(91.67%)がAAAを発症したが、シャム群では動脈瘤形成は観察されなかった。腎下腹部大動脈の平均最大内径は、PPE + CaCl2 群で1.29 mm±0.18 mmであったのに対し、Sham群では0.50 mm±0.04 mmでした。PPE + CaCl2 群における腎下腹部大動脈の内径の平均増加率は99.50%±25.42%であった。平均最大外下大動脈径は、PPE + CaCl2 グループで 1....

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ディスカッション

AAAの分子メカニズムの研究には、安定した動物モデルが必要です。その結果、1960年代にEconomouらによって最初に開発されて以来、数多くのAAA動物モデルが確立されてきた29。これらのモデルの中で、CaCl2は、その費用対効果、技術的な単純さ、および信頼性の高い再現性のために、げっ歯類に頻繁に採用されています。しかし、血管周囲CaCl2浸潤はAAAの確立において不安定であることが示されています。BiらおよびFreestoneらは、AAA形成の基準が腹部大動脈の正常部分と比較して20%の増加と定義された場合でも、ラットの約60%のみがAAAを発症したことを報告した。どちらの研究も、0.5 mol/L CaCl2を大動脈周囲に1回インキュベートした後、動脈瘤の形成が観察されなかったことを指摘しました13,19,26,30。

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開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言します。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(81770471年82300542号)、四川科学技術プログラム(No.2022YFS0359、2019JDRC0104)、四川大学華西病院博士研究員プロジェクト(No.2023HXBH108)の支援を受けて行われました。資金提供機関は、研究のデザイン、データの収集、分析、解釈、および原稿の執筆に何の役割も果たしませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔器RWDR550
Butorphanol江蘇恒瑞製薬株式会社220608BP1ml:1mg
C57BL / 6JGpt雄マウスGemPharmatechN000013
塩化カルシウムグマAldrichC4901100 g
カルプロフェンMCEHY-B1227100 mg
Chowダイエットドッシー実験動物 Co.Ltd
デジタルキャリパーグリーナーIP54
エタノール金河製薬 Co.Ltd53968275%/500 mL
EVG 染色キットソーラーバイオG1597
GraphPad プリズムグラフパッドVer 9.0.0
H&E染色キットServicebioG1076
インスリンシリンジBD2143420
イソフルランRWDR510-22-4100 mL
マッソン染色キットServicebioG1006
生理食塩水ServicebioG4702500 mL
パラホルムアルデヒドバイオシャープBL539A4%/500 mL
PBS、1xServicebioG4202500 mL
タ膵臓エラスターゼシグマアルドリッチE1250100 mg
ポビジンヨウ素ヨンガン製薬 Co.Ltd5%/100 mg
プロレンポリプロピレン縫合糸Ethicon LLC8709H
げっ歯類超音波システム富士フイルムVevo 3100LT
実体顕微鏡オリンパスSZ61
超音波カプラントケプラーKL-250250 g
シブ

参考文献

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