方法論記事

マウス膵臓内皮細胞の単離

3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

2024年6月21日

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

この記事について

サマリー

このプロトコルは、全膵臓からのマウス内皮細胞の単離を説明しています。

要約

膵臓は、インスリンやグルカゴンなどの代謝ホルモンや消化酵素の産生など、体内の代謝バランスを維持するための重要な臓器です。膵臓は高度に血管新生された器官でもあり、膵臓の毛細血管の複雑なネットワークによって促進される特徴です。この広範な毛細血管ネットワークは、膵臓の発達と機能に重要な高度に穴あき内皮細胞(EC)で構成されています。したがって、ECの機能不全は、糖尿病や癌などの疾患における膵臓の機能不全に寄与する可能性があります。このように、膵臓EC(pEC)の機能を研究することは、膵臓の生物学を理解するだけでなく、その病態を発展させるためにも重要です。マウスモデルは、代謝性疾患や心血管疾患を研究するための貴重なツールです。しかし、ECの集団が比較的少なく、腺房組織から放出される可能性のある消化酵素が豊富であるため、細胞の損傷につながる可能性があり、したがって収率が低いため、マウスpECの単離について十分な詳細が記載された確立されたプロトコルはありませんでした。これらの課題に対処するために、私たちは、穏やかな物理的および化学的解離と抗体媒介選択を組み合わせて、マウスのpECを濃縮および回復するためのプロトコルを考案しました。ここで紹介するプロトコルは、マウスの膵臓全体から無傷で生存可能なECを抽出するための堅牢な方法を提供します。このプロトコルは、複数のダウンストリームアッセイに適しており、さまざまなマウスモデルに適用できます。

概要

代謝制御と恒常性の鍵となる膵臓は、高度に血管新生された器官です。膵臓には内分泌機能と外分泌機能の両方があり、それぞれ血糖値と消化酵素の調節を制御しています。これらの2つのコンパートメントは、膵臓血管の広範なネットワークによってリンクされており、酸素、ホルモン、および酵素の交換と輸送を促進します。重要なことに、この密集した毛細血管網は、グルカゴン分泌アルファ(α)細胞、インスリン分泌ベータ(β)細胞、およびソマトスタチン分泌デルタ(δ)細胞からなる、膵臓内の内分泌機能を担うホルモン調節細胞のクラスターであるランゲルハンス島に浸透しています1,2。膵島は膵臓の質量の1〜2%しか占めていませんが、総血流の20%を受け取っています3、膵島の血管系の重要性が強調されています。膵臓の毛細血管は、主に高度に穴あきされた内皮細胞(EC)で構成されており、壁画の周皮細胞に囲まれています。これらの毛細血管ECは、膵島の発生、成熟、および(機能不全)に重要な役割を果たし、さまざまな内分泌細胞および外分泌細胞4と密接なクロストークを形成します4(図1)。

内皮機能障害は、膵島の機能障害によって引き起こされる最も一般的な状態である1型糖尿病と2型糖尿病の両方で観察されています5,6。膵島微小血管密度と形態はどちらも糖尿病で変化する可能性があります7。さらに、膵臓がんは、糖尿病としても現れる可能性のある非常に侵攻性の高い腫瘍であり、灌流不良の微小血管密度が高いという特徴があります8。正常な膵臓組織と疾患のある膵臓組織の両方におけるECの重要な構造的および機能的役割を考えると、健康や疾患を引き起こすメカニズムを明らかにするために、発生、生理学、および病理学におけるpECを研究することが適切に必要です。

異なるマウス(例えば、脳9,10、肺11、心臓12、肝臓13、骨格筋14、および脂肪組織15)およびヒト(例えば、脳16、内臓脂肪組織17,18、末梢神経19、肺20,21,22、および腸間膜動脈23)からECを単離するために、多数のプロトコルが開発されてきた)ティッシュ。これらのプロトコールは、典型的には、酵素消化(例えば、コラゲナーゼ、トリプシン24、ディスパーゼ24、25、およびリベラーゼ26)の使用と、それに続く抗体ベースの濃縮ステップを含む。さらに、これらのプロトコルは、37°Cで激しく攪拌する高濃度の酵素での長時間の消化に依存する傾向があります(表1)。膵臓には多数の内因性消化酵素が収容されているなど、膵臓のユニークな特徴があるため、これらの既存のプロトコルを直接pECの単離に適用することはできません。まず、膵臓の細胞外マトリックス(ECM)組成は他の組織とは異なります。コラゲナーゼはEC単離に一般的に使用されますが、組織特異的な解離能力が異なる複数のサブタイプが存在するため、最適化が必要です。第二に、pEC単離にとって極めて重要なのは、膵臓内因性酵素の放出と活性化が単離プロセスを大幅に妨げることです。この目的のためには、外分泌腺房細胞(チモーゲン、プロテアーゼ、およびRNase27の主要な供給源)の破裂を最小限に抑えるために注意を払う必要があり、これによりさらなる細胞損傷が誘発され、細胞生存率が低下し、全体的な回復に影響を与える可能性がある27,28,29。

これらの課題に対処するために、既存のEC単離プロトコルの方法を適応させ、マウス膵臓からのEC単離に適した新しいプロトコルを確立しました。具体的には、ここでは、コラゲナーゼI型(通常は肺EC単離に実施)、消化温度の低下と攪拌なし(膵臓のチモーゲンの活性化を防ぐため)、およびDNase30,31,32の補給(DNA誘導性アポトーシスを予防し、細胞生存率を向上させるため、およびCD31に対する抗体)を使用するワークフロー(図2)について説明します33(PECAM1、pan-ECマーカー)。記載されたプロトコルは、マウスの膵臓から単離されたEC集団を産生し、これは遺伝子発現プロファイリングおよびタンパク質アッセイに使用できる。

プロトコル

組織単離は、承認された研究プロトコル#17010に基づいて、City of Hope(米国カリフォルニア州ドゥアルテ)のBeckman Research InstituteのInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって実施されました。ここでは、Tie-2CreERT2を使用します。8 - 12週齢のC57BL/6背景のRosa26-TdTomatoマウス系統。このラインでは、ECは、前述の34のようにタモキシフェンで誘導されるとTdTomatoで標識される。しかし、このプロトコルは、異なる遺伝子型および遺伝的背景を持つ成体マウスのすべての年齢に適応させることができます。

1.ティッシュコレクション(推定時間:1〜2時間)

注:時間の見積もりは15分/動物で、解離サンプルごとに最大3匹の動物をプールすることをお勧めします。

  1. 二酸化炭素(CO2)の過剰摂取により動物を安楽死させ、続いて死亡の二次確認を行います。解剖前に全身に70%エタノール(EtOH)を噴霧し、手術部位を完全に消毒します。
  2. ピンを使って手足を伸ばして固定します。手術用ハサミを使用して、下腹部から胸部に向かって伸びる皮膚と腹膜を通る小さな正中線切開を行います。
  3. 横隔膜を切開して胸郭を露出させ、胸郭を持ち上げて心臓を露出させます。
  4. 氷冷滅菌PBSを含む注射器に接続された針(25G-30G)を心臓の左心室に挿入します。
  5. 5〜10 mL / minの速度で心臓にPBSを注入することにより、灌流を開始します。10mLの注入後、または肝臓や腎臓が変色するまで停止します。
  6. 灌流後、膵臓(胃の下にあり、十二指腸に付着している)35 (図3A)の位置を特定し、解剖ハサミと鉗子を使用して慎重に除去する。
  7. 単離したら、10 mLの氷冷PBS + 0.2 mg / mLトリプシン阻害剤を含む50 mLチューブに膵臓を移し、氷上に保ちます(図3B)。
    注:このステップで最大3匹のマウスの膵臓をプールし、1本のチューブに移すことができます。サンプルは最大2時間氷上に保持できます。

2. コラゲナーゼの調製(所要時間:15-30分)

  1. 以下に説明するように溶液とバッファーを調製します。
    1. 解離溶液:コラゲナーゼI型を50 mLチューブに50 mLチューブに加え、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS 1x(Ca2+、Mg2+; 材料表を参照)および0.001 U/mL DNase I + 0.2 mg/mLトリプシン阻害剤の最終濃度1 mg/mLにします。
    2. 解離停止溶液:リン酸緩衝生理食塩水(PBS 1x、Ca2+、Mg2+なし、このプロトコルのすべての残りのPBSについて同じ; 材料の表を参照)、5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.001 U/mL DNase IまたはDMEM + 10%FBS + 0.001 MU/mL DNase Iを添加します。
    3. 洗浄バッファー:PBS 1x、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.001 U/mL DNase I + 0.05 mg/mLトリプシン阻害剤を添加します。
  2. バッファーを完全に溶解し、0.22 μmフィルターでろ過します。脇に置いて氷の上に置いておきます。

3.消化(推定時間:40分-1時間)

  1. 氷冷したPBSから膵臓を取り出し、氷の上のペトリ皿の上に置きます。余分な組織(脾臓、脂肪、破片など)を手術用ハサミとピンセットで慎重に取り除きます(図3C)。
    注:過剰な脂質は組織の消化を妨げる可能性があるため、脂肪を取り除くことが重要です。
  2. トリミングしたマウス ?? 臓を、1 mL の解離溶液が入った 5 mL チューブに移します。
  3. チューブを氷の上に置いたまま、解剖ハサミで膵臓組織を0.5mmや1mmなどの細いピペットで切ることができます。ライセートを50 mLチューブに移し、氷上に保管します。
  4. 最初に膵臓組織をミンチするために使用した5mLチューブに膵臓を追加し、さらに1mLのコラゲナーゼを追加します。必要に応じて、複数の ?? 臓の準備について繰り返します。.
  5. 5 mLチューブに2 mLのコラゲナーゼ溶液を加えて、残存する膵臓組織を除去し、50 mLチューブに移します。コラゲナーゼの総量は、3つの膵臓で5 mL、1つの膵臓で3 mLである必要があります。
  6. すべてのサンプルが機械的解離を受けたら、均質化した組織溶解物を含む50 mLチューブを37°Cのウォーターバスに移し、10分間インキュベートします。
    注:このプロセス中は、腺房組織の破裂や豊富な内因性酵素やDNAの放出を引き起こす可能性があるため、組織混合物を激しく攪拌したり渦巻きにしたりしないでください。
  7. チューブをウォーターバスから取り出し、静かに渦巻いてよく混ぜ合わせ、さらに10分間ウォーターバスに入れます(合計時間:20分)。
    注意: 過剰消化を避けるために、30°Cのウォーターバスで37分を超えないようにしてください。
  8. チューブを氷の上に置き、ホモジネートを重力で沈殿させます。落ち着いたら、上清を70 μmフィルターにかけ、5 mLの解離停止溶液を加えます。
  9. 残りのペレットにさらに1 mLの解離溶液を加え、18Gの針で粉砕します。
  10. 残りのホモジネートをフィルターに通し、さらに5 mLの解離停止溶液で洗浄します。
  11. スピンセル懸濁液を300 x g で10分間、4°Cで保存します。 吸引によって上清を完全に除去し、細胞ペレットを氷上に保ちます。
  12. 細胞ペレットを1 mLの洗浄バッファーで再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
  13. 再懸濁した細胞ペレット(10 μL)から少量のアリコートを取り出し、トリパンブルーと1:1の比率で混合し、セルカウンターを使用して細胞をカウントし、生存率を測定します。

4. 内皮細胞(EC)の濃縮(推定時間:2-3時間)

  1. 1 x 107 細胞ごとに1 μLの抗CD31-ビオチン抗体を添加し、ローテーター上で4°Cで30分間インキュベートします(膵臓3個あたり約5 μL)。
  2. 20 μLの抗ビオチンマイクロビーズを添加し、チューブローテーター上で4°Cで40分間インキュベートします。
  3. カラムセパレーターホルダーにマグネットスタンドを取り付け、カラムを装着します。3 mLの洗浄バッファーでカラムを平衡化します。
  4. サンプルをカラムに加え、合計9 mLの洗浄バッファーで洗浄します。
    注:細胞濃度が高い場合は、別のチューブで追加の2 mLの洗浄バッファーで細胞を希釈します。一度に1 mLのサンプルをカラムに加え、カラムの目詰まりを防ぎます。
  5. カラムホルダーからカラムを取り出し、15 mLチューブに入れます。5 mLの洗浄バッファーをカラムに加えます。プランジャーを使用してカラム内の細胞を押し下げ、溶出物(濃縮ECを含む)を収集します。
  6. フロースルーおよび溶出/ECフラクションを300 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。 ステップ3.13のように細胞をカウントし、生存率を測定します。
  7. フロースルーおよびECフラクションのqPCRによるEC濃縮を検証します。NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) を内分泌細胞の一般的なマーカーとして使用し、EC33 のマーカーとして血小板および内皮細胞接着分子 (Pecam1) を使用します。36B4(Rplp0、酸性リボソームリン酸化タンパク質p0)を遺伝子発現の正常化のための内部コントロールとして使用します。
    注:このステップでは、収集したサンプルをタンパク質またはRNA分析に使用できます。

5. pECの培養

  1. M199ミディアムを用意します。M199を中程度から最終濃度の20%ウシ胎児血清(FBS)と0.1%ペニシリン-ストレプトマイシンで補います。.
  2. 60 mmの細胞培養プレートにI型コラーゲン(0.1 M酢酸に1 mg/mL)をコーティングし、室温で30分間静置します。
  3. I型コラーゲンを取り除き、プレートを1X PBSで2回すすぎます。調製したM199培地2 mLを加え、細胞培養プレートを標準細胞培養インキュベーター(5% CO2、37°C)に5分間置きます。
  4. 細胞を単離したら、単離した細胞を予熱したM199細胞培養プレートに加えます。細胞を培養条件で約14日間保持し、2〜3日ごとに培地を交換します。

結果

このプロトコルに従うと、3つのマウス膵臓、および1つのマウス膵臓から750,000個の細胞をプールすると、約2×106 個の生細胞を得ることができます。ECの濃縮を検証するために、我々は以下の分析を行った:1)定量的PCR:フロースルー(FT)サンプル(すなわち、非CD31抗体結合画分)と比較して、EC画分は 、Pecam1 (CD31をコードする)および Kdr (VEGFR2をコードする)のレベルが有意に高かった、2つのECマーカー遺伝子33、および膵臓内分泌細胞の転写因子であるNK6ホメオボックス1(Nkx6.1)のレベルが低かった(図4A));2)ウェスタンブロッティング:3種類の調製物(pEC-1-3)から得られたEC濃縮サンプルは、予想サイズ(~130 kDa)でCD31の強いシグナルを示しました。これに対し、インプットサンプルとFTサンプルは最小限のCD31シグナルを示しました。ポジティブコントロールとして、MS1細胞(pEC細胞株)のライセートも強いCD31シグナルを示しました(図4B)。3)トリパンブルー染色:単離された細胞の生存率は約50%であることがわかりました(図4C)。4) 公開されたプロトコル15 に従ったフローサイトメトリー:生細胞集団のゲーティング(図4D)により、CD31+細胞は88%、TdTomato+細胞は76%であることがわかりました。注目すべきは、単離された細胞の大部分がCD31とTdTomatoを共発現することです(図4E)。ネガティブコントロールとして、未染色のMS1細胞およびIgGとインキュベートしたMS1は、CD31でマークされた生細胞を示さなかった。ポジティブコントロール、すなわちCD31について染色されたMS1細胞は、ほぼ100%の生CD31+細胞を示しました(図4F)。また、単離された細胞を培養し、公開されたプロトコル36に従ってPECAM1の免疫蛍光染色を行い、TdTomatoを画像化したところ、単離された細胞内の両方のマーカーの強力なシグナルが示され、ECの存在が示唆されました(図4G)。

血管構造研究と細胞相互作用分析のための膵島内ECを示す膵臓図。
図1:膵臓と膵島の血管新生の図。 膵臓内皮細胞(EC)と膵島内ECの絵の描写。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

単一細胞膵臓の調製図;遠心分離、CD31-ビオチン標識、フロースルー分析。
図 2: ワークフローの概要。 1)膵臓の解剖、2)機械的消化、3)酵素インキュベーション、4)遠心分離、5a)上清除去、5b)細胞ペレットの二次コラゲナーゼ消化、6)、7)、8)ペレットの再構成と抗体結合、9)マイクロビーズインキュベーション、10)MACSカラム濃縮、11)生存率のための細胞カウント、および12)ダウンストリーム分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

生物学研究における膵臓の採取、単離、およびトリミングプロセスを示す組織解剖。
図3:組織処理ステップ。 (A)腹腔、(B)孤立したマウスの膵臓、および(C)トリミングされたマウスの膵臓の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

遺伝子発現、CD31解析、DAPI、細胞選別、蛍光、フローサイトメトリーの結果。
図4:マウス膵臓から単離されたEC画分の検証(A)FTサンプルとCD31による濃縮EC画分のqPCR。Pecam1(CD31)、Kdr(VEGFR2)、およびNkx6.1(膵臓β細胞特異的転写因子)33。*は、t検定に基づくFTと比較したp <0.05を示します。n = 3-4個のプールされたサンプル、それぞれ3匹のマウスからなる。(B)CD31のウェスタンブロッティング。pEC-1-3は、3つの別々のプールされたマウスサンプルから濃縮されたECを示します。30 mgの細胞ライセートを各レーンにロードし、続いてPonceau S染色を行いました。(C)生存率アッセイのための濃縮pECの細胞計数およびトリパンブルー染色。(D)4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)およびCD31抗体で染色したマウスpECのフローサイトメトリーゲーティング戦略。(E)未染色のMS1(左上)、AlexaFluor-488二次抗体で染色したMS1(IgGコントロール、右上)、CD31で染色したMS1(左下)、CD31で染色した単離マウスpECのフローサイトメトリーヒストグラム(右下)。(F)フローサイトメトリーを使用して定量した生細胞の割合。(G)DAPI(青)対比染色および内因性TdTomato蛍光レポーター(赤)によるCD31発現(緑)の免疫蛍光染色。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

免疫蛍光顕微鏡によるCD31/CD144/DAPI,Cdh5,Pecam1のUMAP遺伝子発現解析
図5:マウス膵臓におけるCD31およびCD144特異性 (A)CD31(マゼンタ)およびCD144(シアン)を用いたマウス膵臓のDAPI対比染色による免疫蛍光。広視野蛍光倒立顕微鏡で10倍レンズを使用して撮影した画像。スケールバー = 100 μm。破線は小島の面積を区切っています。(B)scRNA-seq(GSE128565)37により検出されたC57BL6マウスの膵島ECにおけるCdh5およびPecam1の発現を示すUniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

酵素使う温度と時間参考
コラゲナーゼI単一細胞解離、全膵膜EC濃縮37°C、20分このプロトコル
コラゲナーゼIV膵島分離および非酵素的解離37°C、20分46
コラゲナーゼ+トリプシンマウス膵臓の管細胞の検査37°C、30分47
コラゲナーゼB膵臓の単細胞懸濁液37°C、30分48
コラゲナーゼNBI膵島の分離37°C、30分49
コラゲナーゼPAcinar 実行可能なサスペンション37°C、15分45
コラゲナーゼXI膵島の分離37°C、15分35
ディスパーズシングルセル懸濁液37°C、45分24
リベラーゼシングルセル懸濁液37°C、10分25, 48
トリプシン単一細胞解離、全膵臓4 °C、O/N28

表1:マウス膵臓サンプルの処理に使用されるさまざまなプロトコルの概要。

ディスカッション

この記事では、pECの濃縮と単離のためのプロトコルを紹介します。他の組織や臓器からの以前のEC単離プロトコルと同様に、このプロトコルは、物理的解離、酵素消化、および抗体ベースのEC濃縮という3つの主要なプロセスで構成されています。膵臓の処理における特有の課題に対処するために、私たちはプロトコル内にいくつかの重要な適応と重要なステップを導入しました:1)短いインキュベーション時間での穏やかなワンステップコラゲナーゼ消化、2)高濃度のDNaseとトリプシン阻害剤の補給により、DNA汚染と内因性酵素消化を最小限に抑え、抗体結合を妨害し、ECの濃縮と生存率を低下させる可能性があり、3)消化ステップ後の細胞カウントをどのように調整するか。ECの濃縮を最適化するために、多くの抗体がサンプルに添加されます。このプロトコールを最適化する過程で、以前の研究で使用された他の酵素(トリプシン28、コラゲナーゼIV型31など)、その他の消化温度(4°Cなど)、および異なるインキュベーション時間をテストしました(表1)。コラゲナーゼI型、37°Cで20分間、マウスpEC単離の最適条件であることを発見し、ここで使用しました。灌流中に抗凝固剤を添加すると、細胞全体の生存率が向上する可能性がありますが、EDTAやヘパリンなどの一般的な抗凝固剤は、細胞解離のためのコラゲナーゼやqPCRで使用される逆転写酵素などの特定の酵素の活性を妨害する可能性があります。これらの抗凝固剤の予期せぬ/望ましくない影響を防ぐために、灌流にはPBS(Ca2+ およびMg2+なし)が使用されます。

私たちは、マウス膵臓全体からEC集団を濃縮するためのプロトコルの開発に焦点を当てました。これにより、膵島内ECと外分泌組織中のECの両方が含まれ、その結果、より高い収量が得られます。現在のプロトコルでは、解離ステップ中に3匹の動物をプールし、平均して約2.0 x 106 個の生存細胞を持つ単一細胞懸濁液を達成しました。また、マウス1体の膵臓からのサンプルも試験しており、約750,000個の細胞が取得できます。1匹の動物を処理するように調整する場合は、より少ない解離溶液(膵臓あたり3mLの解離)を使用する必要があることは注目に値します。プロトコルの重要なステップは、膵臓に付着している残留脂肪を完全にトリミングして除去することです(図3B)。コラゲナーゼ消化における脂肪組織の汚染は、膵臓の単一細胞解離ステップを妨害し、その後の濃縮ステップ38における細胞生存率を低下させる。さらに、pECを濃縮するために、pan-EC表面マーカーであるPECAM1/CD31を使用しました。PECAM1/CD31抗体を用いて、EC画分を大幅に濃縮することができたことは、遺伝子発現解析で明らかになりました。このプロトコルの開発では、EC13の単離にも一般的に使用されているCD144抗体の有用性も検証しました。しかし、pECをエンリッチすることはできませんでした(データは示されていません)。興味深いことに、免疫蛍光染色により、CD31は膵臓組織のすべてのECで発現しているのに対し、CD144抗体は膵島内のECのみを染色するように見えることが明らかになりました(図5A)。さらに、C57BL/6マウスから単離された膵島からの公開されているシングルセルRNA-seqデータを解析した（GSE128565）37 、膵島ECの約50%がCdh5(VE-Cad)とPecam1の両方を発現しているが、残りの膵島ECはCdh5またはPecam1のみを発現していることがわかった（図5B)。したがって、CD31抗体はpEC単離により適切であり、この目的に対するCD144抗体の有用性は将来の調査を正当化すると推測します。さらに、磁気ビーズで結合した市販の抗CD31抗体があり、これにより、2段階の抗体結合ステップを単一のステップに簡素化できます。

実証されたように、qPCR、イムノブロッティング、フローサイトメトリー、および免疫蛍光染色を実施して、単離されたECフラクションを検証しました。これらの画分は、(sc)RNA-seqや質量分析などの他のアッセイにかけることができると考えられます。このプロトコルの限界は、堅牢な継代培養を達成し、機能アッセイを行うことができなかったことです。単離されたマウスECのサブカルチャーが困難であることが示されていることを考えると、これは将来の取り組みが必要な分野です。これに対処する一つの方法は、初代細胞39を不死化するために使用されてきた大きなT抗原の導入であり得る。

scRNAシーケンシングの最近の進歩と応用により、膵臓細胞40、特に膵島細胞41の高解像度プロファイリングが可能になりました。しかし、既存の研究のほとんどは内分泌細胞集団に焦点を当てており、ECを効率的に保持しない組織解離プロトコルを使用していました。その結果、EC画分はしばしば不足し、捕捉された細胞集団全体の3%〜5%しか構成しない42,43,44。最近のプロトコルでは、2段階の酵素消化と不活性化、および蛍光活性化された細胞選別ステップを使用し、全膵臓細胞集団の12%でECを回収する45。このプロトコルを補完する当社のプロトコルは、簡素化されたワークフローを提供し、ECが研究の焦点である場合、より費用対効果が高く、技術的な要求が少なくなる可能性があります。このプロトコルはマウスの膵臓でのみテストされていますが、スケールアップして、ヒトの膵臓を含む他の生物からECを分離するように適応させることができます。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者は、シティ・オブ・ホープのブライアン・アームストロング博士とカリフォルニア大学リバーサイド校のミンディ・ロドリゲス氏に技術支援に感謝します。この研究は、NIH(R01 HL145170からZBC)、Ella Fitzgerald財団(ZBCへ)、City of Hope(Arthur Riggs Diabetes Metabolism and Research Institute Innovation Award)、およびCalifornia Institute of Regenerative Medicineからの助成金EDU4-12772(ATへ)によって部分的に資金提供されました。この出版物で報告された研究には、NIHの国立がん研究所が支援する光学顕微鏡法およびデジタルイメージングで行われた研究が含まれていました(賞番号P30CA033572)。 図1 と 図2 はBioRenderで作成しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL eppendorfUSA Scientific1615-5500
10 cm ディッシュGenesee Scientific25-202
25G ニードルBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 mL eppendorfThermo Fisher 
6ウェルプレートGreiner Bio-One07-000-208
70 & micro;mのこし器フィッシャー22-363-548
Anti-CD31-biotinMiltenyi BiotechREA784
牛の血清アルブミン熱衝撃処置FisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
Collagen Type 1、子牛の皮からSigma Aldrich C9791プロトコルのコ
ラゲナーゼ1型における付着試薬 Worthington BioLS004197
Countess 自動セルカウンターサーモフィッシャー 
DAPIサーモフィッシャー D1306免疫蛍光
使い捨て安全メスMycoインスツルメンテーション6008TR-10
DNAse I ロシュ260913 
D-PBS(Ca2+,Mg2+)サーモフィッシャー 
エタノールフィッシャーBP2818-4
胎児ウシ血清フィッシャー10437028
インキュベーター37°Cに保たれました。C 5% CO2
>LS カラムMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator ミルテニーバイオテック130-042-303
ミディアム199シグマアルドリッチ M2520-10X
マイクロビーズ 抗ビオチンMiltenyi Biotech130-090-485
顕微鏡ライカ細胞形態を評価するため
分子グレード 水コーニング46-000-CM
NaClフィッシャーS271-1
ニューブランズウィック イノーバ 44/44R オービタルシェーカー Eppendorf
PECAM1 (CD31) 抗体Abcamab56299immunofluorescence
PECAM1 (CD31) 抗体R&D SystemsAF3628
リン酸緩衝生理食塩水 (10X) (Ca2+なし、Mg2+なし)ジェネシー サイエンティフィック25-507-XB
プライマー 36B4 フォワード マウスIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
プライマー 36B4 レベス マウス IDTTCGGGTCCTAGACCAGTTC
プライマー KDR フォワードマウス IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
プライマー KDR リバースマウスIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
プライマー Nkx6.1 リバースマウス IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
プライマー Nxk6.1 フォワードマウスIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
プライマー PECAM1 フォワードマウスIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
プライマー PECAM1 リバースマウスIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPサーモフィッシャー AM9780
RNaseフリー水タカラRR036B
滅菌 12" 長鉗子F.S.T91100-16
滅菌細鉗子F.S.T11050-10
滅菌細ハサミF.S.T14061-11
組織培養皿 2cmジェネシー・サイエンティフィック25-260
トリゾール試薬フィッシャー15596018
トリパンブルーコーニングMT25900CI
トリプシン阻害剤 ロシュ10109886001
Tween-20
VE-カドヘリン抗体Abcamab33168免疫蛍光
ウォーターバス
14282300性14080055

参考文献

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

再版と許可

タグ

マウス膵臓血管内皮細胞の単離磁気細胞分取緩徐な解離細胞表面マーカーシングルセルシーケンシング膵血管系CD31抗体ウェスタンブロッティング
マウス膵臓内皮細胞の単離
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。