マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

サマリー

さまざまな細菌性病原体は、正確に検出され、迅速に治療されない場合、気道感染症を引き起こし、深刻な健康問題を引き起こす可能性があります。ループを介した等温増幅 によるこれらの病原体の迅速かつ正確な検出は、臨床現場での気道感染症の効果的な管理と制御を提供します。

要約

気道感染症(RTI)は、臨床現場で最も一般的な問題の1つです。細菌性病原体の迅速かつ正確な同定は、RTIの管理と治療のための実用的なガイドラインを提供します。この研究では、多チャンネルループ媒介等温増幅(LAMP)を介して気道感染症を引き起こす細菌性病原体を迅速に検出する方法について説明しています。LAMPは、細菌の核酸を高い精度と信頼性で迅速に検出する、高感度で特異的な診断ツールです。提案された方法は、時間がかかり、低レベルの細菌核酸を検出するためにより高い感度を必要とすることが多い従来の細菌培養方法に比べて大きな利点を提供します。この記事では、LAMPを使用して下気道からのサンプル(喀痰、気管支洗浄液、および肺胞洗浄液)を検出した肺 炎菌 感染とその複数の同時感染の代表的な結果を示します。要約すると、マルチチャンネルLAMP法は、臨床サンプル中の単一および複数の細菌性病原体を迅速かつ効率的に同定する手段を提供し、細菌性病原体の拡散を防ぎ、RTIの適切な治療を支援することができます。

概要

細菌性病原体によって引き起こされる気道感染症(RTI)は、主に世界中で罹患率と死亡率の一因となっています¹。これは、2〜3日間続く発熱を伴う上気道または下気道の症状として定義されます。上気道感染症は下気道感染症よりも一般的ですが、慢性および再発性気道感染症も一般的な臨床疾患であり、個人に大きなリスクをもたらし、医療システムに大きな負担をかけています²。RTIの一般的な細菌性病原体には、 Streptococcus pneumoniae³、 Haemophilus influenzae⁴、 黄色ブドウ球菌、 大腸菌、 Klebsiella pneumoniae、 Stenotrophomonas maltophiliaなどがあります。これらの病原菌は通常、宿主の鼻咽頭と上気道の粘膜表面にコロニーを形成し、喉の痛みや気管支炎などのRTIの典型的な症状を引き起こします。上気道から下気道の無菌領域に広がると肺炎を引き起こし、気道を通じて人から人へ広がる可能性があります⁵。重症の場合、侵襲性細菌性疾患、特に細菌性肺炎、髄膜炎、敗血症を引き起こす可能性もあり、これらは世界中のすべての年齢層の人々の罹患率と死亡率の主な原因です。

RTIの従来の検査には、咽頭スワブと喀痰呼吸器サンプルを使用した微生物学的培養が含まれます⁶。さらに、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの血清学的検査では、血清中の抗体や抗原を検出し、凝集検査では抗体や抗原の凝集反応を観察して感染を検出します⁷。微生物培養はRTIの診断のゴールドスタンダードと考えられていますが、培養陽性率が低く、信頼性が低く、検出サイクルが長いため、診断効率が制限されています⁸。実際には、RTIの迅速かつ正確な診断は、細菌性病原体の正確な根絶に不可欠です。迅速かつ効果的な検出方法は、病原体の感染率を減らし、感染期間を短縮し、不要な抗生物質の使用を減らすのに役立ちます^9,10。分子生物学に基づく方法は、標的遺伝子のDNA配列を増幅して病原体を検出するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)など、検出を大幅に迅速化します。しかし、従来のPCRでは、複雑な温度サイクル装置が必要であり、面倒で時間がかかります。さらに、PCR(リアルタイムPCRを除く)を使用したすべてのDNA増幅は、製品の電気泳動分離で終了しますが、これにも時間がかかります。製品の視覚化には染料が必要ですが、その多くは変異原性または発がん性があります。したがって、RTI細菌性病原体を診断するための新しい方法と技術を継続的に開発することが不可欠です。

Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)は、2000年にNotomiらによって最初に開発された新しい分子技術です¹¹。LAMPは、複雑な温度サイクル装置を使用せずに安定した等温条件下でDNAを増幅できるため、迅速な検出に適しており、装置の複雑さとコストが削減されます¹²。LAMPは、低濃度の標的DNAを高感度で検出できる¹³。複数の特異的プライマーを使用して、標的配列の選択性を向上させ、偽陽性の可能性を減らします¹⁴。LAMPは、RTIの検出にも、その容易さ、速度、直感的な操作により、臨床検査室で徐々に広く使用されています。本研究では、 図1に示すように、臨床検体(喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液)中の低RTI検出におけるLAMPの有効性を調査しました。LAMPは、低RTI検出で従来のテストよりも速度、感度、使いやすさなどの利点を提供し、有望なアプリケーションであることは明らかです。

図1:LAMP検出方式の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

この研究のすべてのサンプルは、広東省人民病院の倫理審査委員会によって評価および承認されました (承認番号: KY2023-1114-01)。すべての参加者は、実験の前に書面によるインフォームドコンセントに署名しました。本試験に使用した試薬および機器は、 資料表に記載されています。プロトコールで使用される略語は、 補足表1に記載されています。

1. 下気道からの臨床検体の採取

1. 痰コレクション
   1. 口腔と歯をきれいな水で洗浄し、必要に応じて義歯を確実に除去します。強く咳をして、深部の呼吸喀痰を喀痰容器(最小0.6 mL)に排出します。
   2. 唾液や鼻汁による汚染を避けてください。咳が困難な場合は、100 g / L NaCl溶液を45°Cで吸入して、 ?? 吐を促進します。.検体を滅菌済みの密封可能な容器に移します。
      注:喀痰サンプルが朝、抗菌薬を使用する前に収集されていることを確認してください。
2. 気管支洗浄液(BLF)
   1. コレクターヘッドを鼻孔または気管切開部位(深さ約30cm)から気管に挿入します。生理食塩水を5mL注入し、陰圧を確立し、コレクターヘッドを回転させてゆっくりと引き出します。
   2. 抽出した粘液を採取し、コレクターをサンプリング溶液(生理食塩水または注射用滅菌水)で一度すすいでください。または、収集の代わりに小児尿道カテーテルを50mLシリンジに接続します。.
3. 肺胞洗浄液(ALF)
   1. 胸部画像検査で病変の位置を特定します。洗浄のために最も重要な領域または急速に進行する領域を選択します。
   2. 洗浄中に生検チャネルを介して気管支セグメントに 1-2 mL の 2% リドカインを注入し、洗浄された肺セグメント¹⁵ に局所麻酔を提供します。静脈内全身麻酔下で、依然として強い気道反応を示す患者には、1〜2 mLの2%リドカインを注射します。.
   3. 局所麻酔後、口または鼻から光ファイバー気管支鏡を挿入し、咽頭を通って右中葉の気管支または左肺の舌側部分に入ります。その先端を気管支枝の開口部に置き、ゆっくりと滅菌生理食塩水を導入します。
   4. セッションごとに30〜50 mLの生理食塩水を100〜250 mLの容量で投与します(最大300 mL)。抽出した粘液を密封された滅菌容器に集めます。

2. DNA抽出

1. 下気道サンプルの粘度に基づいて、10%NaOHを適量添加します。粘度の低いサンプルの場合は、液化溶液のサンプルの2〜3倍の容量を追加します。中程度の粘度のサンプルの場合は、液化溶液のサンプルの5〜6倍の容量を追加します。粘度の高いサンプルの場合は、液化溶液のサンプルの8〜10倍の容量を追加します。
   1. サンプルの粘度に応じて10%NaOHの量を調整します。ボルテックスミキサーを使用してサンプルをできるだけ均一に15秒間分散させ、液化のために37°Cで30分間インキュベートします。
      注:サンプルが厚い場合は、NaOHの量を増やすか、液化時間を延長してください。サンプルの液化品質は、その後の抽出効率に直接影響します。理想的には、液化サンプルは、一貫性があり、粘着性のない一貫性を示す必要があります。
2. 液化したサンプル1mLを1.5mLの遠心分離チューブにピペットで移します。15,777 × g の速度で2〜6°Cで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を取り除き、廃棄します。
   注:サンプルを吸引するときは、チューブの底から不純物を引き出さないでください。不純物が多い場合は、吸引前にサンプルを1,753〜2,739 × g で1分間遠心分離できます。
3. 1 mLの洗浄液を遠心分離チューブとボルテックスに加えて、沈殿物をチューブの底から持ち上げます。完全に分散させる必要はありません。
   1. 溶液を15,777 × g で5分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿物に触れないようにしてください。
      注意: その後の増幅に影響を与えないように、洗浄液を完全に除去してください。
4. 100 μLの核酸抽出溶液を遠心分離チューブに加えます。ピペットを使用して沈殿物を吸引し、完全に混合します。液体を移し、一緒に沈殿させて核酸抽出チューブに入れます。核酸抽出溶液の組成を 表1に示します。
5. 核酸抽出チューブをボルテックスミキサーに入れ、中速で少なくとも5分間ボルテックスします。ボルテックス後、核酸抽出チューブを金属浴に移し、一定温度で100°Cで5分間加熱します。
6. 15,777 × g で2〜6°Cで5分間遠心分離し、取っておきます。
   注:PCR増幅反応を24時間以内に行うと、核酸は4°Cで保存できます。 増幅後、核酸を-20°Cで保存します。 長期保存(24時間以上)の場合は、核酸を-20°Cで保存してください。 再び使用する準備ができたら、サンプルを自然解凍し、ボルテックスで混合し、95°Cのウォーターバスで5分間加熱し、10,956 × g で1分間遠心分離し、上清をPCR増幅に使用します。

解決	コンポーネント	数	仕様
洗浄液	10 mM EDTA	1ボトル	24 mL /ボトル
核酸抽出試薬	10mM Tris-HCl、1mM EDTA、核酸保存料	2本のチューブ	1.2 mL /ボトル
核酸抽出チューブ	ガラスビーズ	1 バッグ	24本/袋

表1:核酸抽出試薬の組成。

3. ループ媒介等温増幅とマイクロ流体チップ

1. 試薬とマイクロ流体チップ
   1. マイクロ流体ディスク形状チップ上で等温増幅反応を行います( 材料表を参照)。65°Cで定温増幅を行います。
   2. 定温増幅マイクロ流体チップ核酸分析装置で蛍光色素取り込み法¹⁴ を用いてリアルタイム蛍光分析を行う。ストランド置換機能を持つポリメラーゼを使用して、陽性サンプルのS字型増幅曲線を観察します。
2. ループ媒介等温増幅
   1. 2つのインナープライマーと2つのアウタープライマー(LAMPキットに付属)を含む4つの特異的プライマーで6つのシーケンス領域をターゲットとします。
      注:DNAは、鎖置換機能を有するDNAポリメラーゼを用いて、一定の温度で連続的に複製および増幅されます。反応過程は、ダンベル型の鋳型合成段階、循環増幅段階、伸長段階、リサイクル段階を経て、最終的にステムループとカリフラワーのような構造のDNA断片の混合物を形成します。詳細については、キットの説明書(補足ファイル1)を参照してください。
   2. 反応システムに2ループプライマーを添加して反応効率を高め、ステムループ構造に結合してストランド置換合成と周期的複製を開始します。気道病原体用の核酸検出キットの組成を 表2に示します。
      注:試薬キットはLAMP法を採用しています。この原理は、約65°CでのDNAの動的平衡に基づいており、二本鎖DNAの相補部位で塩基対形成を介して伸びるプライマーは、もう一方の鎖を解離させ、一本鎖を形成します。
3. マイクロ流体チップ
   注:各マイクロ流体チップ( 材料の表を参照)には、反時計回りに番号が付けられた24個の反応ウェルが装備されており、ウェル1の入口と出口は反応ウェル1に対応しています(図2)。特定の核酸標的配列の増幅および検出のための特定のプライマーセットが各反応ウェルに埋め込まれ、固定されています。
   1. サンプルDNAを増幅試薬と混合します。混合物をチップに注入し、室温で1,000 × g で30秒間遠心分離する各反応ウェルに分配します。
      注:独立した等温増幅反応とリアルタイムの蛍光検出は、チップ上の各反応ウェルで同時に発生します。特定の反応ウェルでS字型の増幅曲線が検出された場合、そのウェルに対応する検出指数は正です。

コンポーネント	組成	数
欠く	プライマー	12スポット
シーリングフィルム	/	1枚入り
等温増幅試薬	蛍光色素、酵素	270μL/チューブ
ポジティブコントロール	大腸菌 ゲノムDNA	160μL/チューブ

表2:気道病原体用の核酸検出キットの組成。

図2:ディスクチップの構造図。 反応ウェルには反時計回りに連番が付けられており、入口/出口ポート1は反応ウェル番号1に対応します。反応ウェル1、4、7、10、13、16、19、22、および24はネガティブコントロールです。反応ウェル6はポジティブコントロール(大腸菌)である。反応ウェル12は内部ポジティブコントロールであり、反応ウェル23は外部ポジティブコントロールである。反応ウェル2は spnを検出します。反応ウェル3はsauを検出します。反応ウェル5は MRSAを検出する。反応ウェル8はkpnを検出する。反応ウェル9は 、パエを検出する。反応井戸11は 、abaを検出する。反応ウェル14は smaを検出する。反応ウェル15は hinを検出する。サンプルの詳細については、 表5 を参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. サンプル調製と細菌検出

1. 等温増幅反応システムの準備
   1. キットから等温増幅試薬を取り出し、室温で完全に解凍します。静かに振って十分に混合し、チューブの底に集めるために短時間遠心分離します。
   2. 試薬の保管および調製エリアで、等温増幅試薬20 μLを調製した200 μLの遠心分離チューブにピペットで移します。チューブを覆い、サンプルごとに1本の遠心分離チューブでサンプル調製エリアに移動します。
   3. 検体調製エリアに、目的の核酸サンプル34.5μLを加えます。穏やかに振って十分に混合し、短時間遠心分離してチューブの底に集めます。各核酸増幅反応システムの総容量は54.5μLです(表3)。
2. チップのロード手順
   1. チップのパッケージに、サンプル番号をラベル付けします。パッケージラベルを上にしてマイクロ流体チップを開きます。
   2. インレットポートとアウトレットポートが上を向くようにチップを配置します。ピペットを使用して、調製した増幅反応システムを50μL引き出し、インレットポートを介してチップのメインチャネルに加えます。メインチャネルがいっぱいになったら追加を停止し、糸くずの出ないティッシュで入口ポートと出口ポートの周りの余分な液体をすばやく拭き取ります。
   3. ピンセットを使用して1つのシーリングフィルムを拾い上げ、入口ポートと出口ポートに覆います。清潔なピペットチップをシールフィルムに一方向に押し付けます。しっかりと密閉してください。
3. qPCR反応
   1. 核酸分析装置の光源の予熱が完了したら、[ トレイを開く] ボタンをクリックします。チップの前面を上にしてチップをトレイに置き、位置決めする小さなシリンダーがチップの中央の隙間から出てきて固定されるようにします。トレイの中央位置決め装置をチップの中央の大きな穴に合わせます。
   2. [ Close Tray ]ボタンをクリックして、チップを核酸分析装置に挿入します。
   3. 検出インターフェースの [Sample Information ] 領域に、サンプルをテストするための情報を入力します。サンプル番号、チップ番号、およびサンプルタイプは必須です。その他はオプションです。
   4. 操作エリアの [Start Detection ]ボタンをクリックして、サンプル検出を開始します。装置は、プリセットプログラムに従ってサンプルテストを実施します。
      注意: 検出が完了すると、デバイスに付属のソフトウェアが自動的にデータ分析を行います。同時に、核酸分析装置は自動冷却プロセスを開始します。温度が37°Cに下がると、装置は自動的にトレイを開き、チップを取り出します。結果はシステムによって自動的に解釈されます(表4)。
4. 品質管理基準
   1. この試薬キットの各チップには、1つのポジティブな品質管理と9つのネガティブな品質管理が封入されています。ポジティブ品質管理の検出結果が陽性であること、および同時に、9 つのネガティブ品質管理すべての結果が否定的であることを確認します。
      注:画像の右側に「品質管理結果:実験正常(正の正常、陰性の正常)」と表示され、テスト結果が有効であることを示します。結果が正しくなく、サンプルテストの結果が無効と判断された場合は、再テストが必要です。ヒト特異的プライマーを用いた1つのポジティブ内部コントロールがチップに封入されており、その結果は臨床サンプル検査では陽性、サンプルのヒトゲノムDNA含有量が低い場合は陰性となり、細胞数が少ないことを示します。このような場合は、サンプルを再収集して再テストします。
5. 結果分析
   1. 検出が完了したら、ソフトウェアで市販のアルゴリズムと組み合わせた2次導関数の最大化法を利用して、急速増幅フェーズ中のS字型増幅曲線の最初の変曲点を計算します。詳細は、Respiratory Pathogens Nucleic Acid Detection Kit Instructions(補足ファイル1)の「Principles of the Test」の部分に記載されています。
      注:TP値は、変曲点と原点の時間差です。結果は、TPと正の判断値に基づいて解釈されます。検出インデックスの TP 値がそのインデックスの正の判断値以下の場合、そのインデックスは正と解釈されます。TP値が正の判定値を超える場合、指示書の「正の決定値」の基準に従って、負と解釈されます。「蛍光曲線領域」には正規化曲線が表示され、「検出結果」領域には各パラメータの品質管理と検出結果が表示されます(表5)。

反応	容量(μl)
等温増幅試薬	20
テンプレートDNA	34.5

表3:等温増幅反応システム。

歩	1	2
温度 (°C)	37	65
時間 (分)	3	47

表4:核酸増幅反応プログラム。

インジケーター名	ポジティブコントロールバリュー
Streptococcus pneumoniae(sp)	30
黄色ブドウ球菌(sau)	34
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(mrsa)	22
クレブシエラ肺炎(kpn)	29
緑膿菌(pae)	36
アシネトバクター・バウマニー(アバ)	36
ステノトロフォモナス・マルトフィリア(SMA)	27
インフルエンザ菌(hin)	36

表5:感染指標の陽性制御値。

結果

この実験では、等温増幅技術を用いて、マイクロ流体ディスクチップ上で反応を行います。反応は、蛍光色素挿入法を採用したマイクロ流体チップ核酸分析装置で行われます。等温反応は65°Cの一定温度で行われ、リアルタイムの蛍光分析が同時に行われます。陽性サンプルは、鎖置換機能を持つポリメラーゼの作用下で増幅され、S字型の増幅曲線が得られます。このワンステッププロセスにより、標的遺伝子の増幅と検出が完了します。この研究では、実験デザインの信頼性を実証するために、実験結果が異なる7つのサンプルを選択しました。大文字の S はサンプルを表します。S1は 、K. pneumoniaeの単一株に感染したサンプルです。S2〜S7は多菌感染のサンプルで、すべて 肺炎菌に感染しています。効果的な検出結果を得るために、画像に表示された正規化された蛍光曲線を通じて解釈を行うことができます。正の指標はS字型の増幅曲線で表され、水平線は負の指標を表します(図3)。

図3: LAMPによる 代表的な核酸増幅結果。 大文字のSはサンプルを表します。S1は、 kpnの単一株に感染したサンプルです。S2からS7は多微生物感染のサンプルで、すべて kpnに感染しています。S2 は kpn と sma に感染したサンプルを表します。S3は、 kpn、 sau、およびMRSAに同時に感染したサンプルを示します。S4は、 kpn、 sau、 MRSA、および abaに同時に感染したサンプルを意味します。S5 は、 kpn、 sma、 sau、 MRSA、 および aba に同時に感染したサンプルを示します。S6は、 kpn、 sma、 pae、 sau、MRSA、 およびabaに同時に感染したサンプルを示します。S7は、 kpn、 sma、 pae、 sau、 MRSA、 aba、および 大腸菌に同時に感染したサンプルを表します。サンプルの詳細については、 表5 を参照してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この試薬キットは、ROC法を利用して、8つのテストインジケーターの正の閾値を計算します。検出インジケータの TP 値が対応する正のしきい値以下の場合、そのインジケータは正と解釈されます。逆に、検出インジケータのTP値が正のしきい値より大きい場合、負と解釈されます。各指標の正のしきい値を 表5に示します。異なる実験結果を持つ 7 つのサンプルで検出した真陽性の TP 値を 表 6 に示します。

見本	KPNの	SMAの	ペー	ザウ	ミスターサ	ホアヒン	アバ	環境
	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)	TP (+/-)
S1の	19.68 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S2の	17.73 (+)	18.30 (+)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)	U (-)
S3の	16.73 (+)	U (-)	U (-)	18.05 (+)	12.18 (+)	U (-)	U (-)	U (-)
S4の	21.66 (+)	U (-)	U (-)	27.07 (+)	19.61 (+)	U (-)	18.29 (+)	U (-)
S5の	16.16 (+)	20.85 (+)	U (-)	23.80 (+)	17.13 (+)	U (-)	15.22 (+)	U (-)
S6の	11.20 (+)	16.79(+)	17.18(+)	23.09 (+)	16.14 (+)	U (-)	14.28 (+)	U (-)
S7	14.69 (+)	24.84(+)	19.70(+)	24.07(+)	14.16 (+)	- (+)	15.23 (+)	20.12 (+)
各サンプル+/-、定性的結果; +、肯定的な結果。-、否定的な結果。

表6:感染後の検出のためのTP値の表。

補足表1:略語のリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:呼吸器病原体核酸検出キットの説明書。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

気道感染症は、院内感染症として蔓延しており、患者に深刻な影響を及ぼし、死亡率を上昇させています¹⁶。潜在的な病原体をタイムリーかつ正確に特定し、その後に効果的な抗生物質を使用することは、特に伝統的な培養方法に固有の制限を考えると、治療を成功させ、予後を改善するための鍵です¹⁷。この研究では、LAMPベースの方法を使用して、RTIの迅速かつ正確な検出のために、単一または複数の感染を特定しました。この高速検出システムは、LAMP技術とマイクロ流体技術を組み合わせることで確立されています。喀痰、BLF、ALFなどの臨床検体からの核酸を迅速に抽出できます。この抽出された材料は、細菌性病原体の迅速かつ正確な検出を容易にし、RTIの制御と治療を改善するための臨床実践を導きます。

以前の研究では、培養ベースの方法やポリメラーゼ連鎖反応と比較して、LAMPの結果は100%の感度、特異性を達成し、純粋な培養物や血液サンプルで他の細菌との交差反応がないことが示されている¹⁸。LAMPアッセイは、血液、胸水、腹水、脳脊髄液などの体液から直接病原体を検出することもできる¹⁹。外因性DNAおよび阻害剤がPCRの感度を著しく低下させる可能性があることが以前に実証されており、LAMPアッセイでは、臨床検体からのDNAの精製は必要ない²⁰。この手法では、増幅プロセス中に酵母遺伝子とプライマーを利用して増幅の正常性を評価し、それによって外部制御品質管理の適格性を決定します。ヒト遺伝子由来のプライマーを用いた内部制御により、サンプリング、核酸抽出、増幅プロセスの正常性が決定されます。内部制御と外部制御を同時に使用することで、結果の信頼性を確保します。同時に、複数のポジティブコントロールウェルとネガティブコントロールウェルも設置されており、テストの精度が大幅に向上しています。LAMPマイクロ流体チップは、臨床検体の検出においてqPCRと同様の機能を備えています。高感度と強力な検出能力の特性を持ち、迅速な臨床検出と正確な治療のための信頼性の高い基盤を提供します²¹。微生物の培養には3〜5日以上かかり、クラミジア・ニューモニアやレジオネラ・ニューモフィラなどの一部の病原体は培養できません。対照的に、LAMPは、培養不可能なものも含めて複数の細菌性病原体を3時間未満で検出するため、検出速度が大幅に向上します。

また、複数の検出を実行することもできます。LAMPマイクロ流体チップは、複数の病原体を並行して検出するさまざまな反応ユニットに分割されており、各反応の独立性と結果の精度を確保しています^22,23。China Network Antibacterial Surveillance Centerのデータによると、2022年に呼吸器検体から分離された細菌の中で、K. pneumoniaeの有病率は1位にランクされました¹⁵。2022年に広東省人民病院が収集した呼吸器サンプルのうち、LAMPによって検査された肺炎桿菌の陽性率は18.6%であり、これも最も有病率の高い細菌の1つです。K. pneumoniae陽性の全サンプルのうち、30.6%はK. pneumoniaeのみによる感染症であり、29.7%はK. pneumoniaeが他の細菌種と共存した感染症であった。また、K. pneumoniae感染が関与する三重感染(23.9%)と四重感染(10.5%)があり、KP陽性サンプルの大部分(約95%)を占めていました。五重および六重感染症の症例は非常に少なく、現在のところ、六重を超える感染症は検出されていません。結果は6つの代表的なシナリオを示しており、それぞれが肺炎菌単独または1〜5の他の細菌種と共存することによって引き起こされる感染症の検出結果を表しています。

さらに、この研究で使用されたLAMPチップ技術は、細菌耐性も検出できます。メチシリン耐性MRSAをmecA遺伝子を介して検出します。黄色ブドウ球菌を表すウェルとmecA遺伝子のウェルが陽性の場合、それらはメチシリン-MRSA感染を表しています。研究者たちは、病原体と抗生物質耐性形質を同時に迅速に検出する方法を継続的に研究しています。例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌感染と抗生物質耐性の迅速診断法は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)²⁴に基づいている。また、表面増強ラマン散乱(SERS)スペクトルの深層学習解析による多剤耐性肺炎菌の迅速な予測²⁵や、SERSスペクトル²⁶を用いた肺炎菌およびカルバペネマーゼ遺伝子の検出方法も考えられます。さらに、SERSスペクトル分析²⁷に基づく、肺炎桿菌株の異なる多遺伝子座配列タイピング(MLST)プロファイルの分類および予測方法がある。また、その後、肺炎桿菌およびカルバペネマーゼ遺伝子の高感度かつ正確な検出を開発し、時間のかかる、または高価な専門機器に基づくゴールドスタンダードの臨床法に匹敵する性能を発揮します。さらに、理想的な診断アプローチは、迅速、正確、費用対効果が高く、ユーザーフレンドリーな¹⁸です。現在の診断技術の試薬のコストを見積もった研究では、PCR技術に基づくサンプル検査のコストが最大6.4〜7.7米ドルであるのに対し、LAMP技術ではわずか0.71〜2米ドルであることが示され^ました28。

マルチチャンネルループ媒介等温増幅(LAMP)法は、気道感染症における細菌性病原体の迅速な検出に大きな利点をもたらしますが、これには限界があります。LAMPの高感度は、最小限のDNA汚染が偽陽性の結果につながる可能性がある交差汚染のリスクをもたらします²⁹。したがって、このリスクを軽減するには、厳格なサンプルの取り扱いと手順のプロトコルが必要です。この手法は単純ですが、結果の解釈には、誤解や診断エラーを避けるために特定の専門知識と経験が必要であり、十分な訓練を受けた人材の必要性が強調されています。これらの制限を認識することは、臨床診断の分野でLAMP法を効果的に適用し、さらに発展させるために不可欠です。LAMP 法とマイクロ流体チップを組み合わせることで、さまざまな細菌性病原体を並行して迅速に検出できます。高感度と強力な特異性という利点と、低コスト、迅速性、利便性という特徴があります。これは、臨床現場での病原性感染によって引き起こされるRTIを予防および制御するためのかなり実用的な重要性を示しています。本研究で提案したLAMP検査の大きな特徴は、検査室のスタッフが習得しやすいことであり、これは一次病院、疾病予防、管理センター、検査検疫部門にとって大きな助けとなっています。要約すると、LAMPマイクロ流体チップシステムは、臨床検査室での強力な検出ツールであり、臨床感染診断における高支出と短いターンアラウンドタイムの課題を解決でき、臨床現場での大きなアプリケーション価値があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バスインキュベーター(MK2000-2)	ALLSHENG		は、気
管支洗浄液コレクターヘッド	TIANPINGHUACHANG	SEDA 20172081375	管支肺胞洗浄液の収集
光ファイバー気管支鏡	OLYMPUS	SEDA 20153062703	光ファイバー光源とカメラを装備した柔軟な気管支鏡で、肺内の気道や構造を視覚的に検査します。気管支肺胞洗浄液の収集をアシスト
HR1500-B2	ハイアール	SEDA 20183541642	バイオセーフティキャビネット
NAOH	MACKLIN	S817977	粘性下気道サンプルの液化
気道病原体のための核酸検出キット	Capitalbio Technology	SEDA 20173401346	細菌感染の検査
核酸抽出試薬	Capitalbio Technology	SEDA 20160034	DNA用抽出
RTisochip-W	Capitalbio Technology	SEDA 20193220539	ループ媒介等温増幅
THERMO ST16R	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SEDA 20180585	チューブの壁に残った液体を遠心分離します。
ボルテックスミキサー VM-5005	JOANLAB		撹拌試薬用