このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。
この記事について
サマリー
要約
シングルセルトランスクリプトミクスは、人体の細胞生物学の理解に革命をもたらしました。最先端のヒト小腸オルガノイド培養は、動物モデルと臨床研究の間のギャップを埋める ex vivo モデルシステムを提供します。シングルセルトランスクリプトミクスをヒト腸オルガノイド(HIO)モデルに応用することで、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学が明らかになりました。高度なシングルセルトランスクリプトミクスプラットフォームは、マイクロ流体分割とバーコードを使用してcDNAライブラリを生成します。これらのバーコード付きcDNAは、次世代のシーケンシングプラットフォームで簡単にシーケンシングでき、さまざまな視覚化ツールでマップを生成するために使用できます。ここでは、ヒト小腸HIOをさまざまな形式で培養および鑑別する方法と、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームでの使用に適したこれらのフォーマットから生細胞を単離する手順について説明します。これらのプロトコルおよび手順は、小腸HIOの使用を促進し、さまざまな異なる環境の文脈における転写レベルでのヒト腸上皮の細胞応答の理解を深めることができます。
概要
小腸上皮には、腸幹細胞(ISC)を収容する陰窩と、分泌系統と吸収系統の分化細胞で構成される絨毛の2つの異なるゾーンがあります。この複雑さに加えて、上皮の局所特異性があり、小腸の領域間に独自の機能特性を提供します。先駆的な研究により、ヒトの小腸陰窩と絨毛ゾーンの両方を手術組織または組織生検から 生体外で 生成できる培養条件が確立されました1。これらの培養物は、動物実験と臨床試験の間のギャップを埋め、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学を明らかにしています。HIOは、幹細胞の生存率を促進する成長因子と細胞外支持マトリックスを備えた培地を使用して、3D球状構造として増殖します。これらの条件により、主に前駆細胞と幹細胞で構成される陰窩のようなHIOモデルが得られます。成長因子の除去は、ISCの分化(絨毛様モデル)と成熟腸上皮細胞(杯、腸内分泌、房、腸細胞)の適切な比率での産生を促進し、細胞の増殖と分化、分極、バリア完全性、局所特異的特徴、および適切な生理学的応答とともに促進します2.HIO培養物は遺伝的に安定しており、陰窩のような状態で無期限に増殖することができます。これらの培養物の頂端表面への容易なアクセスは、単層フォーマット3での増殖を可能にする培養条件によって提供されます。HIOはまた、遺伝学、年齢、性別、民族性、疾患状態などの宿主の個体差の考慮を生物学的分析に含めることを可能にします。分析的および機能的評価ツールは、形質転換細胞株を中心としたアプローチで使用されるものと同じであり、フローサイトメトリー、顕微鏡法、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどのさまざまな分子技術が含まれます。
シングルセルトランスクリプトミクスは、各細胞タイプの生物学的プロセスへの個々の寄与についての洞察を提供することにより、小腸の生物学と生理学の理解に革命をもたらしています。この技術を用いた先駆的な研究は、天然のヒト腸内に存在する細胞型の風景を提供してきた4,5,6。シングルセル転写プロファイリングプラットフォームは、個々の細胞の転写ランドスケープの探索を可能にし、細胞の不均一性を科学的探索の最前線に浮かべることができます。一部のシングルセル転写プロファイリングプラットフォームでは、マイクロ流体分割とバーコード化を使用して、サンプルあたり最大10,000個の細胞から得られた細胞ポリアデニル化mRNAからcDNAライブラリを生成します。このプラットホームでは、単一細胞、バーコード付きオリゴヌクレオチド、逆転写試薬、および油を含む液滴が反応小胞を形成し、その結果、同じバーコードを持つ単一細胞からのすべてのcDNAが得られます。バーコード化されたcDNAは、次世代シーケンシングを使用して効率的にシーケンシングできます。生成されたデータは、バーコード化された配列を視覚化マップと単一細胞転写プロファイルに変換するソフトウェアと視覚化ツールで処理できます。細胞集団は、ヒト小腸上皮の公開データベースを使用して同定できます4,5,6。このプラットフォームを利用してマウスの腸オルガノイドをシングルセルレベルで調べる研究は数多くありますが、HIOのシングルセル転写応答の解析は7,8,9,10,11,12に遅れをとっています。
ここでは、小腸のHIOから生細胞を単離し、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームで処理するためのステップバイステップのガイドを提供します(図1)。培養と分化のガイドラインと、上皮分化に最適化された培地成分を提供します。ここでは、プラスチックまたは膜細胞培養インサート上での3次元(3D)培養および単層培養の3つの異なる培養フォーマットの細胞回収方法の概要を説明します。オープンソースソフトウェアを用いて得られたクラスタリングデータのサンプルを提供し、各クラスターで発現差のある遺伝子を導出します。
プロトコル
ここで使用したオルガノイド系統は、Texas Medical Center、Digestive Disease Center、GEMS Coreから入手しました。簡単に言うと、オルガノイドラインを最初に確立するために、ドナー組織サンプルを洗浄し、酵素的に消化して腸内陰窩を放出しました。陰窩は基底膜に埋め込まれ、培地で培養されました。ベイラー医科大学の治験審査委員会は、オルガノイドラインが確立される組織サンプルを取得するための研究プロトコルを承認し、提供された組織からオルガノイドラインを確立するためにすべてのドナーからインフォームドコンセントが得られました。
1. 差別化のための拡大に向けた3D HIOの継代
- 24ウェルプレート(固体基底膜周辺)で成長させたオルガノイドのウェルから培地をP1000ピペットで取り出して廃棄します。0.05% Trypsin-EDTAを300 μLをウェルに加え、P1000ピペットで5回上下にピペッティングしてオルガノイドを機械的に分解します。
- プレートを37°Cで4分間インキュベートします。成長因子を含まない500 μLの完全培地(CMGF-培地)と10% FBSを各ウェルに加えます(表1)。P1000ピペットとCMGF培地とHIO混合物をウェル内で10回前後に使用します。全容量を15mLチューブに移します。複数のウェルからの通過を同じ15 mLチューブに組み合わせます。チューブあたり10個を超えるウェルを組み合わせないでください。
- スイングローター遠心分離機(100 x g )を使用して、細胞を4°Cで5分間スピンダウンします。ペレットをチューブの底に保持して、すべての媒体を取り除きます。チューブを氷の上に保ちます。
- HIOめっきの数に必要な基底膜の量を計算し、冷たいP200ピペットチップを使用して、HIOペレットを30 μL/ウェルの基底膜に再懸濁します。HIO基底膜混合物を液滴として、冷たいP200ピペットチップを使用して24ウェルプレートの中心にピペットで移します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに移します。基底膜を5〜10分間固化させた後、WNT、R-スポンディン、ノギン、EGF、およびROCK阻害剤(WRNE + Y; 表1)各ウェルに、37°Cのインキュベーターで培養します。WRNE + Yで7日間、隔日で文化をリフレッシュします。
注:健康なHIOは、光沢のある出芽上皮を伴う嚢胞性の形状になります(図2)。嚢胞の中央にある細胞は視覚化できません。不健康なHIOは鈍く見え、中央がしっかりした厚い上皮を持っています。最も重要な特徴は光沢のある外観です。
2. HIOの差別化:3D形式
- 培養後1週間で、3D分化HIOsの3ウェルに3D HIOsの1ウェルを使用してください。
- ウェルからメディアを取り出します。P1000ピペットを使用して基底膜とHIOを分散させ、ウェルあたり500μLのCMGF-を冷やして、少なくとも5回ピペットで上下させます。HIOを100 x g のスイングローター遠心分離機を用いて4°Cで5分間スピンダウンします。ペレットをチューブの底に保持しているすべての媒体を取り除きます。
- めっきするHIOのウェルごとに30 μLの基底膜を添加します。HIOを含む基底膜の30 μL液滴を24ウェルプレートのウェルにピペットで移します。37°Cで10分間インキュベートします。500 μLのWRNE+Y/Diff (50/50)メディアを追加します。
- 24時間後に培地をさらに3日間分化培地に切り替え、1日おきに培地を更新します。サンプルごとに3つのウェルを準備してプールし、技術的なばらつきを減らします。
3. HIOの区別:単層フォーマット
- 96ウェルプレートの膜細胞培養インサートまたはウェルに、100 μL/ウェルのヒト胎盤コラーゲンIV(100 mM酢酸中1 mg/mL)を冷冷H2O(1:30)で希釈してコーティングします。37°Cで最低1.5時間、または最大一晩インキュベートします。膜細胞培養インサートの場合は、プレートスペースに滅菌H2Oを追加してプレートを加湿します。96ウェルプレートの場合は、未使用のウェルに滅菌H2Oを添加します。
- 培地を取り出し、500 μL/ウェルの冷たたく0.5 mM EDTA(0.5 M EDTAを滅菌PBSで1:1000に希釈)を加えて基底膜と細胞を回収することにより、WRNEで7日間培養した3D HIOを収集します。P1000ピペットを使用してオルガノイドと溶液を5回上下にピペットし、15 mLの微量遠心チューブに移します。チューブごとに10ウェルを超えるオルガノイドをプールしないでください。スイングバケットローターで300 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
注:96ウェルプレート上に3つのウェルを調製するには、3D HIOの1ウェルを使用します。膜細胞培養インサートを1枚調製するには、3D HIOsを1ウェル使用します(単一細胞の播種密度は、96ウェルプレートで約1-2 x 105 細胞/ウェル、膜細胞培養インサートで約1-2 x 105 細胞/ウェル)。 - 500 μLのメディアを取り出し、ペレットをチューブの底に残します。0.05% Trypsin/0.5 mM EDTAを500 μL添加し、37°Cで4〜5分間インキュベートして、HIOを解離します。 P1000を使用して~50倍まで激しく上下にピペットで動かします。チューブの側面にピペッティングして気泡を作らないようにしてください。
- 10%FBSを含むCMGFを1mL追加してトリプシンを不活化します。.40 μmのセルストレーナーを10% FBSを含む1 mLのCMGFで湿らせ、細胞ストレーナーの上部に細胞を添加することにより、未消化細胞の大きな塊をろ過します。重力を利用して細胞がストレーナを通過させ、細胞塊を含むセルストレーナを廃棄します。
- 室温でスイングバケットローターに400 x g で5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。
- コラーゲンコーティングされた膜細胞培養インサートまたは96ウェルプレートから液体を取り除きます。10 μM Y-27632を含むWRNEの100 μL/ウェルにHIOペレットを再懸濁し、次に膜細胞培養インサートの上部コンパートメントまたは96ウェルプレートにピペットで移します。膜細胞培養インサートの場合は、10 μM Y-27632 を含む 600 μL の WRNE をウェルの下部コンパートメントに加えます。
- 24時間後に、膜細胞培養インサートの上部と下部の両方、または96ウェルプレートから培地を取り出し、分化培地と5日間交換します。サンプルごとに3つのウェルを準備してプールし、技術的なばらつきを減らします。
4. シングルセルトランスクリプトミクスのための分化した3D HIOからのシングルセル懸濁液の調製
- 酵素細胞消化試薬をCO2 インキュベーターに37°Cで置き、3D HIO消化開始の30分前に解凍して温めます。10倍の明視野顕微鏡を使用してHIOをチェックし、細胞の健康状態を確認します。
- 培地をウェルから取り出し、500 μLのコールドセル回収溶液をウェルに加えます。P1000ピペットと標準ピペットチップを使用して、基底膜から細胞を遊離させるために、数回ピペットを上下させます。細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
注:レプリケートウェルを使用すると、適切な細胞数が確保され、ウェル間の変動が減少します。以下のステップ4.7より前にウェルを結合しないでください。 - 細胞のチューブを氷上で10分間インキュベートし、5分ごとにピペッティングで上下します。400 x g 、4°Cで3分間遠心分離して細胞を回収します。
- 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、チューブから液体を取り出します。細胞を500 μLの予熱済み酵素細胞消化試薬に再懸濁します。P1000で少なくとも10倍ピペットを上下に動かします。
- HIOをCO2 インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。10分ごとに、P1000ピペットを使用して全容量を10回ピペットで移動し、細胞の解離を助けます。細胞懸濁液に気泡を導入しないでください。
- 細胞を400 x g 、4°Cで3分間ペレット化します。 上清を取り除き、細胞を分化培地1mLに再懸濁し、氷上に保存します。
注:この時点から、HIOは常に氷上に置いておく必要があります。 - P1000を使用して細胞を50倍速く上下にピペットで動かし、HIOが単一の細胞に解離していることを確認します。この段階で気泡が入り込むと、細胞が失われますので注意してください。
- P1000ピペットチップを使用して、70 μmのチップストレーナーで全容量をろ過します。1.5 mLの微量遠心チューブを使用して溶出液を回収します。
注意: 分解時間が十分であれば、フィルターチップが詰まることはありません。フィルターが目詰まりした場合は、複数のフィルターチップを使用してください。ボリュームをフィルターに無理に通さないでください。 - 40μmのチップストレーナで手順4.8を繰り返します。サンプルを氷上に保存します。
- トリパンブルー排除法を用いて、細胞計数チャンバー上で5 μLの0.4%トリパンブルーを5 μLの細胞懸濁液に加え、細胞計数チャンバー上で生存可能な単一細胞をカウントします。必要に応じてサンプルを1000細胞/μLに希釈します。細胞密度が1000細胞/μL未満の場合は、400 x g 、4°Cで2分間細胞をペレット化し、元の培地を取り除き、細胞培養培地に再懸濁します。このプロトコルは、典型的には5 x 105-1 x 106 細胞をもたらす。
注:高品質のシングルセルデータには、高品質の懸濁液(90%の生存細胞と90%のシングルセル)の調製が不可欠です。しかし、経験上、感染や低分子の適用などの治療が生存率に影響を与える場合、生存率は75%程度でも許容できることが示されています。 - シングルセル転写プロファイリングプラットフォーム用のDNAライブラリを、メーカーのプロトコルに従って調製します。scRNAseqデータ解析のベストプラクティスプロトコルに従ってデータを処理する13,14。
5. 膜細胞培養インサート上で分化したHIOsからの単一細胞懸濁液の調製
- 酵素細胞消化試薬をCO2 インキュベーターに37°Cで置き、HIO膜細胞培養インサート消化の開始30分前に解凍して温めます。予熱した酵素細胞消化試薬を、1.5 mLの微量遠心チューブ(膜細胞培養インサート1本につき1本)で200 μLのアリコートに分割します。チューブは、使用する準備ができるまで37°Cのインキュベーターに保管してください。
- PBS5 mLに0.5 M EDTAを5 μL加えて、PBS-EDTAを調製します。500 μL の PBS-EDTA を 24 ウェルプレート (膜細胞培養インサート 1 枚につき 1 ウェル) に分注します。
- PBS-EDTAで細胞を洗浄する:増殖培地を含むウェルからPBS-EDTAを含むウェルに膜細胞培養インサートを移します。細胞培養培地を頂端側から取り出し、100 μLのPBS-EDTAと交換します。細胞層を乱さないように注意してください。
- 膜細胞培養インサートの頂端側に添加したPBS-EDTAを直ちに廃棄します。膜細胞培養インサートをウェルから取り出し、端をペーパータオルにそっと触れて拭き取り、ベンチトップで反転させます。鋭利なメスの刃を使用して、メンブレンの内周の周りをカットすることにより、インサートからメンブレンを取り外します。乾燥を防ぐために素早く作業してください。
- 鉗子を使用して、酵素細胞消化試薬を充填した予熱済みの1.5 mL微量遠心チューブにメンブレンを移し、メンブレンが完全に水没していることを確認します。追加の膜細胞培養インサートすべてについて繰り返します。
注:酵素細胞消化試薬の容量を500 μLに増やすと、高密度の単分子膜の解離に役立つ場合があります。 - CO2インキュベーター内でチューブとメンブレンを37°Cでインキュベートすることにより、細胞を解離します。10分ごとに200 μLピペットで全容量を5回、合計30分間静かにピペッティングして混合します。生存率を維持するために、気泡や膜の吸引を避けてください。
- 細胞の小さなアリコート(1〜2μL)を10分ごとにスライドガラスに移し、単一細胞の割合を定性的に評価することにより解離を評価します。HIOの種類によっては、80%〜90%の単一細胞を達成するために、追加のピペッティングで最大50分かかる場合があります。混合ステップ中にピペットチップでメンブレンを優しくこすり落とし、特に解離しにくい細胞の場合は解離を促進しますが、こすり落とすと生存率に影響を与える可能性があります。
- 条件ごとに3つのレプリケートウェルを1つの1.5 mLマイクロ遠心チューブ(合計600 μL)に組み合わせます。400 μL の細胞培養培地 (diff) + 10 μM ROCKi (総容量 1 mL) を添加します。ピペッティングで穏やかに混合します。
注:レプリケートウェルを使用すると、適切な細胞数が確保され、ウェル間の変動が減少します。このステップで井戸をプールする必要があります。 - 1 mLピペットチップを使用して、70 μmチップストレーナーで全容量をろ過します。新鮮な1.5 mLの微量遠心チューブに流入します。
注意: 分解時間が十分であれば、フィルターチップが詰まることはありません。フィルターが目詰まりした場合は、複数のフィルターチップを使用してください。ボリュームを無理に押し込まないでください。 - 40μmのチップストレーナで手順5.9を繰り返します。サンプルを氷上に保存します。
- トリパンブルー排除法を用いて、細胞計数チャンバー上で5 μLの0.4%トリパンブルーを5 μLの細胞懸濁液に加え、細胞計数チャンバー上で生存可能な単一細胞をカウントします。必要に応じてサンプルを1000細胞/μLに希釈します。細胞密度が1000細胞/μL未満の場合は、400 x g 、4°Cで2分間遠心して細胞をペレット化し、元の培地を除去し、WRNE+Yで目的の細胞密度で再懸濁します。このプロトコルでは、通常、4 x 105 - 6 x 105 セルが得られます。
注:高品質のシングルセルデータには、高品質の懸濁液(90%の生細胞と90%のシングルセル)の調製が不可欠です。しかし、経験上、感染や低分子の適用などの治療が生存率に影響を与える場合、生存率は75%程度でも許容できることが示されています。 - シングルセル転写プロファイリングプラットフォーム用のDNAライブラリを、メーカーのプロトコルに従って調製します。scRNAseqデータ解析のベストプラクティスプロトコルに従ってデータを処理する13,14。
6. 96ウェル単分子膜として分化したHIOからの単一細胞懸濁液の調製
- 酵素細胞消化試薬をCO2 インキュベーターに37°Cで置き、単層HIO消化開始の30分前に解凍して温めます。
- PBS5 mLに0.5 M EDTAを5 μL加えて、PBS-EDTAを調製します。96ウェルプレートから細胞培養培地を廃棄し、100 μLのPBS-EDTAと交換します。細胞層を乱さないように注意してください。
- 細胞の解離:PBS-EDTAを廃棄し、各ウェルに100 μLの温かい酵素細胞消化試薬を加えます。プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに置き、200μLのピペットチップで全容量を5回静かにピペッティングして、10分ごとに20〜30分間混合します。生存率を維持するために気泡を避けてください。
注:酵素細胞消化試薬の容量を500 μLに増やすと、高密度の単分子膜の解離に役立つ可能性があります。 - 細胞の少量アリコート(1〜2μL)を10分ごとにスライドガラスに移し、解離を評価します。HIOの種類によっては、80%〜90%の単一細胞を達成するのに最大50分かかる場合があります。混合ステップ中にピペットチップでプレートをそっとこすり、特に解離しにくい細胞の解離を促進します。ただし、スクレイピングは生存率に影響を与える可能性があります。
- 1つの条件ごとに3つのレプリケートウェルを1つの1.5 mLマイクロ遠心チューブ(合計300 μL)に組み合わせます。700 μL の細胞培養培地 (diff) + 10 uM ROCKi (総容量 1 mL) を添加します。ピペッティングで穏やかに混合します。
注:複製成長ウェルを使用すると、適切な細胞数が確保され、ウェル間のばらつきが減少します。 - 1 mLピペットチップを使用して、70 μmチップストレーナーで全容量をろ過します。新鮮な1.5 mLの微量遠心チューブに流入します。
注:酵素細胞消化試薬消化時間が十分であれば、フィルターチップが詰まることはありません。フィルターが目詰まりした場合は、複数のフィルターチップを使用してください。ボリュームを無理に押し込まないでください。 - 40μmのチップストレーナで手順6.6を繰り返します。サンプルを氷上に保存します。
- トリパンブルー排除法を用いて、細胞計数チャンバー上で5 μLの0.4%トリパンブルーを5 μLの細胞懸濁液に加え、細胞計数チャンバー上で生存可能な単一細胞をカウントします。必要に応じて1000細胞/μLに希釈します。細胞密度が1000細胞/μL未満の場合は、400 x g 4°Cで2分間スピンして細胞をペレット化し、元の培地を除去し、細胞培養培地+ROCKiに所望の細胞密度で再懸濁します。このプロトコルは、通常、2 x 105 - 6 x 105 細胞を生成します。
注:高品質のシングルセルデータには、高品質の懸濁液(90%の生細胞と90%のシングルセル)の調製が不可欠です。しかし、経験上、感染や低分子の適用などの治療が生存率に影響を与える場合、生存率は75%程度でも許容できることが示されています。 - シングルセル転写プロファイリングプラットフォームメーカーのプロトコルに従ってDNAライブラリを調製します。scRNAseqデータ解析のベストプラクティスプロトコルに従ってデータを処理する13,14。
結果
膜細胞培養インサート、単層、および3D HIOの2〜3ウェルからシングルセル懸濁液をプールして、十分な細胞収量を確保し、ウェル間のばらつきを減らしました。シングルセルライブラリーは、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームに特異的な試薬を使用して調製しました。また、次世代のシーケンシングプラットフォーム上でペアエンドリードを使用してシーケンシングされ、30,000リード/セルです。リードは、シングルセルゲノミクス用の分析ツールを使用してマッピング、カウント、および分析されました。ミトコンドリアリードが20%を超える低品質の細胞、またはカウントされた遺伝子が200個未満の細胞は、分析から除外されました。細胞の品質を評価するために、遺伝子の数、UMI、および細胞あたりのミトコンドリアリードの割合をプロットしました(図3)。高品質の細胞には、約3500の遺伝子、15,000のUMI、および10%のミトコンドリアリードが含まれています。ろ過後、HIO増殖フォーマットに応じて4000〜9500個の単一細胞を取得しました。教師なしクラスタリングとUMAP次元縮小により、吸収性腸細胞や分泌細胞など、予想される細胞タイプを表す明確なクラスターが同定されました(図4)。
図1:プロトコルの手順の概要。 HIOをさまざまな形式でシングルセルデータワークフローにプレーティングする主な手順を概説した概略図。この画像はBiorenderを使用して作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:明視野画像。 処理の準備ができているHIOは、5倍の倍率で明視野顕微鏡を使用して画像化されました。左、3Dオルガノイド。中央、96ウェルプレート。そうです、トランズウェル。スケールバー = 200 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:データの品質管理。 96ウェルプレート上の単層として成長した空腸HIOから単離された単一細胞の分析指標の例。バイオリンプロットは、細胞あたりの遺伝子数(nFeature_RNA)、UMA(nCount_RNA)、およびミトコンドリアリード率(percent.mt)を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分析した単一細胞のUMAP.(A)合計9952個の単一細胞を、96ウェルプレートで増殖させた分化した空腸HIOから単離した。(B)膜細胞培養インサート上に増殖した分化空腸HIOから、合計5623個の単一細胞を単離した。(C)合計4402個の単一細胞が分化した回腸3D HIOから単離されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| WRNE成長培地 | 差別化媒体 | ||
| コンポーネント | 容積 | 最終濃度 | L-WRNコンディショニング培地、ニコチンアミドおよびSB202190を含まないWRNE培地 |
| ※Y-27632(5mM)オプション | 200μL | 10 μM | |
| A 83-01 (500 μM) | 100μL | 500 nM | |
| アドバンスドDMEM/F12 | 45ミリリットル | ||
| B27 さん | 2ミリリットル | ||
| EGF(50μg/mL) | 100μL | 50 ng/mL | |
| ガストリン (10 μM) | 100μL | 10 nM | |
| GlutaMax(100倍) | 1 mLの | ||
| HEPESの1メートル | 1 mLの | ||
| L-WRNコンメディア用 | 50ミリリットル | ~50% | |
| N2の | 1 mLの | ||
| N-アセチルシステイン(500 mM) | 100μL | 500 μM | |
| ニコチン酸アミド1 M | 1 mLの | 10 mM | |
| SB202190 (10 mM) | 100μL | 10 μM | |
| 総ボリューム | 100ミリリットル | ||
| CMGF-ミディアム | |||
| アドバンスドDMEM/F12 | 500ミリリットル | ||
| グルタマックス | 5ミリリットル | 100倍 | |
| 1 M ヘペス | 5ミリリットル |
表1: 使用されるさまざまなメディアの組成。
ディスカッション
シングルセルゲノミクスプラットフォームを使用すると、腸上皮をモデル化する組織由来のHIO培養物などの複雑な生物学的システムを分解して、全体的な生物学的応答に対する個々の細胞の寄与を得ることができます4,5,6。細胞の不均一性や希少な細胞集団も同定し、調査することができます。シングルセルトランスクリプトームベースのプラットフォームを使用してアウトプットを最大化するには、細胞インプットを最適化する必要があります。ここでは、非常に生存率が高く、高品質のシングルセル懸濁液が得られ、下流の高品質なトランスクリプトームデータが得られる可能性を高めるプロトコールについて説明します。プロトコールに精通していることは最も重要であり、ライブラリ調製を進める前に数回の練習を行うことをお勧めします。細胞をライブラリー調製に使用する前に、生存可能な単一細胞懸濁液の再現性のある達成が推奨されます。プロトコルの実装の迅速さは、速度が生存率の結果に正比例するため、最も重要です。これに基づいて、一度に処理されるサンプルの数を制限することをお勧めします。トラブルシューティングを支援するために、これらのプロトコルを開始する前にライブラリを準備するエンティティと対話することをお勧めします。
HIOの生存率は、シーケンシングに送られるDNAライブラリに直接影響します。HIOの細胞生存率は、解離、遠心分離、バッファー、ピペッティング、カウント精度など、シングルセル懸濁液の調製におけるいくつかのステップに依存します。このプラットフォーム用にHIOを準備する目標は、細胞生存率の維持とサンプル品質のバランスを取ることです。高品質のデータを得るためには、細胞凝集体、死細胞、非細胞核酸、逆転写の生化学的阻害剤を最小限に抑えることが重要です。死にかけている細胞は核酸ノイズを増加させ、細胞凝集の一因となり、データおよびプラットフォームの障害につながります7,8,9,10,11,12。適切なフィルター サイズでフィルタリングすると、大きな集計を削除してデータ品質を向上させるのに役立ちます。
単一細胞懸濁液を調製する際にHIO細胞死を最小限に抑えるには、いくつかの要素を考慮する必要があります。少なくとも80%の生存細胞を得ることが必要であり、>90%の生存率がさらに望ましいです。生細胞が不活性な細胞の数が多いサンプルは、カラムベースのマイクロビーズなど、死細胞を除去する戦略を用いて改善することができますが、これらの細胞は取り扱い中に損失するため、より多くの初期細胞と大量のサンプルを必要とします。HIOは特にバッファーに敏感であり、特定のバッファーでRTに長時間放置すると細胞死を起こします。オルガノイド培地は、細胞の損失と凝集体の形成を最小限に抑えます。ピペッティングは、解離中のHIO生存率にも影響を与える可能性があります。通常のボアチップはオルガノイドをせん断し、単一細胞懸濁液に解離するのを助けることができます。しかし、通常のボアチップで急ぎすぎるピペッティングは、せん断力によるHIO細胞の損傷を引き起こす可能性があります。ワイドボアチップによるゆっくりとしたピペッティングにより、HIO細胞へのストレスが最小限に抑えられ、下流の生細胞数が大幅に向上します。遠心分離、洗浄、および再懸濁は、HIO単一細胞懸濁液の品質に影響を与える可能性のある他の要因です。スイングバケット遠心分離により、HIO細胞のペレット化が穏やかになり、細胞損失を最小限に抑えながら死細胞の数を減らすことができます。最後に、濃度を決定するためのカウント精度は、ライブラリ合成のためにプラットフォームに到達する細胞の最大数を確保するために不可欠です。これらの詳細に注意を払うことで、単離プロセス中のHIO細胞へのストレスを最小限に抑え、処理後のデータリターンの可能性を最大限に高めることができます。
シングルセルトランスクリプトミクスは、シングルセルレベルで生物学的プロファイルと応答を解剖するための強力なツールですが、この技術をヒト腸オルガノイド培養の解析に応用する際には、いくつかの制限を考慮する必要があります。まず、ライブラリの調製およびシーケンシング中に生じる技術的なばらつきや、サンプル調製によるバッチ効果により、転写に大きなばらつきが生じる可能性があります。さらに、シーケンシングでは、遺伝子や細胞間でシーケンシングの深さが不均一である場合、カバレッジバイアスが生じる可能性があります。これは、低発現遺伝子を検出したり、希少な細胞集団を同定したりする際に課題を引き起こします。第二に、オルガノイド培養物の細胞および転写の不均一性、および天然の腸上皮と比較した場合の細胞プロファイルの分化が少ないため、細胞タイプの同定が困難になる可能性があります。転写応答を機能的な表現型に結合させることも課題であり、他のアプローチやアッセイを用いた追加の検証が必要です。第三に、このアプローチには、細胞の空間的文脈や時間的ダイナミクスの考慮は含まれていません。解離手順により、転写データから細胞間相互作用を推測する能力が失われます。それは、生物学的連続体ではなく、細胞状態の単一のスナップショットを提供するだけです。最後に、シングルセル転写アプローチはコストがかかる可能性があり、専門的な計算ツールとバイオインフォマティクスの専門知識が必要です。しかし、このアプローチは、細胞の不均一性を理解し、新しい細胞タイプを特定するための主要な最先端ツールであることに変わりはありません。
開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
著者らは、U19 AI157984、U01 DK103168、U19 AI144297、P30 DK56338、P01 AI057788、U19 AI116497助成金、および NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A を認めています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| [Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | 10 nM |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.4% Trypan blue | Millipore-Sigma | T8154 | |
| 0.5 M EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| 1x PBS Ca- | Mg-Corning | 21-040-CM | |
| 24 mm Transwell | Costar | 3412 | |
| 24ウェルNunclon delta表面組織培養皿 | Thermo Scientific | 142475 | |
| 40 µm細胞ス | トレーナーFalcon | 352340 | |
| 40 µm Flowmi チップストレーナー | SP Bel-Art Labware | H13680-0040 | |
| 70 & micro;m Flowmi tip strainer | SP Bel-Art Labware | H13680-0070 | |
| 96 well plate | Corning | 3595 | |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1X |
| Chromium Next GEM シングルセル 3'GEM、ライブラリ&ゲルビーズキットv3.1 | 10x Genomics | PN-1000128 | |
| コラーゲンIV | シグマ-アルドリッチ | C5533-5MG | 33 & マイクロ;g/mL |
| Corning 細胞回収溶液 | VWR | 354253 | |
| DPBS (Mg2-, Ca2-) | Invitrogen | 14190-136 | 1X |
| GlutaMAX-I | Invitrogen | 35050-061 | 2 mM |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-080 | 10 mM |
| L-WRN 馴染培地 | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | |
| mouse組換え EGF | Invitrogen | PMG8043 | 50 ng/mL |
| N2 サプリメント | Invitrogen | 17502-048 | 1X |
| N-アセチルシステイン | Sigma-Aldrich | A9165-5G | 500 µM |
| ニコチンアミド | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 10 & micro;M |
| トランズウェル | コーニング | 3413 | |
| Y27632 | 幹細胞技術 | 72308 | 10 µメートル |
参考文献
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
- Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
- Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
- Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
- Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
- Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
- Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
- Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
- Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).
再版と許可
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト