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方法論記事

低酸素感受性キメラ抗原受容体T細胞の作製と機能検証

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⸱

DOI:

10.3791/66697

⸱

2024年6月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、低酸素感受性キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の作製と機能検証のためのプロトコールを紹介します。このプロトコルは、レンチウイルスベースの低酸素感受性CAR-T細胞の作製と、低酸素依存性CAR発現および選択的細胞毒性の検証を含むそれらの特性評価を示しています。

要約

広範な研究により、血液悪性腫瘍の治療におけるキメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法の有望性が証明されています。しかし、固形腫瘍の治療は依然として困難であり、CAR-T細胞が標的抗原を発現する正常細胞を攻撃する際に生じる安全性の懸念に代表されるようになっています。研究者らは、CAR-T細胞療法の腫瘍選択性を高めるためのさまざまなアプローチを模索してきました。この方針に沿った代表的な戦略の1つは、酸素依存性分解ドメインをCAR部分に融合させることによって設計され、低酸素環境、つまり腫瘍微小環境(TME)でのみ高いCAR発現を達成するように戦略化された低酸素感受性CAR-T細胞の構築です。この論文では、このようなCAR-T細胞の作製とその機能特性評価のためのプロトコルを提示し、移動型インキュベーターチャンバーによって確立されたさまざまな酸素レベルに応じたCAR発現と殺傷能力の変化を分析する方法を含めます。構築されたCAR-T細胞は、酸素感受性でCAR発現と細胞毒性を示すことが期待されており、したがって、低酸素TMEと正常酸素正常組織を区別して選択的活性化を行う能力をサポートします。

概要

キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)療法は、がん治療における大きなブレークスルーを表しています。2017年に米国食品医薬品局(FDA)が進行性/抵抗性リンパ腫および急性リンパ性白血病の治療薬として初めてCAR-T療法を承認して以来、CD19またはB細胞成熟抗原(BCMA)を標的とするCAR-T療法は、全世界で1、2、3、10が承認を受けています4。しかし、広範な研究にもかかわらず、血液悪性腫瘍の治療におけるCAR-T療法の顕著な有効性を再現することは、固形腫瘍5,6,7,8への適用にとって依然として困難です。

免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)は、固形腫瘍環境におけるCAR-Tの有効性が低い主な原因です。TMEは、不十分な栄養素、低酸素症、酸性pH、および代謝老廃物の蓄積により、CAR-T細胞の活性と生存を妨げます9,10,11,12。さらなる敵意は、制御性T細胞(Treg)、骨髄由来抑制細胞(MDSC)、腫瘍関連マクロファージ(TAM)などの免疫抑制細胞への浸潤から生じ、腫瘍細胞とともに免疫抑制性サイトカインを分泌し、CAR-T細胞が腫瘍に侵入するとさらに阻害する13,14。

不十分な治療効率は別として、安全性の問題は、固形腫瘍15,16を扱う際のCAR-T細胞の別のアキレス腱です。安全性の懸念は、これまでに同定された腫瘍特異的抗原(TSA)のいずれも腫瘍細胞に厳密に限定されていないという事実から生じます。言い換えれば、CARの標的として選択された腫瘍関連抗原(TAA)は、腫瘍細胞でより高い発現を示すが、しばしば正常組織によっても発現される17。したがって、オンターゲット、オフ腫瘍効果は、CARが正常組織を効率的に認識すると、CAR-T細胞が予期せず活性化することで発生し、サイトカイン放出症候群(CRS)、CAR-T関連脳症症候群(CRES)18、およびその他の有害な結果につながる可能性があります19。

このような影響を回避するために、CAR-T細胞が標的TAAの発現レベルに基づいて腫瘍細胞と正常細胞を区別できるようにCARの親和性を低下させるなど、多くの戦略が検討されてきました。CAR-T細胞に自殺遺伝子や排泄マーカーなどのオフスイッチを装備して、予期せぬ活性化時にそれらの排泄を促進するステップと、CD3ζシグナルと共刺激シグナルを2つのCAR部分に分割し、その結果、CAR-T細胞の効果的な活性化には、その同時関与が必要となる。CAR-T細胞の活性を2つの異なるTAAを共発現する標的細胞に制限する合成Notch(synNotch)ベースの回路を利用し、また、変化する環境の手がかり20,21,22,23,24,25,26に対してCAR発現を調整するメカニズムを実装することにより、TME感度を達成するためのCAR-T細胞をエンジニアリングします。

上記のTME感度オプションにおける重要な考慮事項は、腫瘍細胞の急速な増殖によるTMEの酸素レベルが低いことです。腫瘍細胞の低酸素への適応は、誘導性サブユニットであるHIF-1αと構成的に発現するサブユニットであるHIF-1βからなるヘテロ二量体転写因子である低酸素誘導因子-1(HIF-1)の活性化にかかっています27。正常酸素条件下では、HIF-1αタンパク質は、その酸素依存性分解ドメイン(ODD)28に依存して、ユビキチン化および急速なプロテアソーム分解を受ける。細胞内の酸素供給が制限されると、HIF-1は安定化され、低酸素応答要素(HRE)29に結合することにより、その下流の標的遺伝子の転写を活性化する。ODDとHREが酸素感受性要素としての性質を持つことから、低酸素TME30におけるCARの条件付き発現を実現するために研究が進められてきました。ここでは、低酸素感受性CAR-T細胞の表現型および機能特性評価の方法に焦点を当てたプロトコルを提示し、その前にCAR設計とこれらの細胞の調製手順について簡単に説明します。このプロトコルは、低酸素反応性CARを利用して、腫瘍外毒性を抑制したCAR-T細胞を生成するための有用なガイドラインを提供することを目的としています。

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プロトコル

本研究では、HER2(Gene ID:2064)を標的とする低酸素感受性CARであるHER2-BBz-ODDと、通常のHER2-BBzと比較しました。2つのCARの概略図を 図1Aに示し、HER2-BBz-ODDは、CD3ξのC末端にODD配列を追加することでHER2-BBzから得られることを示しています。2つのCARを発現するレンチウイルスベクターの構築と、293T細胞トランスフェクションによる対応するレンチウイルスの生成は、以前に説明されている31。

1. レンチウイルス感染による低酸素感受性CAR-T細胞の作製

  1. 凍結保存されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)を37°Cで水浴中で急速に解凍します。解凍したPBMCを、400 IUのIL-2、5 ng/mL IL-7、および10 ng/mL IL-15を添加した9 mLの無血清リンパ球培養培地(ヒトT細胞増殖培地、 以下 TGM と呼ぶ)を含む15 mLチューブに移します。
  2. 細胞計数用の分注を取った後、チューブを300 × g で5分間遠心分離します。ペレット化したPBMCをTGMで4×106 細胞/mLの密度で再懸濁し、懸濁液を6ウェルプレートに移します。
  3. 抗hCD3/hCD28コーティング免疫ビーズを調製します。
    1. 100 μLのマウスIgG磁気ビーズを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、PBS付き磁気スタンドを使用して2回洗浄します。
    2. ビーズを100 μLのPBSに再懸濁し、0.2 μgのマウス抗ヒトCD3抗体と2 μgのマウス抗ヒトCD28抗体を加えます。ピペットを使用して混合物を穏やかに混合し、4°Cで一晩揺らします。
    3. PBS入りマグネットスタンドでビーズを2回洗浄し、PBS100μLに再懸濁します。
  4. ステップ1.2で、抗hCD3/hCD28でコーティングされた免疫ビーズをビーズ対細胞比1:1でプレートに添加します。プレートを5%CO2 の加湿インキュベーターに37°Cで置きます。
  5. インキュベーションの48時間後、ピペットで細胞を穏やかに混合した後、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。チューブを磁気スタンドに3分間置き、上清を新しい15 mLチューブに慎重に移して、PBMCから免疫ビーズを除去します。
  6. 細胞計数用のアリコートを取り、300 μLのTGM中の5×105 細胞/ウェルのPBMCを48ウェルフラットプレートに播種します。200 μLのレンチウイルスストックを対応するウェルに添加し、硫酸プロタミンを最終濃度10 μg/mLまで添加します。
  7. プレートを1,000 × g、32°Cで1.5時間遠心分離し、ピペットを使用して各ウェルから300 μLの上清を慎重に除去して廃棄します。次に、ピペットを使用して1 mLの新鮮なTGMを加え、プレートを5%CO2 で37°Cの加湿インキュベーターに入れます。
  8. 新鮮なTGMを添加して、細胞密度を0.5-2×2〜3日ごとに106 細胞/ mLに調整します。まず、細胞を12ウェルプレートに移し、次に6ウェルプレートに移します。総数が4mLの容量で6×106 に達するまで細胞を培養し続けます。
    注:並行して、上記と同じ手順に従ってJurkat T細胞のCAR形質導入を実施するが、TGMが10%ウシ胎児血清(FBS)を含む培地RPMI1640置換される点を除いて。

2. フローサイトメトリーを用いたCAR-T細胞における酸素依存性CAR発現の評価

  1. ステップ1.8のCAR形質導入T細胞を、2.5 × 106細胞/ウェルの密度で2つの12ウェルプレートに2つのTGM中にプレート化します。1つのプレートを5%のCO2を37°Cで加湿したインキュベーターに直接入れ(細胞培養の標準条件は21%のO2であるため、正常酸素状態)、もう1つのプレートをO2レベルが1%にプリセットされた移動式CO2/O2/N2インキュベーターチャンバー(低酸素状態)に置き、チャンバーを加湿状態に保ちます。 5% CO2/94% N2 インキュベーター、37 °C。
  2. 24時間ごとに、低酸素または正常酸素条件下でプレートから5個×10個の5 細胞を1.5mLの微量遠心チューブに収集します。チューブを500 × g で5分間遠心分離し、上清を取り除き、ピペッティングにより細胞を1 mLのPBSに穏やかに再懸濁します。PBSウォッシュをもう一度繰り返します。
  3. ペレット化した細胞を、各チューブ内の50 μLのFACSバッファー(PBSに2% FBSを添加)に再懸濁します。1:100希釈のPE標識抗Flag抗体(0.2 μg/mL)を50 μL加え、ピペッティングで十分に混合します。暗所で室温で20分間インキュベートします。
  4. インキュベーションの終了時に、各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えます。ピペッティングで十分に混合し、500 × g で5分間遠心分離します。
  5. ピペットを使用して上清を慎重に取り除いて廃棄し、手順2.4をもう一度繰り返します。
  6. ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。細胞を200μLのFACSバッファーに再懸濁し、得られた細胞懸濁液を5mLのフローチューブに移します。
  7. ステップ2.6で細胞懸濁液のフローサイトメトリーを行い、表面のCAR発現を決定します。トランスフェクションされていないT細胞をネガティブコントロールとして含めます。
    1. FSC/SSCおよびFSC-A/FSC-Hゲートを使用して、生細胞をスクリーニングします。サンプルごとに 1 つ× 10つの 4 つのライブ シングル イベントを収集します。EGFP(形質導入に成功したT細胞の指標としてレンチウイルスベクターに運ばれる構成マーカー)に陽性の細胞をゲートし、次にフィコエリトリン(PE)に陽性の細胞(CAR発現細胞)をゲートして、PE陽性と蛍光強度中央値(MFI)を測定します。

3. CAR修飾Jurkat T細胞におけるCAR発現の酸素依存性をウェスタンブロットで解析

  1. セクション1のCAR形質導入Jurkat T細胞を、ウェルあたり5×10個の5



  7. figure-protocol-1



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結果

HIF-1αのODDドメインをCAR部分に融合させることは、低酸素感受性CARを生成するための主要な戦略です。この研究で分析された低酸素感受性HER2標的CARは、HER2-BBz-ODDと名付けられ、ODD配列を従来のHER2-BBzに統合することにより、この戦略を使用して構築されました(図1A)。本研究では、レンチウイルス形質導入を用いてHER2-BBz-ODD CARまたはHER2-BBz CARを発現させ、その後、ヒトPBMCとJurkat T細胞の2種類の細胞で酸素感受性を調べました。

最初の試験は、低酸素条件下でのCARの発現と正常酸素条件下でのCARの発現であり、フローサイトメトリーによるCAR形質導入PBMC由来T細胞とウェスタンブロッティングによるCAR形質導入Jurkat T細胞の両方で行われました。CAR形質導入PBMC由来T細胞の設定では、HER2-BBz-ODD CARは、CAR陽性細胞の割合と蛍光強度(MFI)の中央値の両方において、1%O2 未満の方が21%O2...

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ディスカッション

安全性に関する懸念は、CAR-T細胞療法が臨床使用に進むために対処しなければならない重要な問題です。腫瘍細胞またはTMEのユニークな特性を利用することは、腫瘍組織を選択的に標的とするCAR-T細胞の開発に焦点を当てた主要な研究の方向性となっています。低酸素感受性CAR-Tの設計は、この方向での魅力的な戦略であり、この研究で提示されたアプローチ、つまりCAR部分を天然に存在する低酸素感知ODDタンパク質ドメインと融合させるアプローチなど、いくつかのアプローチが検討されています。別のアプローチとして、CAR発現を促進するために一般的に使用される構成的プロモーターを、以前の研究で有望視されている低酸素応答要素(HRE)に置き換える方法があります。HRE要素とODD要素(野生型または発現をより厳密に制御できるエンジニアリングバージョン)を組み合わせることは、低酸素誘導性CARの最適な設計であると考えられています。

このプロトコルは、低酸素感受性CAR-T細胞を生成および検証するための実験手順を概説しています。このプロトコル...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、National Key Research and Development Program of China(2016YFC1303402)、National Megaproject on Key Infectious Diseases(2017ZX10202102、2017ZX10304402-002-007)、および上海市衛生委員会のGeneral Program(201740194)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 遠心分離管QSP509-GRD-Q上清および細胞 cellection
プロトコル ステップ 2,3,4
10% ExpressCast PAGENCM バイオテクノロジーP2012免疫ブロッティング
プロトコル ステップ 3
10x PBSNCM バイオテクノロジー20220812細胞培養
プロトコル ステップ 4
10 mL ピペットYueyibioYB-25Hピペッティング
プロトコル ステップ 1
10xTRIS-Glycine-SDS 電気泳動バッファーエピザイム3673020イムノブロッティング
プロトコル ステップ 3
15 mL 遠心チューブThermo Scientific339650上清および細胞 cellection
プロトコル ステップ 1
25 cm2 EasYFlaskThermo Scientific156367細胞培養
プロトコル ステップ 3,4
4x 蛋白質 SDS PAGE ローディングバッファーTakara9173Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
6 ウェル平底組織培養プレートThermo Scientific140675T 細胞 culture
プロトコル ステップ 1
96 ウェル黒色平底組織培養プレートGreiner655090細胞毒性アッセイ
プロトコル ステップ 4
96 ウェル ELISA プレートCorning3590ELISA
プロトコル ステップ 5
96 ウェル プレート シェーカーQILINBEIERMH-2Shake
プロトコル ステップ 4
96 ウェル U 底組織培養プレートThermo Scientific268200上清 cellection
プロトコル ステップ 4,5
抗 FLAG 抗体SigmaF1804-50UGImmunoblotting
プロトコル ステップ 3
カルビノールSinopharm10010061Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
二酸化炭素インキュベーターThermo Scientific360細胞培養
プロトコル ステップ 1,2,3,4
細胞計数プレートHausser scientific1492細胞計数
プロトコル ステップ 1,3,4
CELLection Pan マウス IgG キットThermo Scientific11531Dマウス IgG 磁気ビーズ
プロトコルステップ1
分離機Thermo Scientific75002432細胞培養
プロトコルステップ1,3,4
発光ゲルイメージングシステムBIO-RAD12003154Immunoblotting
プロトコルステップ3
塩化コバルト溶液(0.5 M)バイオリーパーBR4000203低酸素状態
プロトコルステップ2,3,4
DMEMCorning10-103-CV細胞培養
プロトコルステップ4
電子バランスザルトリウスPRACTUM612-1CN重量
プロトコルステップ
5FBSBI04-001-1ACS細胞培養
プロトコルステップ3,4
GAPDHマウスmAbABclonalAC002ブロッティング
プロトコルステップ3
電気泳動装置BIO-RAD1645070Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
GloMax Microplate ReadersPromegaGM3000ルシフェラーゼ活性測定
プロトコル ステップ 4
ヤギ抗マウス IgG (H+L)YeasenP1126151Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
高速マイクロフリーズ遠心分離機eppendorf5810 R細胞培養
プロトコルステップ1
IFN-&γ;ELISAセットBD 555142ELISA
プロトコルステップ5
項目:組換えヒトIFN-&γ;凍結乾燥標準液、検出抗体ビオチン抗ヒトIFN-&γ;、捕獲抗体精製抗ヒトIFN-&γ;、酵素試薬ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(SAv-HRP)
ヒトIL-2 ELISAセットBD555190ELISA
プロトコルステップ5
アイテム:組換えヒトIL-2凍結乾燥標準、検出抗体ビオチン抗ヒトIL-2、捕捉抗体精製抗ヒトIL-2、酵素試薬ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(SAv-HRP)
IL-15R&DシステムP40933T細胞培養
プロトコルステップ1
IL-21NovoproteinGMP-CC45T細胞培養
プロトコルステップ1
IL-7R&DシステムP13232T細胞培養
プロトコルステップ1
立顕微鏡オリンパスCKX41細胞培養
プロトコルステップ1,3,4
JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat建設
プロトコルステップ3
LSRFortessaBDLSRFortessaフローサイトメトリー
プロトコルステップ2
ルシフェラーゼアッセイシステムPromegaE1501ルシフェラーゼレポーターassay
プロトコルステップ4
アイテム: 受動溶解バッファー、ホタルルシフェラーゼ基質
マイクロプレートリーダーBioTekHTXELISA
プロトコルステップ5
モバイルCO2/O2/N2インキュベーターチャンバー中国イノベーションインストゥルメント株式会社、 株式 会社。Smartor118低酸素状態
プロトコル ステップ 2、3、4
マウス抗ヘキサ ヒスチジン タグΣSAB2702218Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
NcmBlot 急速転写バッファーNCM バイオテクノロジーWB4600免疫ブロッティング
NcmECL UltraNCM バイオテクノロジーP10300Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
項目: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer 試薬 (A) ,NcmECL Ultra Stabilized 過酸化物試薬 (B) 
NovoNectinに塗ってある48の井戸の平らな版NovoproteinのGMP-CH38CAR-T細胞の構造
プロトコル ステップ 1
OPD (o-フェニレンジアミン二塩酸塩)タブレット セットΣP9187基質の試薬
プロトコル ステップ 5
項目: OPDのタブレット(銀ホイル)、尿素の過酸化水素のタブレット(金ホイル)
PE共役抗DYKDDDDKBiolegend637310フローサイトメトリー
プロトコル ステップ 2
プロタミン硫酸シグマP3369-1OGレンチウイルス感染
プロトコル ステップ 1
タンパク質マーカー 10 KDa-250 KDaEpizymeWJ102Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
 精製されたNA/LEのマウスの反ヒトCD3BD 566685T細胞の培養
プロトコル ステップ 1
精製されたNA/LEマウスの反ヒトCD28BDBD 555725T細胞の培養
プロトコル ステップ1
PVDF膜Millipore168627Immunoblotting
プロトコル ステップ3
RPMI 1640Corning10-040-CVRC細胞培養
プロトコル ステップ 3
脱脂粉乳YeasenS9129060Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
SKOV3-LucATCCHTB-77細胞毒性アッセイ
プロトコル ステップ 4
トリプシン-EDTANCM バイオテクノロジーC125C1細胞培養
プロトコル ステップ 4
Tween 20Sinopharm30189328Immunoblotting
プロトコル ステップ 3
ウォーターバスkeelreinNB014467Heating
プロトコル ステップ 1
X-VIVO 15 LONZA04-418Q無血清リンパ球培養培地
プロトコル ステップ 1
遠心化学免疫ゲルヒト倒

参考文献

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