プレミックス試薬とフリーズドライ試薬によるポイントオブケアCRISPRベースの診断

サマリー

ここでは、感染症病原体やその他の遺伝子マーカーの核酸バイオマーカーの検出に使用できる、プレミックス凍結乾燥リコンビナーゼベースの等温増幅反応とCRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ベースの反応の段階的な調製について紹介します。

要約

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ベースの検出による分子診断は、高い診断精度と特性を備えており、結果のターンアラウンドタイムが短い、便利でシンプルな読み出し、複雑な機器を必要としないなど、ポイントオブケア環境での使用に適しています。しかし、反応は、その多くのコンポーネントと手動の取り扱いステップのために、ケアの時点で行うのが面倒な場合があります。ここでは、リコンビナーゼベースの等温増幅試薬とCRISPRベースの試薬を使用して、疾患病原体と遺伝子マーカーをしっかりと検出するための段階的に最適化されたプロトコルを提供します。これらは事前に混合され、保存が簡単ですぐに使用できる形式で凍結乾燥されます。あらかじめ混合された凍結乾燥試薬は、すぐに使用できるように再水和することができ、高い増幅効率と検出効率を維持することができます。また、CRISPRベースの診断用にプレミックスされた凍結乾燥試薬を調製して使用する際によく見られる問題のトラブルシューティングガイドを提供し、より広範な診断/遺伝子検査コミュニティが検出プラットフォームにアクセスしやすくします。

概要

核酸バイオマーカーの検出のためのCRISPRベースの診断法は、2017年に初めて報告されました 1,2,3,4 それ以来、食品医薬品局(FDA)が承認した検査、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAの検出に関する次世代の診断法として、複数の国で証明されています^5,6,7,8.コロナウイルス病2019(COVID-19)を超えて、これらの技術は、多様なウイルスや細菌^{9,10,11,12,13}、遺伝性疾患の突然変異や欠失の検出に効果的であることが実証されており、タンパク質や低分子バイオ^{マーカー2,12}を検出するように操作できます.CRISPRベースの診断法は、多くの場合、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)やループ媒介等温増幅(LAMP)^14,15などの等温増幅法と、標的認識後の「側副」エンドヌクレアーゼ活性を持つRNA誘導CRISPR関連(Cas)酵素を用いたCRISPRベースの検出を組み合わせたものです³.等温増幅とCRISPRベースの検出の二重使用は、技術にいくつかの望ましい属性、特にゴールドスタンダードのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に近い高い診断精度、および一塩基多型^1,9を含む小さな配列の違いを多重化して検出する能力を与えます。

しかし、CRISPRベースの診断法の最も精度の高い診断法は、複数のコンポーネントとステップを含んでおり、専門家でない人やポイントオブケア(POC)での実施が複雑になる場合があります。高精度のCRISPRベースの診断法の使用をPOC設定にまで拡大するというこの課題に対処するために、私たちは、プレミックス、凍結乾燥、リコンビナーゼベースの等温増幅反応およびCRISPRベースの検出反応を調製するためのプロトコル^{を開発しました。}これらのプロトコルは、CRISPRベースの診断7^{に必要な生}化学的成分の産生に関する追加情報を含むCRISPRベースの診断¹⁴、デザインガイドライン¹、および代替の等温増幅技術2,14,15,16およびCas酵素¹²を使用した製剤を含む、CRISPRベースの診断14に関する既存の優れたプロトコルを補完するべきである.最終的には、CRISPRベースの診断法が、携帯型で機器不要の分析が必要な環境で、迅速で安価、かつ高感度な核検出を実現できることを願っています^1,9,17。

当社のプロトコルでは、主にRPAとCas13ベースの検出を組み合わせて使用しています。RPAは周囲温度に近い温度(37-42°C)で機能するため、エネルギーと機器の要件は低くなっています。その他の等温増幅反応では、より高い温度が必要です(LAMP、60-65°C、ストランド変位増幅(SDA)、60°C、指数関数的増幅反応(EXPAR)、55°C、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、65°C)²。RPAプライマーの設計も、LAMPプライマーとは異なり複雑ではなく、マルチプレックス増幅^7,9,14に拡張することができる。RPAを使用して2つのターゲットを超えて多重化することは実際には困難ですが、干渉を最小限に抑えるための多重化RPAプライマーの設計方法に関する明確なガイドラインがあります¹⁸。

キャリーオーバー汚染は2ステップワークフローで大きな問題であることに変わりはありませんが、生成されたRPAのアンプリコンは、LAMP¹⁴の大型コンカテメリックアンプリコンと比較してサイズが小さく、キャリーオーバー汚染を引き起こす可能性が低くなります。RPAプライマーは、標準的なガイドライン¹⁴に従って設計することができます:それらは一般的に25〜35ヌクレオチド長で、融解温度は54〜67°Cです。 アンプリコンのサイズは 200 塩基対未満である必要があります。逆転写酵素(RT)をRPAに添加してRNAからの増幅を可能にすることができ、逆転写RPA(RT-RPA)では、別の酵素リボヌクレアーゼH(RNase H)が典型的には少量で添加され、得られたRNA:DNAハイブリッドを分離し、増幅反応を促進する^5,19。Cas13ベースの検出でT7転写を可能にするために、T7 RNAポリメラーゼプロモーターをフォワードRPAプライマーの5'末端に配置することができます。

RPAからアンプリコンが生成された後、crRNAでプログラムされたCas酵素で検出できます。アンプリコン検出に使用できるさまざまなCas酵素の中で、私たちは、その高い切断活性¹と、十分に特徴付けられたポリヌクレオチド切断選好^7,9のために、RNA標的Cas13変異体を好みます。Cas13のcrRNA配列は、スペーサーおよびダイレクトリピート(DR)配列により、産生されたRNAの標的部位に相補的(逆相補的)になるように設計されています。crRNA配列とRPAプライマーは、バックグラウンドおよび偽陽性を増加させるオフターゲット増幅産物の望ましくないCasベースの検出を避けるために、重複してはならない¹⁴。

Casベースの検出は、レポーター核酸分子(Cas13ベースの反応のRNAレ^{ポーター)の}切断をモニターするために、さまざまな検出モダリティに依存しています^1,2,14。さまざまな検出モダリティには、比色分析、電気化学的読み出し、蛍光、シーケンシング読み出し、ラテラルフローストリップ²が含まれます。我々は、単一の青色LED光源を用いて効果的に励起することができるシアニン5(Cy5)、ローダミンX(ROX)、カルボキシフルオレセイン(FAM)などの種々の蛍光色素およびレポーターを与えられた蛍光読み出し、およびそれらの蛍光をマイクロプレートリーダーまたはリアルタイムサーマルサイク^ラー7,14によって分析することに焦点を当てる。さらに、蛍光読み出しはセットアップが簡単で、継続的なモニタリングが可能なため、リアルタイムの定量が可能です。マルチプレックスRPA前増幅とCas酵素を用いたマルチプレックスCas13ベースの検出は、マルチカラー蛍光読み出しと組み合わせることで、複数の遺伝子ターゲットを同時に検出することができます^2,7。

私たちのプロトコルでは、まず、RT-RPA試薬の凍結乾燥型にRNAサンプルを添加することにより、RT-RPAでRNAを等温増幅します(図1)。RT-RPAでは、生成された二本鎖DNAアンプリコンにT7プロモーターが付加されます。その後、RPA産物は、T7 RNAポリメラーゼも含まれる凍結乾燥Cas13ベースの検出に移されます。この検出反応は、DNAアンプリコンを(T7 RNAポリメラーゼを介して)RNAに変換し、crRNAプログラムCas13で容易に検出できます。標的活性化Cas13は、レポーター分子を切断して検出可能な蛍光シグナル^2,7,14を産生します。ここでのプロトコルは、Leptotrichia wadei(LwaCas13a)による検出に関するものですが、直交するCas13およびCas12酵素^7,9を使用して、最大4つのターゲットを同時にマルチプレックス検出するように拡張することができます。RPAとCasベースの検出反応も、感度は低下しますが、1つのチューブに組み合わせることができます¹⁴。

図1:CRISPRベースの検出ワークフロー。 このワークフローは、2つの標的遺伝子の検出を示しています。まず、DNAターゲット内の関心領域をRPAで等温的に増幅します。RNAターゲットを検出する際に、逆転写(RT-RPA)を用いて反応を行うことができます。その後、T7転写はdsDNAアンプリコンをRNAに変換し、次に、標的結合時に側副RNase活性を誘発できるCas13-crRNA複合体によって認識されます。消光された蛍光レポーターの切断により、マイクロプレートリーダーを使用してモニタリングしたり、LEDトランスイルミネーターで可視化したり、リアルタイムのサーマルサイクラーで使用したりできる蛍光シグナルが生成されます。略語:CRISPR =クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。RT = 逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;Cas = CRISPR関連タンパク質;LED = 発光ダイオード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここで紹介するプロトコールの主な特徴は、凍結乾燥用のプレミキシング製剤です。プレミキシングにより反応の使用が簡素化され、再現性が向上しますが、RPAおよびCasベースの検出に含まれる多くの成分、特に逆転写やATPなどの不安定な補因子は溶液中で安定していません。したがって、我々は、長期保存および容易な輸送^{および展開のために}凍結乾燥できるように、予混合溶液を配合する^1,9,20。また、予混合された凍結乾燥試薬は、反応を再構成するためにより多くのサンプル量(したがって、より多くのDNA/RNAインプット)を添加することができるため、検出感度の向上にも役立ちます¹⁰。当社の製剤では、凍結乾燥RPAおよびCasベースの検出反応⁷の凍結保護剤として主にトレハロース²¹を使用しています。試薬の保存に加えて、トレハロースは、酵素安定化16,22,23,24の増加およびdsDNAの融解温度の低下²³を介して反応も促進する。トレハロース以外の他の安定剤5,7,21,25,26の探索は、異なる使用シナリオに対してさらに最適な処方をもたらすかもしれない。

プロトコル

1. 凍結乾燥RT-RPAプレミックス試薬の調製

1. 機器の準備
   1. 反応の瞬間凍結のために液体窒素デュワーまたはトレイを準備します。デュワーまたはトレイに液体窒素を入れます。
   2. 凍結乾燥機
      1. 排水管とチャンバー内部に凝縮水がないか確認してください。必要に応じて水を取り除きます。
      2. チャンバー内部と1.5 mL微量遠心チューブの金属ラックをRNase除染溶液で洗浄し、続いて70%エタノールで洗浄します。
      3. チャンバードアと真空解除バルブを閉じます。
      4. 凍結乾燥機の電源を入れます。
      5. シェルフの温度を手動で-30°Cに設定します。
   3. 分子生物学機器
      1. RNase除染液で、ピペット、ピペットチップラック、ボルテックスミキサー、スピンダウンミニ遠心分離機、油性マーカーを洗浄します。
      2. 水道水で以下を掃除してから、クリーニングワイプ紙で拭いてください:マイクロ遠心チューブ用のプラスチックラックと氷用のフォームボックス。
      3. 加熱ブロック(トリグリシン溶液の溶解/再溶解に使用)をRNase除染溶液と70%エタノールで洗浄して調製します。次に、電源を入れて温度を60°Cに設定します。
2. プレミックスRPA反応の調製
   注:この製剤は10反応用です(3つのRPAペレットを使用)。
   1. 使用前にトリグリシン溶液に沈殿物がないか確認してください。沈殿物がある場合は、60°Cでインキュベートし、十分に混合して使用前に溶解してください。他の熱に敏感な試薬を追加する前に、トリグリシン溶液を冷却してください。
      注:チューブを室温で長期間放置すると、沈殿物が発生しやすくなります。
   2. 3本のRPAペレットストリップチューブを冷凍庫から取り出します。ストリップチューブをラボベンチにそっとたたき、白いペレットを外すように軽くたたきます。
   3. 3つのペレットすべてを1.5 mLの微量遠心チューブAに移します。
   4. ヌクレアーゼフリーの水25μLをピペットで注入し、ストリップチューブに残っているRPA粉末をすすぎ、すすぎ液を新しい1.5 mL微量遠心チューブBに移します。
   5. 0.57 Mトリグリシン溶液10 μLとプライマーミックス10 μL(各10 μM)をマスターミックスチューブBに加えます。
   6. ボルテックスミックスチューブB;次に、スピンダウンしてチューブを氷の上に置きます。
   7. 5x RPAバッファー28.4μL(500μLの50%(w/v)PEG20000、250μLの1M Tris pH 7.4、100μLの100 mMジチオスレイトール(DTT)から調製)をマスターミックスチューブBに加え、強く叩くか複数回振とうして十分に混合します。
      注:RPAペレットを可溶化するためにすべてを追加する前に、マスターミックスチューブ内のPEGの粘度を希釈/減少させるために、この方法で溶液を作成します。
   8. ステップ1.2.3でチューブAに回収したペレットをマスターミックスチューブBに移し、マスターミックスチューブを数回反転させて混合します。溶液が均一で単相に見えるかどうかを観察し(わずかに不透明に見える)、チューブを氷の上に置きます。
      注:混合が完全でない場合、PEGは溶液/懸濁液を相分離させる可能性があります。
   9. 0.71 μL の 200 Unit/μL RT と 2.84 μL の 5 Unit/μL RNase H をマスターミックスチューブに加えます。マスターミックスチューブを 何度も軽く たたいたり、上下に動かしたりします。スピンダウンして、チューブを氷の上に置きます。
      注:RTとRNase Hは混合によるせん断に敏感であるため、以前のステップで重く混合した後にこれらの酵素を追加します。RT/RNase H添加後のボルテックスはもうありません。
   10. マスターミックス溶液8.4μLを予冷した1.5mLチューブ10本に分注し、チューブを氷上に置きます。これを行うには、ピペットチップをマスターミックス溶液に突っ込み、マスターミックス溶液をゆっくりと着実にチップに引き込むことで、気泡の形成を防ぎ、正確な体積測定を確保します。マスターミックス溶液を予冷した1.5 mLチューブに分注します。
       注:8.4μLを分注すると、私たちの経験では、マスターミックスチューブには1~2μLの懸濁液が残ります。実験者は、10回の反応すべてに十分な試薬を確保するために、分注量をわずかに調整することができます。粘性溶液を取り扱う際には、適切なピペッティング技術を使用してください。
   11. 分注が完了したら、液体窒素に浸した金属製のラックにチューブを置き、凍結乾燥の準備をします。チューブを液体窒素に5分間沈めます。
       注:凍結乾燥により余分な溶液が除去されるため、DNA/RNAインプットを追加でき、感度の向上に役立ちます。凍結乾燥したプレミックスRPA反応液は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。凍結乾燥は、同じバッチで調製されたRPAマスターミックスを使用して特定の実験を行う場合、再現性を高めるのに役立つため、より大きなバッチを作成することも役立ちます。
3. 凍結 乾燥
   1. 凍結乾燥機で、コレクターと棚の温度を確認します。必要に応じて、コレクタ温度が -75 ± 5 °C に達し、シェルフ温度が -30 ± 1 °C に達するまで待ちます。
   2. 金属製ラックの開いたチューブをクリーニングワイプペーパーで覆い、金属製のラックを開いたチューブと一緒に凍結乾燥機の棚に置き、棚のドアを閉じます。
   3. 表 1 に示すプログラムを選択し、スタートを押します。二次乾燥ステップの30分後(20°C、<0.1 mbar、ステップの時間を「無限」に設定することで温度が無限に保持されます)、プログラムの停止を押します。
      注:結露を防ぐために、チューブを凍結乾燥機で温めます。
   4. 真空解除バルブを開いて圧力を解放し、ラックを棚から取り外します。すぐにチューブにキャップをし、凍結乾燥反応液を-20°Cで保存します。
      注:凍結乾燥RPAおよびCRISPR-Cas13aプレミックス反応は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。

2. 凍結乾燥CRISPR-Cas13aプレミックス検出試薬の調製

注意: 機器の準備については、手順1.1に従ってください。

1. CRISPR-Cas13aプレミックス反応調製(10反応)
   1. 10 μL の LwaCas13a (^7,8,14 で社内製造) (2 mg/mL)、Cas 保存バッファー、10 ng/μL (225 nM) crRNA、25 mM rNTP、50 Unit/μL T7 RNA ポリメラーゼ、2 μM の FAM 蛍光レポーター。
   2. 148.8 μLのCas保存バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、0.6 M NaCl、5%グリセロール、2 mM DTT)を10 μLの2 mg/mL LwaCas13aに加え、126 μg/mL(900 nM)のLwaCas13aの作業溶液を調製します。
   3. CRISPR-Cas13aマスターミックス反応液を次のように調製します:71 μLのRNaseフリー水、20 μLの400 mM Tris pH 7.4、20 μLの60%(w/v)トレハロース、10 μLの10 ng/μL(225 nM)crRNA(ここでは、SARS-CoV-2の s 遺伝子および n 遺伝子を標的とする)、8 μLの100 mM rNTPミックス(各25 mM)、6 μLの50 Unit/μL T7 RNAポリメラーゼ、 25 μL の 2 μM FAM 蛍光レポーター、10 μL の 126 μg/mL (900 nM) LwaCas13aマスターミックスチューブを反転させてよく混ぜます。その後、スピンダウンします。
   4. マスターミックス17μLを氷上に置いた1.5mLチューブ10本に分注します。液体窒素に浸したラックにチューブを置き、チューブを液体窒素に5分間浸します。
2. 凍結 乾燥
   1. 凍結乾燥機で、コレクターと棚の温度を確認し、コレクターの温度が-75±5°Cに達し、棚の温度が-30±1°Cに達するまで待ちます。
   2. チューブを凍結乾燥機に入れます。 表 1 に示すプログラムを選択し、 スタートを押します。二次乾燥ステップの30分後(25°C、<0.1 mbar、ステップの時間を「無限」に設定することにより、温度は無限に保持されます)、プログラム を停止 します。
   3. 真空解除バルブを開いて圧力を解放し、ラックを棚から取り外します。すぐにチューブにキャップをし、凍結乾燥反応液を-20°Cで保存します。
      注:凍結乾燥RPAおよびCRISPR-Cas13aプレミックス試薬は、-20°Cで8ヶ月間保存できます。

3. RT-RPA核酸増幅

注:クロスコンタミネーションを防ぐために、作業場のエリアとピペッターは、前増幅、サンプル追加、および後増幅のために分離する必要があります。フィルター付きピペットチップの使用をお勧めします。

1. 熱振盪インキュベーターを42°Cで予温します。
2. 酢酸マグネシウム(Mg(OAc)₂)と酢酸カリウム(KOAc)溶液混合物(196 mM Mg(OAc)₂ と1.5 M KOAcで構成)を、凍結乾燥された予混合RT-RPAペレット(セクション1)が入ったチューブの側面に1 μL加えます。
   注:Mg(OAc)₂ とKOAcの混合物を添加するコツ:液滴はチューブの1mLの容量マーク付近に配置する必要があります。ここでは、液滴がはっきりと見え、チューブの閉鎖やその他のアクションによって失われる可能性は低くなります。増幅は、チューブの底に液滴を集めるためにスピンダウンした後に開始されます。一度に複数の反応を処理する場合、増幅を同時に開始できます。
3. 12.4 μLのRNAサンプル(またはコントロールサンプル)を加えて、RT-RPAペレットを再懸濁します。
   注:添加の順序は、陰性サンプル/陰性コントロール、テスト対象のRNA / DNA、陽性サンプル/ポジティブコントロールです。
4. RT-RPA反応を開始するには、ステップ3.2および3.3で追加した溶液を、スピンダウンミニ遠心分離機を使用して室温で3秒間短時間スピンダウンします。
5. チューブを慎重に軽くたたいて混合し、次に3秒間別の短いスピンダウンを行います。
6. 反応液を予熱した加熱ブロックまたは熱振盪インキュベーターに入れて、42°Cで60分間インキュベートします。
7. 反応終了後、反応チューブを取り出して氷上に置いてから、CRISPR-Cas検出ステップ(セクション4)に進みます。
   注:RPA増幅製品は、すぐに検出反応に使用することも、4°Cで数日間、または-20°Cで数ヶ月間保存することもできます。

4. CRISPR-Cas13核酸検出

1. 蛍光マイクロプレートリーダーの電源を入れ、加熱温度を37°Cに設定して予熱し、 表2に示すプログラムを選択します。
2. 384ウェルプレートを氷の上に置きます。
3. 凍結乾燥したCRISPR-Casプレミックス検出反応(セクション2)を、17 μLの8 mM塩化マグネシウム溶液を加えて再懸濁します。チューブを慎重に軽くたたいて混ぜます。次に、3秒間短時間スピンダウンし、チューブを氷の上に置きます。
4. 再懸濁した反応混合物18 μLを、氷上で予冷した384ウェルプレートの各ウェルに移します。
5. セクション3で調製したRPA生成物2 μLを各反応ウェルに加えます。
6. プレートを氷から取り出し、予熱した蛍光マイクロプレートリーダーにすばやく入れて、 スタートを押します。
   注:384ウェルプレートを予熱した蛍光マイクロプレートリーダーに移すときに反応開始を同期できるように、384ウェルプレートを氷上に置いた。

結果

SARS-CoV-2の s 遺伝子と n 遺伝子の組み合わせ検出によるFAM蛍光シグナル生成の動態と、凍結乾燥されたプレミックス反応製剤の最適条件を決定するためにその情報がどのように使用されたかに焦点を当てます。いずれの場合も、C_t 値が決定された検出限界(LoD)内に十分収まるサンプル(C_t ~31-33)と、LoDにC_t があるサンプル(C_t ~35-37)⁷を含め、より感度の高いプロトコルを区別できるようにしました。

凍結乾燥されたプレミックスRT-RPAの場合、プレミックス反応にKOAcが含まれていると、反応感度に悪影響を与えることがわかりました(図2A)。したがって、プレミックス反応からKOAcを省略し、RNAサンプルを添加した後、反応開始剤であるMg(OAc)₂とともに添加しました。また、同様のアッセイを使用して、凍結保護剤トレハロースの最適濃度(図2B)と凍結乾燥RT-RPA反応におけるトリグリシン⁷ の効果(図2C)を決定しました。したがって、最適な凍結乾燥されたプレミックスRT-RPA反応を、KOAcを含まない6%トレハロースで調製し(ただし、RNAサンプルの後に後で追加しました)、プロトコルセクション1に記載されているように、トリグリシンを添加しました。

図2:凍結乾燥されたプレミックスRT-RPA反応の最適化。 RT-RPA反応は、SAR-CoV-2の n 遺伝子を標的とするプライマーを用いて調製した。Mg(OAc)₂ は、すべてのプレミックス反応から除外されました。プレミックス反応に(A)KOAc、(B)トレハロース、(C)トリグリシンを添加した場合の効果を評価した。生成されたFAM蛍光による反応モニタリングは、リアルタイムサーマルサイクラーまたは蛍光マイクロプレートリーダーを使用して行いました。トリプリケート測定の個々のデータが表示されます。略語:RT =逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;C_t =サイクルしきい値;FAM =カルボキシフルオレセイン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

凍結乾燥されたプレミックスCas13aベースの反応では、正しい凍結保護剤を使用することの重要性を検証しました:6%トレハロースまたは2%スクロース¹⁹ のいずれかがうまく機能しましたが、1%または5%w / vの低ショ糖PEG20000凍結乾燥後の反応効率を維持しませんでした(図3)。MgCl₂ はすべての反応から省略され、再水和ステップで追加されました。最適な凍結乾燥Cas13ベースの検出反応は、プロトコルセクション2に示すように、6%トレハロースで調製しました。

図3:凍結乾燥されたプレミックスCas13ベースの検出反応の最適化。検出反応は、SARS-CoV-2 n遺伝子由来のRPA産物を用いて37°Cで行いました。試験は凍結乾燥の前後に行われました。MgCl₂は、すべてのプレミックス反応から除外した。(A)トレハロース、(B)PEG20000、(C)スクロースの凍結乾燥後の反応効率保存能力を評価しました。生成されたFAM蛍光による反応モニタリングは、リアルタイムサーマルサイクラーを使用して実施しました。「凍結乾燥後」条件の三重測定と「凍結乾燥前」条件の1回の複製からの個々のデータを示しています。図3A,BはPatchsung et ^al.7から引用した。略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;FAM =カルボキシフルオレセイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

RT-RPAおよびCas13ベースの反応用の凍結乾燥プレミックス試薬は、-20°Cで少なくとも8か月間安定です[図4]。

図4:凍結乾燥、プレミックスRPAおよびCRISPR-Cas13a試薬の-20°Cでの安定性試験。 (A)30日後、(B)45日後、(C)3ヶ月後、(D)5ヶ月後、(E)8ヶ月後の安定性試験。トリプリケート測定の個々のデータが表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

SARS-CoV-2の s 遺伝子と n 遺伝子を検出するための凍結乾燥RT-RPAおよびCas13ベースの反応のLoDを 図5に示します。シグナル生成の動態は、1つの遺伝子のみが検出された場合と比較して、デュアル遺伝子検出によって改善できます。

図5:単一遺伝子検出と二重遺伝子検出の分析感度(A)凍結乾燥シングルプレックスRT-RPAのLoDと、SAR-CoV-2のs遺伝子を標的としたCasベースの検出。(B)凍結乾燥シングルプレックスRT-RPAのLoDとSAR-CoV-2のn遺伝子を標的としたCasベースの検出。(C)凍結乾燥マルチプレックスRT-RPAのLoDと、s遺伝子とn遺伝子を標的とするデュアルCasベースの検出。LoDは、段階希釈したSARS-CoV-2 RNAを使用して決定し、そのC_t値はn遺伝子を標的とするRT-qPCRアッセイを使用して決定しました。3〜6回の反復測定からの個々のデータが表示されます。略語:LoD =検出の制限;RT = 逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;SAR-CoV-2 = 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2;C_t =サイクルしきい値;qPCR = 定量的ポリメラーゼ連鎖反応。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ウイルス検出だけでなく、CRISPR診断に基づくPOCジェノタイピングツールのプロトタイプを展示し、タイ固有の毒ヘビ種の特定を支援します(図6)。咬傷から採取したDNAサンプルを通じてヘビ種をより迅速かつ正確に同定することで、抗毒素の迅速な投与が可能になり、患者の生存率が向上します。我々は、Ophiophagus hannah(キングコブラ)を含む8種のヘビのミトコンドリアシトクロムb(cytb)遺伝子内の領域を標的とし(図6A)、O. hannah cytb遺伝子の合成DNA代理の検出がアトモルレベルの感度に達することを示しました(図6B、C)。

図6:ヘビ咬傷の毒物からヘビ種を特定するためのCRISPRベースの検出のプロトタイプ(A)Ophiophagus hannahのcytb遺伝子を検出するためのRPAプライマーとLwaCas13a crRNAデザイン。T7プロモーター(T7オーバーハング)は、フォワードRPAプライマーの5フィート端に配置されました。(B)60分間にわたるFAMシグナル生成の動態と(C)LwaCas13aを介したO.hannahのcytb遺伝子セグメントに対応する合成dsDNAインプットの検出によるエンドポイントFAM蛍光。異なるインプット濃度(0、^10-9、^10-12、^10-15、^10-18 M)を使用しました。データは、三重測定からの平均± s.d. です。略語:RPA =リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質;FAM =カルボキシフルオレセイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CRISPR-Cas13aプレミックス検出試薬の凍結乾燥
歩	ランプレート	シェルフ温度	時間 (hh:mm)	バキューム
	(°C/分)	(°C)		(mbar)
フリーズ1	3	-30	オフ	-
ドライ1	3	-30	オフ	0
ドライ2	3	4	01:00	0
ドライ3	3	20	∞	0

表1:プレミックスRT-RPAおよびCRISPR-Cas13a検出試薬の凍結乾燥機設定。 略語:RT =逆転写;RPA = リコンビナーゼポリメラーゼ増幅;CRISPR = クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文リピート。Cas = CRISPR関連タンパク質。

パラメーター		設定
温度		37°C
キネティックサイクル	所要時間	02:00 (分秒:秒速)
	インターバル時間	02:30 (分分:ss)
揺さぶり	所要時間	1秒
	モード	リニア
	振幅	1ミリメートル
蛍光強度	励起波長	488 nmの
	発光波長	520 nmの
	モード	ページのトップへ
	Zポジション	24470
	得	71
	統合時間	20μ秒
	フラッシュの数	25

表2:核酸検出用の蛍光マイクロプレートリーダープログラム。

ディスカッション

このプロトコルには重要な手順があります。エリアの分離には、核酸抽出、マスターミックス調製(増幅前領域)、サンプル添加、アンプリコン検出(増幅後領域)に別々のスペースを使用することをお勧めします。各エリアは、個別のツールと機器のセットを使用して設定する必要があります。あるエリアから別のエリアにツールを持ち込まないでください、特にポストから amplificationエリアから amplificationエリア。作業エリアの清掃が必要です:作業エリア、ピペット、ボルテックス、および油性マーカーは、RNase/DNase除染液/3%クロロックスと70%エタノールまたはオートクレーブ脱イオン水で清掃する必要があります。基本的な実験器具や、1.5 mLチューブプラスチックラックやミニ遠心分離機のローターアダプターなど、機器の取り外し可能な部品の洗浄が必要です。ヌクレアーゼフリー水は、ネガティブコントロールや反応成分として使用されるため、取り扱いに注意を払わないと汚染される可能性のある敏感な試薬です。ですから、一度だけ使う水の小さなアリコートを作ることをお勧めします。

常にアッセイプライマーを使用してネガティブコントロール反応を行い、コンタミネーションをチェックしてください。また、コンタミネーションの問題を避けるために、サンプル添加室ではなく、ヌクレアーゼフリーの水をプレアンプリフィケーションエリアに添加してネガティブコントロール反応を準備することをお勧めします。酢酸マグネシウム-酢酸カリウム混合物は、キャリーオーバーアンプリコンによる試薬汚染を避けるために、一度だけ使用する少量(~20 μL/チューブ)で分注する必要があります。凍結乾燥プレミックスRPA反応にマグネシウム-酢酸カリウム混合物を添加する場合は、毎回ピペットチップを交換することをお勧めします。実験のワークフローでは、増幅前実験から増幅後実験まで、ワークフローを一方向に保ちます。「クリーナー」(増幅前)ワークスペースから「より汚れた」(増幅後)ワークスペースに移行します。

アンプリコンのキャリーオーバー汚染を回避するための分析法の修正とトラブルシューティングのために、実験の3つの主要なステップを空間的に分離することをお勧めします。サンプルの追加;増幅と検出のステップ。マスターミックスは、ラボのテンプレートフリーのエリアで調製する必要があります。更衣の際は、手袋や白衣も交換してください。増幅前から増幅後まで一方向に働きます。同じピペットを異なるステップに使用することは避けてください。これらのステップには、さまざまなピペットのセットが配置されている場合が最適です:マスターミックスの準備。テンプレートDNA / RNAの追加;増幅された製品の転送。フィルター付きのチップを使用し、エアロゾルの発生をできるだけ防ぎ、チューブを開けるときにチューブの内側に触れないようにしてください。増幅実験で汚染が見つかった場合は、すべての試薬を交換する必要があります。可能であれば、新しい試薬を持って別のラボに行き、汚染が持続するかどうかを確認します。試薬以外は、ピペットなどは持参しないでください。オートクレーブ可能な場合は、ピペットのオートクレーブを試してみてください。

増幅率の向上(アッセイの最適化)には、まず、TwistDxのRPAマニュアルなど、メーカーの指示に従って最適な設計を行います。次に、RPAおよびCRISPR反応を促進することが知られている反応添加剤を追加するなど、反応の経験的最適化を試みます⁷。反応時間を長くする(例えば、RPA反応時間を最大60分にする);またはプライマー配列と濃度を変化させます。また、できるだけ多くのサンプル量を追加することをお勧めします。凍結乾燥試薬を使用すると、より多くのサンプル量を追加できます。バックグラウンド蛍光を低減するには、RPA終了後、検出に進む前に熱不活化ステップ(75°Cで5分間)を行うか、レポーターの濃度を最適化します。レポーターが多すぎると、背景が高くなります。さらに、RNase阻害剤を添加すると、レポーターのCas依存性分解を防ぐのに役立ちます。

(RT)-RPAおよびCRISPRベースの反応条件とその取り扱い手順を最適化するだけでなく、使用する試薬の品質が良好であること、およびすべての反応に先行する核酸抽出ステップが成功していることを確認する必要があります。凍結乾燥試薬は、高い検出感度を提供し、携帯性があり、POCテストを可能にし、多様な臨床サンプルに適用できます。また、凍結乾燥(RT)-RPAは、臨床検体から抽出した核酸抽出物を添加することで、瞬時に再水和することができます。以前の研究では、制限された量なしでより多くの核酸を投入すると感度が高くなり、標的核酸の総量が効果的に増加することが示されています。

CRISPRベースの診断は、鼻咽頭や咽頭のスワブ、尿、血清^7,8,11などの臨床サンプルを収集することにより、病原体を検出するように適応されています。また、一塩基変異体の鑑別、抗菌薬耐性生物の抗生物質耐性遺伝子の同定、がん関連変異の検出にも応用されています。この技術の有用性は、等温増幅やCRISPRベースの検出のための工学的生化学反応を、ハンドヘルド蛍光光度計やラテラルフローストリップなどのフィールド対応デバイスや読み出しと組み合わせることができるフィールドアプリケーションで最も大きくなる可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Material
ベタイン溶液	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC 処理水	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript 逆転写酵素	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	生産		株名:Leptotrichia wadei、略称:Lwa、タンパク質名:LwaCas13a
塩化マグネシウム溶液、1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNAポリメラーゼ	Lucigen	30223-2
ポリ(エチレングリコール)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
酢酸カリウム溶液、5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Riobnucleotide Solution Mix	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
ショ糖		TCI TCI-S0111-500G
トレハロース二水和物	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Trizma 塩酸塩溶液、1M、pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp ベーシックキット	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD デュアルLED ブルー/ホワイトライトトランスイルミネーター	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath Dual Block	ELITE	4-2-EL-02-220	モデル:EL-02
蛍光マイクロプレートリーダー	Tecan	30050303	モデル: Infinite 200 Pro
凍結乾燥機	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad ベンチトップ凍結乾燥機
マイクロプレート 384 ウェル	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, 小容量, Hibase, Med. バインディング, ブラック
リアルタイムサーマルサイクラー (CFX Connect リアルタイム PCR システム)	Bio-Rad	185-5201	モデル: CFX Connect Optics Module
オリゴヌクレオチド
s-gene フォワード RPA プライマー	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA プライマー	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene フォワード RPA プライマー	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n遺伝子逆RPAプライマー	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA for the s gene	Synthego		GAUUAGACUACCCAAAAACaaac GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA for the n gene	Synthego		GAUUAGACUACCCCAAAACG AAGGGGACUAAAACAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ レポーター	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA プライマー	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA プライマー	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC