方法論記事

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス

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DOI：

10.3791/66752

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2024年4月26日

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

現在の研究では、ウイルス特異的TFH 細胞の早期運命コミットメントを評価し、これらの細胞における遺伝子発現を操作するためのプロトコルを示しています。

要約

濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞は、同族のB細胞が高親和性抗体を産生するのを助ける独立したCD4+ T細胞系統として認識され、したがって長期的な液性免疫を確立します。急性ウイルス感染時には、ウイルス特異的TFH細胞の運命コミットメントは感染初期段階で決定され、早期分化型TFH細胞の研究は、T細胞依存性体液性免疫を理解し、ワクチン設計を最適化するために重要です。本研究では、急性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルと、LCMV糖タンパク質エピトープI-AbGP66-77を特異的に認識するCD4+ T細胞を持つTCRトランスジェニックSMARTA(SM)マウスを用いて、フローサイトメトリー染色に基づくウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントにアクセスする手順を記述しました。さらに、SM CD4+ T細胞のレトロウイルス形質導入を利用することにより、早期分化型ウイルス特異的TFH細胞の遺伝子発現を操作する方法も提供されています。したがって、これらの方法は、ウイルス特異的TFH細胞の早期関与の根底にあるメカニズムを探求する研究に役立ちます。

概要

さまざまな病原体や脅威に遭遇すると、ナイーブなCD4+ T細胞は、特殊な機能を持つさまざまなヘルパーT(TH)細胞サブセットに分化することにより、免疫応答を調整します1。急性ウイルス感染のシナリオでは、ナイーブCD4+ T細胞の大部分が、B細胞2,3を助ける濾胞性ヘルパーT(TFH)細胞に分化します。他のCD4+ TH細胞サブセット(例えば、TH1、TH2、TH9、およびTH17細胞)とは異なり、TFH細胞は、B細胞ホーミングケモカインCXCL13のケモカイン受容体であるCXCR5をかなり発現し、TFH細胞がB細胞卵胞に移動することを可能にします。B細胞濾胞では、TFH細胞は同族のB細胞が胚中心反応を開始および維持するのを助け、したがって、迅速な高親和性抗体産生と長期体液性記憶を可能にする2,3。

急性ウイルス感染時には、ウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントは72時間以内に起こります 4,5 転写抑制因子B細胞リンパ腫-6(Bcl-6)5,6,7,8によって制御されます。Bcl-6の欠損はTFH細胞の分化を著しく鈍化させますが、異所性Bcl-6の発現はTFH細胞の運命関与を実質的に促進します。Bcl-6に加えて、複数の分子が初期のTFH細胞の運命コミットメントの指示に関与しています。転写因子TCF-1およびLEF-1は、Bcl-6 9,10,11の誘導を介してTFH細胞分化を開始する。Bcl-6およびTCF-1の両方によるBlimp1の阻害は、初期のTFH細胞運命コミットメント11,12に必要である。STAT1およびSTAT3は、初期のTFH細胞分化にも必要です13。さらに、ヒストンメチルトランスフェラーゼEZH214,15およびm6AメチルトランスフェラーゼMETTL316によるエピジェネティックな修飾は、TFH細胞の転写プログラム(特にBcl6およびTcf7)を安定化し、したがって早期のTFH細胞の運命コミットメントをプライムするのに役立ちます。前述の分子などを含む進歩は、他の場所で要約されています3が、初期のTFH細胞の運命関与の転写およびエピジェネティックな制御を理解する上で行われてきましたが、これまで知られていなかった分子はまだ学習されていません。

急性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルでは、LCMV糖タンパク質エピトープI-AbGP66-77を特異的に認識する養子移植されたコンジェニックTCRトランスジェニックSMARTA(SM)CD4+ T細胞は、ウイルス感染中にTFHまたはTH1細胞分化を受けます。この TFH/T H1 分岐分化パターンは、ウイルス特異的 TFH 細胞の生物学を研究する際の SM/急性 LCMV 感染モデルの進歩をサポートします。実際、SM/急性LCMV感染モデルは、TFH細胞研究分野で広く使用されており、TFH細胞生物学における画期的な発見において重要な役割を果たしてきました。これには、TFH細胞5,6の系統決定転写因子としての前述のBcl-6の同定、ならびに他の重要な転写因子(例えば、Blimp-16、TCF-1/LEF 9,10,11、STAT1/STAT313、STAT517、KLF218、およびItch19)の同定が含まれ、TFH細胞の分化、転写後調節(例えば、METTL316 および miR-17~9220) の TFH 細胞分化、TFH 細胞の記憶と可塑性21,22、および TFH 細胞を標的とする合理的なワクチン接種戦略 (例えば、セレン23)。

本研究では、(1)早期分化型TFH細胞へのアクセスに適した急性LCMV感染SMキメラマウスモデルの確立、(2)早期分化型TFH細胞に関連する分子のフローサイトメトリー染色の実施、(3)SM CD4+におけるレトロウイルスベクターベースの遺伝子操作の実施など、ウイルス特異的TFH細胞の早期運命コミットメントにアクセスするための再現性の高い方法が説明されていますT細胞。これらの方法は、ウイルス特異的TFH細胞の早期の運命関与を調査する研究に役立ちます。

プロトコル

すべての動物実験は、第三軍事医科大学の動物管理委員会および使用委員会によって承認された手順に従って実施されました。本研究では、次のマウス系統が使用されました:C57BL / 6J(B6)マウス(両性別)、6〜8週齢、体重25〜30 g。CD45.1+SM TCRトランスジェニックマウス(B6 CD45.1 × SM TCRトランスジェニック)、両性別、6〜8週齢、体重25〜30g;およびCXCR5-GFP CD45.1+SM TCRトランスジェニックマウス(B6 CD45.1 × SM TCRトランスジェニック×CXCR5-GFPノックイン)、両性別、6〜8週齢、体重25〜30 g。トランスジェニック種は、以前に発表された報告24に従って作製されました。本試験で使用した試薬、バッファー、機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 養子移しのためのCD45.1+ SM CD4+ T細胞の採取

  1. 必要な数の6〜8週齢のCD45.1 + TCRトランスジェニックSMマウス24を安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従って)。安楽死させたマウスの腹壁の左側に手術用ハサミで1インチの切開を行い、腹膜から脾臓を解剖し、脾臓の後ろの結合組織を引き裂く25,26。
  2. 各脾臓をペトリ皿(60 mm×15 mm)内の70 μm細胞ストレーナーに入れ、1 mLシリンジプランジャーを使用して3 mLの赤血球(RBC)溶解バッファーで脾臓を粉砕します。
    注意: シリンジプランジャーの丸い面を使用して、結合組織だけが残るまで脾臓を粉砕します。
  3. 各ディッシュに6 mLのRPMI + 2% FBS(RPMI 2%)を加えて、3 mLのRBC溶解バッファーを希釈します。細胞懸濁液を皿から15mLの円錐管にピペットで移します。さらに3mLの2%RPMIで皿をすすぎ、同じ円錐管に移します。
  4. 細胞懸濁液を800 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄します。細胞を分離バッファーで再懸濁し、細胞密度を1mLあたり10×8 細胞~1に調整します。チューブを氷の上に置きます。
  5. CD4+ T細胞を濃縮するための単離バッファーで、CD8a、CD19、NK1.1、F4/80、CD11c、およびTer119に対する1xビオチン化抗体カクテルを調製します。
    注:ビオチン化抗体を、 材料表に記載されているように、示された希釈で分離バッファーに加えます。抗体カクテルの容量は、ステップ1.4の分離バッファーの容量と同じに保ちます。
  6. 細胞懸濁液を800 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄します。
  7. 示された1xビオチン化抗体カクテルを含む細胞ペレットをコニカルチューブに再懸濁します。
  8. 円錐形のチューブを氷の上にシェーカーに入れ、45rpmで30分間置きます。
  9. ビオチン化抗体とのインキュベーション中に、製造元の指示に従って、必要な量のストレプトアビジンコーティングビーズを調製してください。
    注:1匹のナイーブマウスからの総脾細胞には、200μLのストレプトアビジンコーティングビーズが必要です。
  10. 800 x g で8-10 mLのアイソレーションバッファーを4°Cで5分間遠心分離して細胞を洗浄し、上清を捨てます。この手順をさらに 2 回繰り返します。
  11. 調製したストレプトアビジン被覆ビーズで細胞ペレットを再懸濁します。
  12. チューブを氷の上にシェーカーに入れ、45rpmで40分間置きます。
  13. 次に、すべてのビーズが磁気側に組み立てられるまで、チューブを磁気スタンドに3〜4分間置きます。
  14. 上清を慎重に収集し、新しい15mLの円錐形チューブに移します。
  15. 細胞懸濁液を800 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄します。
    注:CD4+ T細胞濃縮には、ステップ1.5〜1.15で説明したCD4+ T細胞濃縮手順の代替として使用できる他の市販キットがあります。
  16. 細胞ペレットを2〜3mLの2%RPMIで再懸濁します。CD4+ T細胞濃縮(CD4およびVα2)の効率と細胞生存率のフローサイトメトリー分析のために、50 μLの細胞懸濁液を吸引します。
  17. 細胞懸濁液を800 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄します。細胞ペレットをRPMIで再懸濁し、細胞密度を1 mLあたり1 ×10 7 CD4+Vα2+ SM細胞に調整します。チューブを氷の上に置き、次のステップで養子細胞移植に進みます。

2. 早期分化型SM T FH細胞へのアクセスのための急性LCMV感染SMキメラマウスモデルの確立

  1. 6週齢から8週齢のC57BL/6レシピエントマウスを赤外線ランプで温め、尾静脈を拡張して静脈内注射を行います。
  2. ステップ1.17で調製した1個×10個のSM 細胞を含む細胞懸濁液100μLをインスリン注射器で吸引します。
    注:注入量は各研究者が変更する必要があり、機関および地域の法律で許可されている最大注入量を超えてはなりません。
  3. マウス固定具でマウスを所定の位置に保持し、尾をまっすぐにし、綿球を使用して75%エタノールで尾を拭いて尾静脈が見えるようにします。
  4. インスリン注射針を尾静脈に挿入し、細胞懸濁液をスムーズかつゆっくりと注入します。次に、レシピエントマウスを一晩休ませます。
  5. 翌日、LCMV Armstrong ウイルスストックを RPMI 培地で希釈して、最終濃度 1 × 107 プ ラーク形成単位/mL を達成します。
  6. 希釈したLCMVアームストロング溶液100μL(1×10プラーク形成ユニットを含む)をレシピエントマウスの尾静脈に注入します。
    注:各研究者は、推奨される感染力価が機関および地域の法律で許可されているかどうかについて注意する必要があります。

3. 早期分化型SM TFH 細胞のフローサイトメトリー染色

  1. 感染後 3 日目にステップ 2.6 からマウス (施設で承認されたプロトコルに従って) を犠牲にし、ステップ 1 で説明されているように脾臓からリンパ球を処理します。細胞密度をmLあたり約2×107 細胞に調整します。
  2. 50 μL の細胞懸濁液 (~1 × 106 細胞) を丸底の 96 ウェルプレートにロードし、ウェルあたり 150 μL の染色バッファーを補充します。プレートを氷の上に保ちます。
  3. 精製したラット抗マウスCXCR5抗体カクテル(すなわち、CXCR5一次抗体)を、チューブ内の各サンプルについて、50 μLのTFH 細胞染色バッファーで1:50の希釈で調製します。チューブを十分にボルテックスし、15,000 × g で4°Cで3分間遠心分離して、粒子を凝集させます。チューブを氷の上に保ちます。
  4. 96ウェルプレートを800 × g で4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  5. ステップ3.4を繰り返し、ウェルあたり50μLのCXCR5一次抗体で細胞を再懸濁します。ピペッティングで上下させてよく混合し、氷上で1時間インキュベートします。
  6. ビオチン化ヤギ抗ラット抗体カクテル(CXCR5二次抗体)を、新しいチューブ内の各サンプルについて、50 μLのTFH 細胞染色バッファーで1:200の希釈で調製します。チューブをボルテックスし、15,000 × g で4°Cで3分間遠心分離し、粒子を凝集させます。チューブを氷の上に保ちます。
  7. プレートを800 gで800 × g 、4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  8. 手順3.7を2回繰り返し、プレートを氷の上に保ちます。
  9. 1ウェルあたり50 μLのCXCR5二次抗体をプレートに添加します。ピペッティングで上下させてよく混合し、氷上で30分間インキュベートします。
  10. 蛍光標識ストレプトアビジン(CXCR5三次抗体)を、各サンプルについて50 μLのTFH 細胞染色バッファーで1:200の希釈液で調製します。その間、表面マーカー(CD45.1、CD4、PD-1、CD25、およびその他の関心のある分子など)に対する他の抗体と死細胞染色をCXCR5三次抗体とともに追加します。
  11. チューブをボルテックスし、15,000 × g で4°Cで3分間遠心分離し、粒子を凝集させます。チューブを氷の上に保ちます。
  12. プレートを800 gで800 × g 、4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  13. 手順3.12を2回繰り返し、プレートを氷の上に保ちます。
  14. ウェルあたり50 μLのCXCR5三次抗体カクテルをプレートに加えます。ピペッティングで上下させてよく混ぜ、暗所で氷上で30分間インキュベートします。
  15. 各ウェルに200 μLの固定/透過化バッファーをメーカーの指示に従って調製します。
  16. プレートを800 gで800 × g 、4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  17. 手順3.16を2回繰り返し、プレートを暗闇の氷の上に保ちます。
  18. 各ウェルに200 μLの固定/透過化バッファーを添加します。ピペッティングで上下させ、室温で30分間(暗所)インキュベートしてよく混ぜます。
    注:透過化バッファー(1x)は、製造元の指示に従って調製します。
  19. Bcl-6、TCF-1、T-bet、およびその他の関心のある分子などの転写因子に対する抗体カクテルを、新しいチューブの各ウェルに対して50 μLの透過化バッファー(1x)で調製します。
  20. チューブをボルテックスし、15,000 x g で4°Cで3分間遠心分離して、粒子を凝集させます。
  21. プレートを800 × g で4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスし、1ウェルあたり50 μLの転写因子抗体カクテルを添加します。よく混ぜて、暗所で氷上で30分間インキュベートします。
  22. プレートを800 ×gで4°Cで1分間遠心分離し、上清を捨て、デカンテーションでプレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの透過化バッファー(1x)を添加します。
  23. 手順3.22を繰り返します。
  24. 各ウェルに200 μLの染色バッファーを添加し、プレートを800 × g で4°Cで1分間遠心分離し、上清をデカンテーションで廃棄し、プレートを短時間ボルテックスします。
  25. 各ウェルに細胞ペレットを200 μLの染色バッファーで再懸濁し、細胞をフローサイトメトリーチューブに移して、すぐにフローサイトメーター分析を行います。
    注:あるいは、各チューブに200μlの2%PFAを加え、暗所で4°Cで保存する条件で、サンプルを3日以内に検出できます。

4.レトロウイルスの生産

  1. 293T細胞(10継代未満)をDMEM 10%培地で10cm培養皿で2〜3継代培養します。
  2. 細胞が90%のコンフルエントに達したら、古い培地を廃棄し、PBSで細胞を2回穏やかに洗浄した後、0.25%トリプシン-EDTA1 mLを室温で1分間使用して293T細胞を短時間トリプシン化します。
  3. 細胞を2 mLの予熱済み10% DMEM培地に再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移し、200 × g で4°Cで5分間遠心分離することにより、消化プロセスを停止します。
  4. 上清を廃棄し、予め加温した2 mLの10% DMEM培地で培地を上下にピペッティングして、細胞ペレットを再懸濁します。
  5. 6ウェルプレートのウェルあたり2.5 mL 10% DMEM培地中の5細胞×10細胞の5細胞とプレートの数を定量化します。
    注:293T細胞がプレート全体に均一に広がるように、皿を静かに渦巻きます。
  6. 293T細胞のコンフルエントが80%を超えたら、ステップ4.7〜4.9で説明したようにトランスフェクション試薬を調製します。
  7. 6ウェルプレートの各ウェルについて、予熱したOpti-MEM培地250 μLを滅菌済みの1.5 mLチューブに加えます。次に、3 μgのプラスミドDNA(2 μgのレトロウイルスベクターと1 μgのpCL-Ecoを含む)をOpti-MEM培地に加え、その後、ピペッティングで穏やかに上下させて、完全に混合します。
    注:この研究で例として採用されたレトロウイルスベクターは、IRES-GFPの上流に Bcl6 CDS領域を持つMigR1および修飾MigR1ベクター(MigR1-Bcl6)です。
  8. 次に、あらかじめ加温したトランスフェクション試薬(市販品)7.5 μLを混合物に加え、ピペットで静かに上下させて、完全に混合します。
  9. 混合物を室温で20分間インキュベートします。
  10. 混合物を293T細胞培養ウェルの異なる領域に滴下し、その後、培養容器を前後左右に静かに揺さぶって、混合物が均一に分布するようにします。
  11. 293T細胞を5% CO2を含む37°Cインキュベーターで72時間インキュベートします。
  12. トランスフェクションした293T細胞におけるトランスフェクション効果のプロキシとして、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いて、レトロウイルスベクターのタグを検出します。
    注:例えば、MigR1ベクタートランスフェクションされた293T細胞のかなりの割合でGFP蛍光シグナルを確認し、高品質のトランスフェクションを示唆しています。
  13. 細胞培養培地を回収し、2,500 × g で4°Cで10分間遠心分離して、細胞の破片を除去します。得られた上清は、-80°Cで長期保存するか、4°Cで一時的に保存するために、慎重に収集して保存する必要があります。

5. SM CD4+ T細胞のin vivo活性化、レトロウイルス形質導入、養子導入

  1. 1 匹の CD45.1+ SM マウス (6 週から 8 週齢) に、100 μL の RPMI 培地に 200 μg の LCMV GP61-77 ペプチド11,14 を静脈内注射します。
    注:注入量は各研究者が変更し、機関および現地の法律で許可されている最大注入量を超えないようにする必要があります。
  2. ペプチド注射後16〜18時間でSMマウスを安楽死させます(施設で承認されたプロトコルに従います)。ステップ1の前述の手順に従って脾細胞を採取します。
    注:あるいは、ステップ5.1および5.2に記載のin vivoペプチド刺激の代わりに、in vitro抗CD3/抗CD28刺激法27,28を使用してSM CD4+ T細胞を活性化することができる。
  3. 脾細胞を2% RPMIで懸濁し、細胞密度を15mLコニカルチューブ内で1mLあたり約1×108 細胞に調整します。チューブを氷の上に保ちます。
  4. 50 μLの細胞懸濁液を丸底の96ウェルプレートに分注し、ウェルあたり150 μLの染色バッファーを添加します。
  5. 96ウェルプレートを800 × g で1分間、4°Cで遠心分離して細胞をペレット化し、デカンテーションで上清を慎重に除去し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  6. ステップ5.5を繰り返し、CD4、CD25、CD69を含む50 μLの表面抗体カクテルで細胞を再懸濁し、SM CD4+ T細胞の活性化状態を検出します。ピペッティングで上下させて十分に混合し、暗所で氷上で30分間インキュベートします。
  7. 各ウェルに染色バッファーを200 μLまで補充し、続いてプレートを800 × g で4°Cで1分間遠心分離します。 デカンテーションによって上清を捨て、プレートを短時間ボルテックスします。
  8. 手順5.7を2回繰り返します。
  9. 細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
  10. 蛍光標識抗体染色細胞をフローサイトメトリーで解析し、SM CD4+ T細胞の活性化状態を評価します。
    注:活性化SM CD4+ T細胞は、ナイーブ細胞と比較して豊富なCD25およびCD69の発現を示し、したがって、その後の形質導入手順を可能にした。
  11. ウェルごとに1×106 SM CD4+ T細胞(ステップ5.3から)を24ウェルプレートに添加します。細胞を800 × g で4°Cで3分間スピンダウンし、デカンテーションで培地を慎重に除去します。
  12. ステップ4.13で説明したように、1 mLのレトロウイルス培地と8 μgのポリブレンを各ウェルに加えます。
  13. 細胞を800 × g で37°Cで2時間スピン形質導入します。
  14. ピペッティングでレトロウイルス培地を慎重に廃棄し、10 ng/mLの組換えマウスIL-2を添加した予熱済みの10% RPMIを各ウェルに1 mL加えます。
  15. 5% CO2を含む37°Cのインキュベーターで細胞を48時間インキュベートします。
  16. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、細胞を800 × g で4°Cで6分間スピンダウンします。
  17. デカンテーションにより上清を除去し、適切な容量の2%RPMIで細胞を再懸濁して、15mLのコニカルチューブに1mLあたり10×8 個の細胞の細胞密度を作ります。チューブを氷の上に保ちます。
  18. 50 μLの細胞懸濁液を丸底の96ウェルプレートに分注し、ウェルあたり150 μLの染色バッファーを添加します。
  19. 96ウェルプレートを800 × g で1分間、4°Cで遠心分離して細胞をペレット化し、デカンテーションで上清を慎重に除去し、プレートを短時間ボルテックスし、ウェルあたり200 μLの染色バッファーを添加します。
  20. ステップ5.19を繰り返し、CD4、Vα2、ベクタータグ関連抗体を含む50 μLの表面抗体カクテルで細胞を再懸濁します。ピペッティングで上下させて十分に混合し、暗所で氷上で30分間インキュベートします。
  21. 各ウェルに染色バッファーを200 μLまで補充し、続いてプレートを800 × g で1分間遠心分離します。デカンテーションによって上清を捨て、プレートを短時間ボルテックスします。
  22. 手順5.21を2回繰り返します。
  23. 細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに移します。
  24. 蛍光標識抗体染色細胞をフローサイトメトリーで解析し、SM CD4+ T細胞の形質導入効率を評価します。
    注:効率的に形質導入されたSM CD4+ T細胞は、GFPなどのレトロウイルスのタグの高発現を示しました。
  25. ステップ5.17の細胞懸濁液を800 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄します。細胞ペレットをRPMIで再懸濁し、細胞密度を1 × 107 CD4+Vα2+ SM細胞/mLに調整します。
  26. ステップ5.25で10×106 CD45.1+ SM CD4+ T細胞の総数を各C57BL/6レシピエントマウス(6〜8週齢)に養子で移します。
  27. 翌日、C57BL/6レシピエントマウスに1 × 106 プラーク形成ユニットLCMV Armstrongを静脈内注射で感染させます。

6. レトロウイルス形質導入SMT FH 細胞のLCMV感染初期におけるフローサイトメトリー解析

  1. 感染後3日目のステップ5.25からC57BL/6マウスから脾臓細胞を取得します。
  2. ステップ3で説明したように、CD4、CD45.1、CXCR5、CD25、およびその他の関心のある分子を含む表面マーカーのフローサイトメトリー染色を行います。
  3. 蛍光タンパク質で標識されたレトロウイルスを形質導入したSM CD4+ T細胞の転写因子を検出するには、各ウェルに200 μLの2% PFAを添加し、室温で20分間暗所でインキュベートします。
  4. 固定/透過化、関心のある転写因子のフローサイトメトリー染色、およびステップ3で説明したフローサイトメトリー解析を実施します。

結果

急性LCMV感染時の早期分化型ウイルス特異的TFH 細胞の特徴
ウイルス特異的TFH細胞の早期運命関与を調べるために、LCMV GPエピトープI-AbGP66-77を特異的に認識するナイーブコンジェニックSM CD4+ T細胞をCD45.2+ C57BL/6レシピエントに養子として移植した。翌日、これらのレシピエントは、急性分解されたLCMVアームストロングの高用量で静脈内感染しました(図1A)。感染後3日目に、C57BL/6レシピエントの脾細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、大量のCD45.1+ SM CD4+ T細胞が転移したことが示されました(全CD4+ T細胞の~10%)(図1B)、さらなる調査に十分な数のウイルス特異的CD4+ T細胞が得られました。転写されたSM CD4+ T細胞のさらなる分析では、CXCR5およびBcl-6/TCF-1の共発現およびCXCR5およびCD25/T-betの相互発現が示され、TFH(CXCR5+Bcl-6+またはCXCR5+TCF-1+)およびT H1(CXCR5-CD25+またはCXCR5-T-bet+)系統が定義されました(図1C)).この研究で提示されたCXCR5抗体染色の特異性と感度を評価するために、前述のCD45.1+ SMマウス株とCXCR5-GFPノックインマウス株をさらに交配しました。これは、Cxcr529のオープンリーディングフレームの後にIRES-GFPコンストラクトを挿入することによって生成されたものです。次に、CD45.1+ CXCR5-GFPレポーターSM細胞をC57BL/6レシピエントに移しました。これらのレシピエントはLCMVアームストロングに感染しており、感染後3日目に脾細胞を分析しました。実際、本試験におけるCXCR5抗体染色法による蛍光シグナルは、感染後3日目に転写されたCXCR5-GFPレポーター29 SM CD4+ T細胞のGFPシグナルと細かく重なり合っており(図1D)、3ステップのCXCR5抗体染色法の高い特異性を示しています。

レトロウイルスベースのSM CD4+ T細胞におけるBcl-6の過剰発現
Bcl-6は、TFH細胞の分化を促進する上で最も重要な分子の1つです6,7,8。早期分化型TFH細胞へのアクセスにおける現在のプロトコルの信頼性を確認するために、CD45.1+ SM CD4+ T細胞をin vivoで活性化し、MigR1プラスミドまたはMigR1-Bcl6過剰発現プラスミドトランスフェクトした293T細胞からのレトロウイルス上清で形質導入しました(図2および図3A)。次に、レトロウイルス形質導入したSM CD4+ T細胞をC57BL/6レシピエントに養子導入し、次にC57BL/6レシピエントにLCMV Armstrongに感染させました(図3B)。感染後3日目には、MigR1-SM CD4+ T細胞ではTFH細胞とTH1細胞のバランスの取れた分岐が見られ、MigR1-Bcl6-SM CD4+ T細胞ではTFH細胞による分化が優勢であることがわかった(図3C)。一貫して、Bcl-6の発現レベルは、MigR1-SM CD4+ T細胞と比較して、MigR1-Bcl6-SM CD4+ T細胞で増加しました(図3D)。したがって、異所性Bcl-6発現駆動型TFH細胞分化6が現在のプロトコールに従って細かく再現されたという表現型。

figure-results-1
図1:LCMVアームストロング感染中のSM TFH細胞の早期運命コミットメントのフローサイトメトリー解析。脾臓CD4+ T細胞をCD45.1+ SMマウスから採取し、次いでC57BL/6レシピエント(CD45.2+)に養子として移植した。翌日、これらのレシピエントはLCMVアームストロングに感染しました。感染後3日目に、レシピエントの脾臓から転写されたCD45.1+ SM細胞をフローサイトメトリーで分析しました。(B)LCMVアームストロング感染後3日目にレシピエントの脾臓から転写されたCD45.1 + SM CD4 + T細胞のゲーティング戦略を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。(C)LCMVアームストロング感染後3日目にレシピエントの脾臓から転写されたCD45.1+ SM細胞におけるCXCR5およびその他のTFH細胞関連分子(Bcl-6、TCF-1、CD25、およびT-bet)の共染色を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。(D)LCMVアームストロング感染後3日目にレシピエントの脾臓から転写されたCD45.1 + CXCR5-GFPレポーターSM細胞におけるCXCR5およびGFPシグナルに対する蛍光標識抗体の共染色を示す代表的なフローサイトメトリーデータ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:SM CD4+ T細胞におけるレトロウイルス形質導入。 (A)SM CD4+ T細胞におけるレトロウイルス産生とレトロウイルス形質導入の概略図。レトロウイルス産生では、6ウェルプレートに播種した293T細胞に、細胞密度が≥80%のコンフルエントに達したときに、標的DNAプラスミドをトランスフェクションしました。次いで、レトロウイルスを含む細胞培養上清をトランスフェクションの72時間後に回収し、直ちに-80°Cで使用または保存した。 SM CD4+ T細胞におけるレトロウイルス形質導入のために、CD45.1+ SMマウスに200μgのLCMV GP61-77ペプチドを静脈内注射しました。次に、ペプチド注入の16-18時間後にSMマウスから脾臓を解剖し、脾臓CD4+ T細胞の活性化状態を検出した。活性化されたSM CD4+ T細胞にレトロウイルスを含む培養上清を形質導入し、in vitroで48時間培養した後、形質導入効率にアクセスしました。(B)プラスミドDNAトランスフェクション293T細胞におけるGFPの蛍光顕微鏡イメージング。スケールバー:400 μm. (C) ナイーブマウス由来の脾臓ナイーブCD4+ T細胞(ナイーブ、左)またはLCMV GP61-77ペプチド注入SMマウス由来の脾臓SM CD4+ T細胞(活性化、右)におけるCD25およびCD69発現レベルのフローサイトメトリー解析。(D)レトロウイルス形質導入SM CD4+ T細胞(形質導入、左)またはレトロウイルス非形質導入SM CD4+ T細胞(非形質導入、左)におけるGFP発現のフローサイトメトリー解析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:SM TFH細胞の運命コミットメントにおけるBcl-6過剰発現の影響 (A)レトロウイルスMigR1バックボーン(上図)およびIRES-GFP(MigR1-Bcl6)の上流におけるBcl6 CDS領域を持つ修飾MigR1ベクターの線形マップ(下図)。(B)実験計画。MigR1形質導入またはMigR1-Bcl6形質導入SM CD4+ T細胞は、LCMV Armstrongの1日前にC57BL/6レシピエント(CD45.2+)に養子導入されました。感染後3日目に、レシピエントの脾臓から転写されたCD45.1+ SM CD4+ T細胞をフローサイトメトリーで分析しました。(C)MigR1形質導入またはMigR1-Bcl6形質導入GFP+ SM CD4+ T細胞におけるCXCR5およびCD25のフローサイトメトリー解析。ゲートに隣接する数字は、SM CD4+ T細胞におけるTFH細胞の頻度を示しています。(D)MigR1形質導入またはMigR1-Bcl6形質導入SM CD4+ T細胞におけるBcl-6発現レベルのフローサイトメトリー解析。MFI、平均蛍光強度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

TFH 細胞の分野における研究は、B細胞を助ける上でのTFH 細胞の特殊な機能の発見以来、注目されてきました。蓄積された研究は、TFH 細胞の分化が多段階かつ多因子のプロセス30であり、ここでTFH 細胞の運命コミットメントが初期段階で決定されることを示しました5。したがって、早期分化型TFH 細胞の根底にあるメカニズムをよりよく理解することは、TFH 細胞の生物学と合理的なワクチン設計にとって非常に重要です。ここでは、LCMVアームストロングウイルス感染モデル、TCRトランスジェニックSMマウス、およびレトロウイルス媒介形質導入を利用して、ウイルス特異的TFH 細胞の早期運命コミットメントにアクセスし、早期分化型TFH 細胞の遺伝子発現を操作する方法を提供しました。

ケモカイン受容体CXCR5は、TFH細胞を他のCD4+ TH細胞サブセット6,7,8,31と区別する重要な表面マーカーであり、したがって、T FH細胞研究において高い特異性と感度のCXCR5染色法が必要です。この研究では、TFH細胞サブセットの同定において、3段階のストレプトアビジン-ビオチンCXCR5染色法が紹介されました(図1C)。高感度の2倍または3連鎖球菌抗体染色アプローチでは特異性の喪失が厄介な問題の1つですが、感染後3日目にCXCR5-GFP29レポーターSM CD4+ T細胞の3ステップCXCR5抗体染色による蛍光シグナルがGFPシグナルとほぼ完全に重なることがわかりました(図1D)。)は、3ステップのCXCR5抗体染色法による特異性と感度の両立を示唆しています。実際、この3連鎖球菌によるCXCR5染色戦略は試行錯誤され、信頼されており、研究者がTFH細胞生物学11,14,15,21および他のCXCR5発現T細胞タイプ29,32をよりよく調査するのに役立っています。

感染および免疫化において、TFH細胞の運命関与は、一般に、ナイーブCD4+ T細胞のT FH細胞または非TFHエフェクターTH細胞2,3,30のいずれかへの二分化によってモデル化される。この研究では、転写されたSM CD4+ T細胞におけるTFH細胞とTH1細胞のバランスの取れた分岐が示されました。さらに、これらの転写されたSM CD4+ T細胞は、感染初期段階では十分な細胞量であるため、TFH細胞の分化を研究するための適切なモデルとして機能します。確かに、レトロウイルス媒介性異所性Bcl-6の発現は、転写されたSM CD4+ T細胞における発現と比較して、対照SM CD4+ T細胞におけるものと比較してTFH細胞分化に強く偏っていた(86.6%対. 53.8%)(図3C)、これは以前の報告6と一致しており、さらに研究に記載されているプロトコルの正確性を証明している。あるいは、前述のプロトコルは、早期に活性化されたSM CD4+ T細胞11(データは示さず)における関心のある遺伝子(例えば、bcl6、Tcf7)のレトロウイルス媒介ノックダウンにも適用することができる。

このプロトコルの1つの制限は、タイミングの問題(合計で2時間以上)と、3ステップのCXCR5染色法の複数ステップのプロセスです。あるいは、1ステップの18,33または2ステップの4,9,34 CXCR5染色法もTFH細胞研究に適用されました。これらのCXCR5染色法の特異性/感度の比較は保証されます。

要約すると、現在の研究は、早期分化したウイルス特異的TFH 細胞にアクセスし、TFH 細胞の分化を潜在的に制御する関心のある遺伝子を調査するためのプロトコルを提供しました。これらのプロトコルは、初期のTFH 細胞運命コミットメントの研究を促進します。

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(No. 32300785 to X.C.)、China National Postdoctoral Program for Innovative Talents(中国国家革新的才能博士課程プログラム)からの助成金を受けて行われました。BX20230449からX.C.)、および国立科学技術メジャープロジェクト(No.2021YFC2300602からL.Y.)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTAコーニング25-052-CI
4% パラホルムアルデヒド固定液、4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μm細胞ストレーナーMerckCLS431751
Alexa Fluor 647抗マウスTCR Vα2 (クローン B20.1)Biolegend1278121:200 希釈
Alexa Fluor 700 抗マウス CD45.1 (クローン A20)Biolegend1107241:200 希釈
APC 抗マウス CD25 (クローン PC61)Biolegend1019101:200 希釈
B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouseThe Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 抗体 (clone BM8)Biolegend1231061:200 dilution
Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418)Biolegend1173041:200 dilution
Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)Biolegend1155041:200
ビオチンラット抗マウス CD8a (クローン 53-6.7)バイオレジェン1007041:200 希釈
ビオチンラット抗マウス NK-1.1 (クローン PK136)バイオレジェン1087041:200 希釈
ビオチンラット抗マウス TER-119/赤血球細胞 (クローン TER-119)バイオレジェンド1162041:200希釈ウ
シ血清アルブミン、BSAシグマA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)Biolegend6448161:100 希釈
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)Biolegend1352201:200 希釈
C57BL/6J (B6) mouseThe Jackson Laboratory000664
CXCR5-GFP knock-in reporter mouse社内;CXCR5-GFPノックインマウスラインは、Cxcr5のオープンリーディングフレームの後にIRES-GFPコンストラクトを挿入することによって生成されました。
DMEM 10% 中10% FBS DMEM 培地を含む DMEM 培地
Gibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
ウシ胎児血清、FBSSigmaF8318
FlowJo (バージョン 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/転写因子染色バッファーセットInvitrogen00-5523-00キットには3つの試薬が含まれています: a. 固定/透過濃縮液 (4X); b. 固定/透過化希釈液; c. 透過化バッファー。
Goat Anti-Rat IgG 抗体 (H+L)、BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 希釈
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation バッファー0.5% BSA および 2mM EDTA
LCMV GP61-77 ペプチドを含む FACS バッファー (GLKGPDIYKGVYQFKSV)中国のペプチド会社
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitationLife TechnologiesL101991:200 dilution
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM mediumGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)Biolegend1045081:200 希釈
PE マウス 抗 Bcl-6 (クローン K112-91)BD Biosciences5615221:50 希釈リン酸
緩衝生理食塩水、PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
精製ラット 抗マウス CXCR5 (クローン 2G8)BD Biosciences5519611:50 希釈
ラットモノクローナル PerCP抗マウスCD4(クローンRM4-5)Biolegend1005381:200希釈
組換えマウスIL-2Gibco212-12-1MG
赤血球溶解バッファーBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640培地SigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640培地、2% FBS
SMARTA(SM)TCRトランスジェニックマウス当研究室のSM TCRトランスジェニックラインは、Rafi Ahmed博士(エモリー大学)からの贈り物です。また、このマウス系統はジャクソン研究所(stain#:030450)からも入手できます。
2% FBS と 0.01% NaN3
eBioscience25-4317-821:200 希釈
TCF1/TCF7 (C63D9) ウサギ mAb (Alexa Fluor 488 コンジュゲート) 細胞シグナル伝達技術6444S1:400 希釈
TFH 細胞染色バッファー1% BSA および 2% マウス血清
TransIT-293 試薬Mirus BioMIRUMIR2700
希釈 ド ド ストレプトアビジン PE-Cyanine7 を含む PBS の染色バッファー を含む FACS バッファー

参考文献

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