顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、多方向の分化能を持つ幹細胞の一種です。付属肢骨由来のBMMSCと比較して、顎由来のBMMSCは増殖能力と骨形成分化能力が高く、徐々に顎欠損修復の重要な種子細胞になります。しかし、下顎骨は複雑な骨構造を持ち、付属肢骨よりも海綿状含量が少ない。従来の方法では、高品質の顎由来骨髄間葉系幹細胞を大量に取得することは困難です。この研究は、ラット顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)を単離および培養するための「幹細胞性に関するニッチベースのアプローチ」を示しています。初代ラットJBMMSCを単離し、全骨髄付着法と骨切片消化法を組み合わせて培養しました。単離された細胞は、細胞形態観察、細胞表面マーカーの検出、および多方向の分化誘導を通じてJBMMSCとして同定されました。この方法で抽出された細胞は、「線維芽細胞様」の紡錘体形状を示します。細胞は長く、紡錘形で、線維芽細胞様です。フローサイトメトリー解析では、これらの細胞はCD29、CD44、およびCD90に対して陽性であるが、CD11b/c、CD34、およびCD45に対しては陰性であり、これはBMMSCの特性と一致しています。細胞は強力な増殖能力を示し、骨形成性、脂肪形成性、および軟骨形成性の分化を受けることができます。本研究は、分化能の高い高品質なJBMMSCを短期間で十分に得るための効果的かつ安定した方法を提供し、生体機能の探索、再生医療、および関連する臨床応用のさらなる研究を促進する可能性があります。
概要
間葉系幹細胞(MSC)は骨髄で最初に発見され、培養中に接着コロニーを形成する能力と強力な骨形成能力を示しました1。Pittingerら2はさらに、骨、脂肪、軟骨に対する多方向の分化の可能性を発見しました。異なる供給源由来のすべての間葉系幹細胞は多方向の分化の可能性を秘めていますが、骨髄間葉系幹細胞は、他の組織に由来する間葉系幹細胞と比較して最も軟骨形成性分化能が高いため、骨組織工学の最良の候補細胞と考えられています3.しかし、多くの研究により、異なる起源のBMMSCは、骨形成分化能力や細胞増殖活性などの部位特異的な特性と特性を示すことが証明されています4,5。これは、顎と付属肢の骨、または腸骨稜6の間の異なる胚葉が原因である可能性があります。
顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)は神経外胚葉の神経堤細胞から発生し、大腿骨由来のBMMSCは中胚葉7に由来します。長骨や腸骨稜に由来するBMMSCと比較して、JBMMSCは増殖率、ALP活性、骨形成能が高い8。また、BMMSCの組織や臓....
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プロトコル
このプロトコルは、中国人民解放軍総合病院の施設動物倫理委員会によって承認されました。実験には、13週齢の雄のWistarラットを使用しました。動物、試薬、機器の詳細については、 資料表に記載されています。
1. 実験の準備
- 眼科用ハサミ、ピンセット、骨管を含むすべての手術器具を高温高圧で滅菌します。
- 事前に培地を準備してください。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むα-MEM完全培地を調製します。
- 0.1%II型コラゲナーゼをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製します。
- 使い捨ての滅菌50mL遠心分離チューブに1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBS50mLを調製します。.
2. ラットJBMMSCの単離と培養
- 以下の手順に従って、ラットの下顎骨を分離します。
注:サンプルの無菌性を維持するために、すべての金属製の手術器具は、使用前にアルコールランプの炎で少なくとも3秒間高温で消毒する必要があります。- 腹腔内注射により、ラットに2%ペントバルビタールナトリウム(2 mL / kg)で麻酔をかけます。.
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結果
細胞接種の72時間後、ほとんどの細胞は懸濁して丸い形をしており、壁に付着している細胞はほとんどありませんでした(図1B)。5日目までに、接着性細胞コロニーが出現し、紡錘体または線維芽細胞様の形状を示しました(図1C)。7日目までに、接着細胞は90%のコンフルエントに達し、少数の間欠的な懸濁細胞で「魚の群れ」の形を形成しました(図1D)。継代した細胞は急速に増殖し、3日ごとに継代されました。細胞形態は比較的均質で、主に紡錘形であり、コンフルエント後に渦状に配列されていました(図1E-G)。
フローサイトメトリー解析の結果、間葉系幹細胞表面マーカーCD90、CD29、CD44の発現レベルが高く、陽性率はそれぞれ97.2%、97.7%、95.7%であることが明らかになりました。逆に、造.......
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ディスカッション
骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、骨髄に存在する非造血幹細胞のサブセットであり、自己複製能力、多方向分化能、および造血の支持機能を特徴としています。これらの細胞は、組織再生、血管新生、細胞活動の調節など、さまざまな生理学的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たしている20。その結果、BMMSCは、最適なシード細胞源として、組織修復および再生工学において頻繁に利用されている21。
顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)は、2005年に松原らによってヒト顎骨髄穿刺動物から最初に単離され22、他の骨格部位と比較して、顎のユニークな起源と発生経路に起因する独特の分化特性を示す4,23。頭蓋顔面骨を支配する明確な発生的および病理学的メカニズムを考えると、頭蓋顔面骨欠損の修復においてJBMMSCを優先することは、それらの相同な発達特性のため.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、軍事委員会兵站部(19BJZ22)、北京自然科学基金会(7232154)、および第四ミル医科大学の臨床研究プロジェクト(2021XB025)のヘルスケアプロジェクトの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Alizarin Red S Solution 0.2% | Solarbio | G1450 | |
| BCIP/NBT アルカリホスファターゼカラー現像キット | Beyotime | C3206 | |
| Bio-Rad CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| CCK8 Kit | Dujindo | CK04 | |
| 細胞培養皿 10 cm | Corning | 353003 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5810R | |
| 遠心分離チューブ 15 mL | Corning | 430790 | |
| 遠心分離チューブ 50 mL | コーニング | 430828 | |
| CO2インキュベーター | サーモフィ | ッシャー3111 | |
| 恒温発振器 | Shanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd. | ZWY-100H | |
| ウシ胎児血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| フローサイトメーター | BD | FACS C6 | |
| 倒立位相差顕微鏡 | リンパス | CKX41 | |
| 間葉系幹細胞(ラット)表面マーカー検出キット | Oricell | RAXMX-09011 | |
| 多機能マイクロプレートリーダー | BioTek | Synergy LX マルチモード | |
| オイル レッド O ステイン キット | Solarbio | G1262 | |
| パラホルムアルデヒド 4% | Solarbio | P1110 | |
| PBS | MACGENE | CC008 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン 0.25% | MACGENE | CC004 | |
| PowerUp SYBR グリーン マスター ミックス | サーモフィッシャー | A25742 | |
| PrimeScript RT マスターミックス | タカラ | RR036A | |
| ラット骨髄間葉系幹細胞脂肪形成分化キット | オリセル | RAXMX-90031 | |
| ラット骨髄間葉系幹細胞軟骨分化キット | オリセル | RAXMX-90041 | |
| 骨髄間葉系幹細胞 骨形成分化キット | オリセル | RAXMD-90021 | |
| RNA抽出キット | TIANGEN | DP419 | |
| スーパークリーンベンチ | 北京Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd. | KLCZ-1220A | |
| トリプシン-EDTA 0.25% | MACGENE | CC012 | |
| II型コラゲナーゼ | Solarbio | C8150 | |
| Wistar ラット | 北京Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd. | ||
| α-MEM培地 | ギブコ | C12571500BT |
参考文献
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage poten....
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再版と許可
