マウスの鎮痛効果を研究するための修正炎症性疼痛モデル

サマリー

ここでは、鎮痛効果を評価するために、両後足のカラギーナン注射による修正された炎症性疼痛モデルを紹介します。

要約

ホットプレート試験は、マウスの炎症性疼痛に対する鎮痛効果を評価するために広く使用されています。炎症性疼痛の一般的に使用されるモデルは、片方の後足にカラギーナンの足底内注射によって誘発されました。しかし、私たちの研究室からの発見は、カラギーナンの単一の後足注射を受けたマウスが、ホットプレートテスト中に熱侵害受容を避けるために前足を持ち上げることを示しました。この応答のため、以前の注入方法では熱痛の閾値を正確に反映することはできません。そこで、この問題を回避するための新たな方法を検討しました。本研究では、炎症性疼痛のモデルを確立するために、カラギーナンを両後足に注入することにより、以前の方法を修正しました。その結果、カラギーナンによる両後足注射は感度が高く、ホットプレートテストを使用すると、片足後足注射よりも炎症性疼痛を誘発する方法として優れていることが示された。これらの知見に基づいて、カラギーナンを後足両方または後足一足注射したマウスにセレコキシブ(30 mg / kg)を胃内投与する実験をさらに設計しました。ホットプレート試験の結果は、セレコキシブがカラギーナンの両後足注射を受けたマウスでは熱痛閾値を増加させたことを示しましたが、カラギーナンの片足後足注射をしたマウスでは増加しませんでした。.要約すると、我々は、鎮痛効果を評価するための炎症性疼痛のモデルを誘発する優れた方法を開発しました。

概要

痛みは世界中の公衆衛生上の問題です。これは、有害な熱的、機械的、または化学的刺激によって引き起こされます。倫理的な懸念から、人間で疼痛研究を行うことは困難です。したがって、動物の痛みモデルを使用することは、痛みのメカニズムを理解し、治療法を研究するための重要なアプローチです¹。ホットプレート試験は、熱侵害受容および痛覚過敏の評価に広く使用されています²。現在、ホットプレートテストに使用される炎症性疼痛のモデルは、片方の後足にカラギーナンの足底内注射によって誘発されます。例えば、ロチゴチンを充填したマイクロスフェアの抗侵害受容効果を調査するために、炎症性疼痛の動物モデルを片足後^足注射3によって調製した。マウスの熱侵害受容に対するカテコール-o-メチルトランスフェラーゼ阻害剤の効果を評価するために、カラギーナンを右後肢^の足底領域に投与した4。 Posidonia oceanica (L.) Delileの抽出物の鎮痛作用を調べるために、マウスにおいてカラギーナンの足底内注射により炎症性疼痛モデルを作製^した5。しかし、私たちの研究室からの発見は、カラギーナンの単一の後足注射を受けたマウスが熱侵害受容を避けるために前足を持ち上げることを示しました。したがって、カラギーナンの片足後足注射による炎症性疼痛モデルは、熱痛の閾値を正確に反映できないという仮説を立てました。したがって、カラギーナンを両方の後足に注入して、修正された炎症性疼痛モデルを確立することにより、方法を最適化しました。

カラギーナンの両後足注射を受けたマウスは、両方の後足への熱刺激を同時に回避する方法がありませんでした。疼痛閾値は、マウスをホットプレートに置いてからマウスがどちらかの後足を舐めるまでの時間として定義されました。その結果、修正された炎症性疼痛モデルが侵害受容温度閾値の評価により適していることが確認されました。これにより、鎮痛薬の研究開発におけるホットプレート試験の有効性が向上する可能性があります。

プロトコル

この実験プロトコルは、煙台大学の動物施設管理および使用委員会によって承認されました(No.YTDX20220425)。手順は、国立衛生研究所の実験動物の使用に関するガイドラインに従っていました。

1. 動物たち

1. 実験には、体重20〜25 gのICR雌マウスを使用します。
2. 実験を開始する前に、動物が実験室の環境に3日間順応するのを待ちます。
3. 実験室を12時間の明暗サイクルで維持し、マウスが水とチャウに自由にアクセスできるようにします。

2.カラギーナン溶液の調製

1. キャラギーナン0.1gの重さを量ります。滅菌した生理食塩水10mLをチューブに加えます。
2. 0.1 gのカラギーナンをチューブに加え、チューブを30秒間ボルテックスします。
3. 1%滅菌したカラギーナン溶液を収集します。
4. 実験の前にカラギーナン溶液を準備します。

3. カラギーナンの足底内注射

1. シリンジ(0.05 mL、29G x 1/2インチ、0.33 mm×12.7 mm)を使用して、1%カラギーナン溶液を注入します。.
2. カラギーナン溶液をシリンジに引き込む前に振ってください。シリンジに気泡がないことを確認してください。
3. 注射部位(後足)を75%アルコールで消毒します。
4. 30 μL ^6,7 の 1% カラギーナン溶液を後肢の足底表面に皮下注射します。対照群マウスには、生理食塩水30μLを注入します。
   1. 針を斜め上向きに後足のフットパッドに挿入します。シリンジの安定性を維持します。
   2. 注入後、シリンジをゆっくりと引き抜き、漏れを防ぐために注入部位を2秒間押します。.

4.ホットプレートテスト

1. 足底内注射の3時間後にホットプレートテストを実施します。
2. ホットプレートの表面を清掃して消毒します。
3. ホットプレート装置を始動します。 [Temperature Mode ] ボタンをクリックします。 「CONSTANT 」をクリックして、温度を 55 ± 0.2 °C に設定します。
4. [ 実験の開始] ボタンをクリックし、[ REACH] をクリックします。宿泊コンテナからマウスを取り出します。その幹をそっとつかみます。マウスをホットプレートの中央に置きます。 [START] をクリックします。
5. 熱刺激に反応して、左後足(片足後足注射を受けたマウスの場合)または後足(両後足注射を受けたマウスの場合)を舐める時間を観察し、記録します。ホットプレートのペダルを踏むと、ホットプレートの画面に時刻が表示されます。痛みの閾値を、マウスをホットプレートに置いてから後足を舐めるまでの時間として定義します。
6. ホットプレートテスト^4,8,9に60秒の制限を設定します。制限に達した場合は、痛みのしきい値を 60 秒に記録します。
   注意: 前のマウスからの残留臭によるバイアスを避けるために、次のマウスを配置する前にホットプレート装置を75%アルコールで清掃してください。

5. セレコキシブ懸濁液1.5mg/mLの調製

1. セレコキシブ200mgを含む1カプセルを服用してください。カプセルの内容物を入手し、粉末に粉砕します。
2. 0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウムを添加します。最終容量は13.3mLです。これはセレコキシブの店舗停止です。
3. ストア懸濁液セレコキシブ1mLを服用します。9.0 mLの0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウムを添加して、1.5 mg / mLのセレコキシブ懸 ?? 液を得ます。.
4. 0.2 mL / 10 gのセレコキシブ懸 ?? 液をマウスに胃内に投与します。.
   注:体重20〜25 gのマウスには、長さ4.0〜4.5 cmの強制針を選択してください。

6. 修正された炎症性疼痛モデルの評価

1. ICRの雌マウスを、対照群、モデル群、セレコキシブ群の3つのグループに無作為に分けます。
2. 30 μLの1%カラギーナン溶液を後足(片足後足または両足後足)の足底表面に皮下注射します。対照群マウスには、生理食塩水30μLを注入します。
3. カラギーナンまたは生理食塩水を注射した後、直ちに治療を行ってください。セレコキシブ群のマウスに 30 mg/kg の用量でセレコキシブを胃内に投与します。対照群およびモデル群のマウスには、0.5%カルボキシメチルセルロースナトリウムを胃内に投与します。
4. カラギーナンの注射後3時間でホットプレートテスト(セクション2)を実施します。.

7. 統計的手法

1. 実験結果を平均±標準偏差として表示します。Kolmogorov-Smirnovの統計的適合度検定を使用して正規性分布検定を実施します。
2. 対応のないt検定を使用して、2つのグループ間の比較を分析します。一元配置分散分析とそれに続くダネットの検定を使用して、多重グループ比較を実行します。p の値が 0.05 <統計的に有意であると考えます。

結果

炎症性疼痛モデルにおける疼痛閾値
カラギーナンの片足後足注射による炎症性疼痛モデルの痛みの閾値は32.23±11.11秒でしたが、対照群の痛みの閾値は27.73±7.08秒でした。対照群と比較して、片足後足注射モデルの痛みの閾値は有意な減少を示さなかった(p > 0.05、 図1A)。カラギーナンの両後足注射による炎症性疼痛モデルの痛みの閾値は21.84±5.63秒でしたが、対照群の痛みの閾値は28.21±8.61秒でした。対照群のそれと比較して、両後足注射モデルの痛みの閾値は有意に減少しました(p < 0.05、 図1B)。

さまざまな炎症性疼痛モデルにおけるセレコキシブの鎮痛効果
カラギーナンの片足後足注射による炎症性疼痛モデルでは、セレコキシブ群の痛み閾値(27.01 ± 10.98秒)は、モデル群の痛み閾値(29.77 ± 13.97 s、p > 0.05)と比較して有意な増加を示さなかった。上記の結果と一致して、モデル群の痛みの閾値は、対照群の痛みの閾値(30.94±14.54秒)と比較して有意な減少を示さず、カラギーナンの片足後足注射が炎症性疼痛モデルを誘発しなかったことを示しました(図2A)。カラギーナンの両後足注射による炎症性疼痛モデルでは、モデル群の痛みの閾値(15.61 ± 4.85秒)は、対照群の痛みの閾値(23.55 ± 3.96 s、p < 0.05)と比較して有意に減少しました。モデル群と比較して、セレコキシブ群の疼痛閾値(20.29 ± 3.10 s)は有意に減少しました(図2B)。

図1:炎症性疼痛モデルにおける疼痛閾値( 平均±標準偏差、n = 15)。(A) カラギーナンの片足後足注射による炎症性疼痛モデルの痛みの閾値。(B) カラギーナンの両後足注射による炎症性疼痛モデルの痛み閾値 (^#P<0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:さまざまな炎症性疼痛モデルにおけるセレコキシブの鎮痛効果 (平均±標準偏差、n = 14)。(A)カラギーナンの片足後足注射による炎症性疼痛モデルにおけるセレコキシブの鎮痛効果。(B)カラギーナンの両後足注射による炎症性疼痛モデルにおけるセレコキシブの鎮痛効果( ^#P<0.05、* P <0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

痛みは、組織の損傷や損傷によって引き起こされる保護反応です。しかし、それはまた生活の質に悪影響を及ぼします¹⁰。したがって、効果的な鎮痛薬の開発と痛みのメカニズムの探求は、依然として活発な研究分野です。疼痛の評価方法は、鎮痛薬の開発において重要な役割を果たしています。カラギーナンの片足後足注射は、ホットプレート試験の古典的な方法です。ここで紹介するカラギーナンの両後足注射によって誘発される修正モデルは、痛みを和らげる可能性のある治療薬の有効性を調査するための信頼できる方法を提供します。

本研究では、カラギーナンを片足後足注射したマウスでは、疼痛閾値の低下が見られなかった。しかし、他の研究では、この方法はホットプレートテスト^11,12で痛みの閾値の大幅な減少をもたらしました。以前の研究とこの研究との間の結果の不一致は、実験^13,14,15,16で使用された異なる動物種によって説明できるかもしれない。別の可能な説明は、カラギーナンの単一後足注射を受けたマウスが、注入された足を持ち上げたり、熱刺激を避けるためにプレートを軽く踏んだりすることが多いことを観察したことです。疼痛閾値の評価には、注射した足を舐めたり振ったりする典型的な侵害受容反応を観察する必要があります。したがって、陰性の結果が得られ、カラギーナンの片足後足注射によるモデルの痛みの閾値は有意に減少しなかったことを示しました。両後足にカラギーナンを注射したマウスは、前足を持ち上げたり、プレートを軽く踏んだりすることで熱刺激を避けることができませんでした。痛みの閾値は、マウスの実際の侵害受容反応を反映して、どちらかの後足を舐めるか震えると考えられていました。

修正された炎症性疼痛モデルの優位性を検証するために、カラギーナンの片足後足または両後足注射を受けたマウスをセレコキシブの胃内投与で治療しました。この研究の仮説と一致して、セレコキシブは修正された炎症性疼痛モデルで鎮痛効果を発揮しましたが、カラギーナンの片足後足注射ではモデルでは効果は示されませんでした。この知見は、改変された炎症性疼痛モデルが、潜在的な鎮痛薬のスクリーニングに信頼性があることを実証した。

この研究には限界があります。ホットプレート試験では、多くの異なるマウス系統が使用されています。マウス系統が異なれば、熱刺激に対する応答も異なる場合があります。本実験では、ICRマウスのみを用いて仮説を検証しました。したがって、修正された方法がホットプレート試験において他のマウス系統の痛みの閾値を正確かつ一貫して検出するかどうかは、まだ決定されていません。さらに、マウスの痛みの閾値を評価するためのパイロット実験を設計しなかったため、痛みの閾値が高い動物を除外しませんでした。しかしながら、この制限は、本修正方法の利点としても考えられる。これは、鎮痛試験のプロセスを簡素化するだけでなく、ホットプレート試験におけるマウスの反応の範囲も反映します。さらに、後足の体積の測定は、炎症の誘発を確認し、非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID) の鎮痛効果を確認するのに役立ちます。しかし、私たちの経験から、マウスの足の体積を測定することは容易ではないことがわかりました。マウスの足が小さすぎて正確な値を取得できません。したがって、本研究は、炎症後の足の体積の変化を調査するために設計されたものではありません。

結論として、上記の手順に従って、カラギーナンの両後足注射による炎症性疼痛モデルにより、マウスの体温侵害受容閾値を信頼性の高い方法で決定できます。さらに、鎮痛薬を投与すると、疼痛閾値の増加が統計的に検出されました。修飾された炎症性疼痛モデルは、潜在的な鎮痛薬のスクリーニングに役立ちます。さらに、この方法は、疼痛生物学の研究、新薬開発、臨床治療に使用できるだけでなく、疼痛管理の新しいアイデアやソリューションを提供することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AL204電子天びん	Yuheng電池有限公司	YH-400A
カルボキシメチルセルロース	天津化学有限公司
Carrageenan	Sigma, MO, USA	29H0715
セレコキシブ	・ファイザー社
ホットプレート	UGO Ltd. Co., イタリア	PB-200
ICR雌マウス	済南鵬悦(株)
SCXK20220007 生理食塩水	ケルン製薬株式会社