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方法論記事

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

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DOI:

10.3791/66707

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2024年3月29日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

この記事について

サマリー

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

要約

ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

概要

心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています1。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている2。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例のない洞察を提供します6,7,8。

このプロトコルでは、高度なLSMと適応した組織透明化アプローチ9を組み合わせたイメージング戦略を導入し、特定の標識や機械的切片化を必要とせずにマウス心臓全体のイメージングを可能にします。さらに、従来のLSMイメージングは、マルチビューデコンボリューション10または軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡(ASLM)技術11,12,13,14,15によって強化され、軸方向の分解能を向上させることができることを提案する。さらに、これらの方法のいずれかと画像スティッチングを統合することで、空間分解能と視野(FOV)のトレードオフを効果的に克服し、成体マウスの心臓のイメージングを進歩させることができます。疎水性、親水性、およびハイドロゲルベースの方法を含む多数の組織透明化アプローチを組み込むことにより、心臓全体の形態を捕捉するためのより深い光透過が可能になります16,17,18,19。

現在のLSMシステムとは複数のクリアリング方法と互換性がありますが、目標は、脂質を屈折率に近い媒体に置き換えることにより、光子散乱を最小限に抑え、心臓などの組織への光の透過性を高めることです。iDISCOは代表20,21として選択され、その迅速な処理と高い透明性により、このプロトコルの自家蛍光イメージングに適合しました(図1A)。全体として、高度なLSMアプローチと組織除去技術の統合は、げっ歯類の心臓の複雑な心臓解剖学的構造を解明するための有望なフレームワークを提供し、心臓の形態形成と病因の理解を深めるための大きな可能性を秘めています。

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プロトコル

動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC #21-03)の監督下で承認され、実施されています。この研究では、出生後1日目(P1)の新生児と8週齢の成人を含むC57BL6マウスを使用しました。雄と雌の間に差は観察されませんでした。すべてのデータ取得と画像後処理は、研究または教育ライセンスを取得したオープンソースソフトウェアまたはプラットフォームを使用して実行されました。リソースは、合理的な要求に応じて著者から入手できます。

1.サンプル調製と組織透明化(6〜10日)

  1. 組織透明化手順を開始する前に、組織透明化方法に必要なすべての化学溶液を材料 表 で調製してください。
    注意: 特に有毒化学物質を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を着用しながら、ドラフトですべての手順を実行してください。
  2. 動物をCO2 で安楽死させるには、P1や8週間などの所望の時点でCO2 チャンバーに入れて心臓全体を採取し、新たに分離した心臓を室温(RT)で0.2M KClに浸して拡張期16で停止します。
  3. 心臓の解剖学的構造を4°Cで保存するために、ロッカーで一晩穏やかに攪拌しながら、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を浸して心臓を固定します( 表1を参照)。
    注意: PFAは有毒な化学物質であり、ドラフトの下で実行する必要があります。
  4. 室温で1x PBSで心臓を30分間、3回洗浄します。
    注:オプション:心臓をアガロースゲルに埋め込み、以下に説明するように、ステップ2でカスタムビルドLSMシステム用の心臓アセンブリを作成します。
    1. アガロースをPBSに溶解して1%アガロース溶液を調製し、混合物を完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。溶液を型に流し込み、溶液が40°Cに冷えるまで最下層を作ります。
    2. 心臓を型に入れ、固まるまで型にアガロースゲルを充填します。アガロースゲル内の気泡を除去して、イメージングのアーチファクトを最小限に抑えます。
      注:サンプルを埋め込むことで、取り付け中に心臓の解剖学的構造が損傷するリスクが軽減されます。
      注意:低融点のアガロースを使用し、サンプルを高温にさらすリスクを軽減するために、心臓を加熱されたアガロースに直接置かないでください。
  5. メタノールと脱イオン水(図1B)を混合したグラジエントを用いて心臓を脱水し、 表1に概説されているように、20%、40%、60%、80%、80%、および100%の連続濃度で処理します。新鮮な100%メタノール1xで繰り返して、完全な脱水を確実にします。新生児マウスの心臓を各メタノール混合物中で1時間、振とうしながら脱水します。8週齢のマウスの心臓とラットの心臓の潜伏時間を2時間に調整します。
    注意:メタノールは揮発性で刺激性があり、可燃性の化学物質です。
  6. 心臓を新鮮な100%メタノールと交換し、4°Cで10分間冷やします。
  7. 溶液を交換し、体積比1:5(30%H2O2〜100%メタノール)を使用してメタノール中の5%過酸化水素(H2O2)で心臓を漂白し、4°Cで一晩かけて色素を除去します。
    注:顔料を除去することで、光子の吸収を最小限に抑えることができ、アーチファクトを減らして画質を向上させることができます。
  8. 溶液を交換し、100%メタノール中で室温で1時間心臓をインキュベートします。



  9. figure-protocol-1






  2. figure-protocol-2
    figure-protocol-3



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結果

LSMは、明視野および点走査技術6,8,38,39,40のような他の光学イメージング方法とは対照的に、光損傷のリスクが最小限であり、高い空間分解能、および光学切片化により、心臓研究31,32,33,34,35,36,37を促進することが実証されている.した...

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ディスカッション

イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合により、げっ歯類モデルをイメージングする際の空間分解能と浸透深さの間の課題を克服することができます9,44.組織透明化技術は、脂質やその他の光散乱要素を除去することによって心臓を光学的に透明にし、より深いイメージング浸透を可能にする45。LSMと組み...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

動物モデルを惜しみなく共有してくれたUTサウスウェスタンメディカルセンターのエリックオルソン博士のグループに感謝の意を表します。UTダラスのDインキュベーターメンバーから提供されたすべての建設的なコメントに感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUTダラスSTARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% アガロース
低融点アガローサーモフィッシャー16520050
脱イオン水--
組織清澄用化学薬品 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
ジベンジルエーテル (DBE)Sigma-Aldrich33630
ジクロロメタン(DCM)Sigma-Aldrich270997
蛍光ビーズSpherotechFP-0556-2
過酸化水素(H2O2)Sigma-Aldrich216736
メタノールSigma-Aldrich439193
パラホルムアルデヒド(PFA)サーモフィッシャー47392
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-Aldrich79383
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Software and algorithms
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
BigStitcherHörl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
カスタマイズライトシートシステムの主要コンポーネント
0.63 - 6.3倍ズームボディオリンパスMVX-ZB10 
10X 照明対物レンズNikonMRH00105
1X 検出対物レンズOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSSレーザーLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSSレーザーLaserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 nm DPSSレーザーLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
BNCコネクタNational InstrumentBNC-2110
シリンドリカルレンズThorlabsACY254-050-A
DCモータコントローラ、4軸Physik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
ETLケーブルOptotuneCAB-6-300
ETLレンズドライバーOptotuneEL-E-4i
フィルターChromaET525/30
フィルターChromaET585-40
フィルターChromaET645-75
フィルターホイール シャッター計測器LAMBDA 10-B
電動翻訳ステージPhysik InstrumenteL-406.20DG10
電動翻訳ステージPhysik InstrumenteL-406.40DG10
電動翻訳ステージPhysik InstrumenteM-403.4PD
NIマルチファンクションI/ONational InstrumentPCIe-6363
sCMOSカメラ浜松C13440-20CU
ステッピングモーターポロル1474
チューブレンズオリンパスMVX-TLU
ス

参考文献

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