Method Article

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)

DOI:

10.3791/66771

⸱

May 3rd, 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去数十年にわたって、呼吸超複合体(SC)の存在に関する証拠が蓄積され、ミトコンドリアの電子伝達鎖組織に対する私たちの理解が変わり、「可塑性モデル」の提案が生まれました。このモデルは、組織または細胞の代謝状態に応じて、SCと複合体の異なる比率の共存を仮定しています。SCにおけるアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と電子移動の効率を最適化し、活性酸素種の生成を最小限に抑え、環境変化に適応する細胞の能力を促進することができます。

最近では、神経変性疾患(アルツハイマー病およびパーキンソン病)、バース症候群、リー症候群、癌などのさまざまな疾患でSCアセンブリの異常が報告されています。疾患の進行におけるSCアセンブリの変化の役割は、まだ確認する必要があります。それにもかかわらず、SCアセンブリの状態を判断するのに十分な量のサンプルが入手可能であることは、しばしば課題となります。これは、生検や組織サンプルが小さい、または複数の分析のために分割する必要がある、成長が遅い細胞培養やマイクロ流体デバイスに由来する細胞培養、一部の一次培養物や希少細胞、または特定の高価な治療の影響を分析する必要がある場合(ナノ粒子、非常に高価な化合物など)に発生します。このような場合には、効率的で適用しやすい方法が求められます。この論文では、少量の細胞または組織から濃縮されたミトコンドリア画分を取得し、天然電気泳動とそれに続くゲル内活性アッセイまたはウェスタンブロットによるミトコンドリアSCの構造と機能を分析するための適応法を示します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

スーパーコンプレックス(SC)は、個々の呼吸鎖複合体1,2間の超分子的会合である。Schägger 2,3のグループによるSCの最初の同定とその組成の説明以来、SCは異なる化学量論で呼吸複合体I、III、およびIV(CI、CIII、およびCIV)を含むことが確立されました。SCの2つの主要な集団、CIを含むもの(およびCIII単独またはCIIIとCIV)で、非常に高分子量(MW、小さいSCで~1.5MDaから開始:CI + CIII2)と、CIIIとCIVを含み、CIVを含まないもの、はるかに小さいサイズ(~680kDaのCIII2 + CIVなど)の2つの主要な集団を定義することができます。これらのSCは、ミトコンドリア内膜に遊離複合体と共存し、これも異なる割合で存在します。したがって、CIは主にその関連型(つまり、SCで:ウシの心臓で~80%、多くのヒト細胞タイプで90%以上)3で見られますが、CIVは遊離型で非常に豊富(ウシの心臓で80%以上)であり、CIIIはよりバランスの取れた分布を示しています(より豊富な遊離型で~40%、 二量体として、ウシの心臓で)。

彼らの存在は現在一般的に受け入れられていますが、その正確な役割はまだ議論の余地があります4,5,6,7,8,9,10。可塑性モデルによれば、細胞タイプまたは代謝状態1,7,11に応じて、SCおよび個々の複合体の異なる比率が存在することができる。このアセンブリの動的な性質により、細胞は利用可能な燃料の使用と、環境変化に応答した酸化的リン酸化(OXPHOS)システムの効率を調節することができる4,5,7。SCはまた、活性酸素種の生成速度を制御し、個々の複合体4,12,13,14の安定化および代謝回転に関与することにも貢献できる。SCアセンブリ状態の変形は、異なる生理学的および病理学的状況15,16および老化プロセス17に関連して記載されている。

したがって、SCパターンの変化は、増殖に用いる炭素源に依存する酵母2およびグルコースがガラクトース4に置換されたときの培養哺乳動物細胞において記載されている。修飾は、絶食後のマウスの肝臓8およびミトコンドリア脂肪酸酸化がブロックされたときのアストロサイトでも報告されています18。さらに、SCおよびOXPHOSの減少または変化は、バルト症候群19、心不全20、いくつかの代謝21および神経学的22,23,24障害、および異なる腫瘍25,26,27,28で発見されています.SCアセンブリとレベルのこれらの変化が主要な原因であるか、またはこれらの病理学的状況における二次的な影響を表しているかどうかは、まだ調査中です15,16。さまざまな方法論により、SCの組み立てと機能に関する情報を得ることができます。これらには、活動測定8,29、超微細構造解析30,31、およびプロテオミクス32,33が含まれます。ますます採用されつつあり、前述のいくつかの方法論の出発点となっている有用な代替手段は、Schäggerのグループ34,35によってこの目的のために開発されたBlueネイティブ(BN)電気泳動によるSCアセンブリの状態の直接決定です。

このアプローチでは、ミトコンドリア膜を取得して可溶化するための再現性のある効率的な手順が必要であり、ゲル内活性分析(IGA)、2次元電気泳動、ウェスタンブロット(WB)などの他の手法で補完できます。BN電気泳動によるSCダイナミクスの研究における制限は、開始細胞または組織サンプルの量である可能性があります。Schäggerのグループ法から適応されたSCアセンブリと機能の分析のための一連のプロトコルを提示し、わずか20 mgの組織から始まる新鮮または凍結の細胞または組織サンプルに適用できます。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:すべての培地および緩衝液の組成は 表1 に規定されており、このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細は 、材料の表に記載されています。

1. 細胞培養からのミトコンドリアの単離

注:アッセイされた細胞の最小量は、パックされた細胞の~30-50μLです(ステップ1.4)。これは、細胞タイプ(L929由来細胞またはMDA-MB-468の5×106 および107 細胞)に応じて、少なくとも2つまたは3つの100 mm細胞培養プレート、または80〜90%のコンフルエンスで1つの150 mmプレートに約1つ対応できます。効率的なセル破損は重要なステップです。

  1. 接着細胞を約80%のコンフルエントまで増殖させるか、懸濁細胞を適切な密度まで増殖させます。
  2. 500 × g で5分間遠心分離することにより細胞を回収します(非接着性細胞の場合は細胞懸濁液から直接、または接着細胞の場合は1x PBS中の0.05%トリプシンおよび0.02%EDTAのトリプシン-EDTA溶液による標準トリプシン化後)。
  3. 細胞を冷冷PBS1倍で2回洗浄し、500 × g で5分間遠心分離して沈殿させます。
    注:この時点から、すべてのステップを4°Cで実行する必要があります。 したがって、すべての試薬は冷たくなければならず、細胞またはミトコンドリアを含むチューブは氷の上に置いておく必要があります。
  4. 2回目の遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレット量(cpv)を推定し、ステップ1.8で膜の破壊を促進するために、細胞を-80°Cで少なくとも15分間凍結します。
    注:この時点でプロトコールを停止することができ、細胞は-80°Cで数週間保存できます。通常、円錐形の底部を持つ10または15mLの目盛り付きチューブが適切です。
  5. 細胞を氷の上でゆっくりと解凍します。
  6. パックされた細胞ペレットを、cpvの7倍(10 mM MOPS、83 mMスクロース、pH 7.2)に等しい容量の低張バッファーに再懸濁します(例:700 μLのバッファーに100 μLのパックされた細胞)。
    注意: 効率的な ポップスを得るには、音量が十分である必要があります(手順1.8のメモを参照)。
  7. 細胞懸濁液を適切なサイズのPotter-Dounceホモジナイザーに移し、細胞を氷中で2分間インキュベートして膨潤させます。例えば、700〜800μLの細胞懸濁液の場合、1mLの容量のホモジナイザーで十分です。
  8. 600rpmで回転するモーター駆動のテフロン乳棒に結合されたホモジナイザーで8〜10回のストロークを行うことにより、細胞膜を破砕します。
    注:ストロークを行うときは、細胞の破損効率を高める真空を作り出すことが重要です。また、膜の膨潤と骨折のための低張作用と凍結作用がそれぞれ行われます。うまくいけば、ホモジナイザーを一筆一筆に素早い動きで引き下げるときに「ポン」という音がします。
  9. 細胞懸濁液(cpvの7倍)に同量の高張緩衝液(30 mM MOPS、250 mMスクロース、pH 7.2)を添加して、等張性環境を作り出します。
  10. ホモジネートを10〜15 mLのチューブに移し、固定ローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    注:この目的には、壊れていない細胞を含む元のチューブを使用できます。
  11. ミトコンドリア画分を含む上清を1.5mLのポリプロピレンチューブに移します。
  12. オプション:ミトコンドリアの収量を増やすには、ステップ1.10から緩衝液A(10 mM Tris、1 mM EDTA、0.32 Mスクロース、pH 7.4)の細胞ペレット容量の7倍にペレットを再懸濁し、ピペッティングを上下させ、1,000 ×gで4°Cで5分間遠心分離します。 新しい上清を前の上清と結合してから、手順 1.13 に進みます。
  13. 16,000 × g のマイクロフュージで4°Cで2分間遠心分離し、ミトコンドリア粗画分を回収します。
  14. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLのバッファーAで再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つに結合し、ステップ1.13で説明したのと同じ条件下で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
  15. 上清を捨て、最終ペレットを300 μLのバッファーAで再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。

2. 微量の動物組織からのミトコンドリアの単離

注:このプロトコルを一定の信頼性で適用するための組織の最小量は、細胞の種類とそのミトコンドリアの存在量によって異なりますが、ほとんどの場合、組織の20~30mgになる可能性があります。組織サンプルは、新鮮な材料または凍結サンプルにすることができます。後者の場合、手順を開始する前に、氷上に置かれた均質化バッファーでサンプルを解凍します。

  1. 組織の量(mg)をできるだけ近くに計量または推定します。
  2. ハサミで組織を切断し、小さな断片を失わないように注意しながら、ストレーナーの助けを借りて均質化バッファーで3〜4回の洗浄を行います。
    注:このステップは、脳やホモジナイゼーションステップによって細胞が直接容易に分解できる柔らかい組織よりも、骨格筋や心臓などの組織でより重要です。
  3. 新鮮な均質化培地(肝臓1グラムあたり4 mL、心臓、褐色脂肪組織(BAT)または筋肉1グラムあたり10 mL、脳または腎臓1グラムあたり5 mL; 表1の各ケースの特定の緩衝液組成を参照)を添加します。
  4. バッファーを含む組織片をホモジナイザーに移し、選択した組織に応じて最適なホモジナイズおよびミトコンドリア分離プロトコルに従います。
  5. 肝臓、脾臓、腎臓からのミトコンドリアの分離
    1. Elvehjem-Potterで4〜6回の上下ストロークで均質化し、モーター駆動のテフロン乳棒を600rpmで使用します。
    2. 均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 1.5 mLのポリプロピレンチューブに、前のステップで得られた上清を入れます。4°Cのマイクロフュージで16,000 × g で2分間遠心分離し、以下で説明したように進めます(ステップ1.13から1.15)。
  6. 心臓および筋肉サンプルからのミトコンドリアの単離
    1. Elvehjem-Potterで600rpmのモーター駆動のテフロン乳棒を使用して6〜8ストロークで均質化します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清をきれいな1.5mLポリプロピレンチューブに注ぎます。
      注:ステップ2.6.2で得られたペレットの2回目の均質化は、ミトコンドリアの収率を増加させるために、4〜5回の追加ストロークと1/2容量の均質化バッファーで行うことができます。新しい上清(再び1,000 × gで4°Cで5分間遠心分離した後)は、ステップ2.6.3に進む前に前の上清と組み合わせることができます。粗ミトコンドリアの収率を増加させるための代替手段は、均質化36,37の前にトリプシン溶液中の心臓および筋肉組織サンプルを解離することである。この場合、ミトコンドリア膜がジギトニンで可溶化される前に、トリプシンを効率的に不活性化/除去する必要があります(ステップ3.2)。
    3. 16,000 g×gのマイクロフュー ジで4 °Cで2分間遠心分離し、粗ミトコンドリア画分を得ます。
    4. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLの緩衝液ATで再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つに結合し、ステップ2.6.3で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    5. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。
  7. 脳からのミトコンドリアの分離
    1. 手動駆動のガラス乳棒を備えたDounceタイプのガラスホモジナイザーを使用して、脳の断片を10〜15回のストロークで均質化します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 上清をきれいな遠心分離チューブに集めます。
    4. 前の遠心分離ステップで得られたペレットを、最初の均質化で使用したのと同じ容量のAT培地に再懸濁します。ステップ2.7.1で説明したプロセスを5〜10回のパスで繰り返してペレットを再均質化し、スイングローターで懸濁液を1,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
    5. 上清を取り除き、手順2.7.3で準備したチューブに追加します。固定角ローターで10,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離し、粗ミトコンドリア画分を得ます。
    6. 上清を捨て、ペレットを培地ATの初期均質化量(ステップ2.7.1)の1/2に再懸濁します。ミトコンドリア懸濁液を清潔な1.5 mLポリプロピレンチューブに分配し、16,000 × g のマイクロフュージで4°Cで2分間遠心分離します。
    7. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLの緩衝液ATで再懸濁し、2本のチューブの内容物を1つに結合し、ステップ2.7.6で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    8. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。
  8. BATからのミトコンドリアの単離
    1. Elvehjem-Potterで8〜10回の上下ストロークで均質化し、モーター駆動のテフロン乳棒を600rpmで使用します。均質化された組織を滅菌遠心分離チューブに移します。
    2. スイングローターで1,000 × g 、4°Cで5分間遠心分離します。
    3. 1.5 mLのポリプロピレンチューブに、前のステップで得られた上清を充填し、上部の脂肪層を避けます。.
      注:ステップ2.8.2で得られたペレットの第2の均質化は、ミトコンドリア収率を増加させるために実施することができる。新しい上清(再び1,000 × g で4°C、5分間遠心分離した後)は、ステップ2.8.4に進む前に前の上清と組み合わせることができます。
    4. 4°Cのマイクロフュージで16,000 × g で2分間2分間遠心分離します。
    5. 上清を捨て、ミトコンドリアが豊富な各ペレットを0.5 mLのバッファーAT2で再懸濁し、2つのチューブの内容物を1つにまとめ、ステップ2.8.4で説明したのと同じ条件で遠心分離します。すべての材料が1本のチューブだけに収まるまで、同じプロセスを繰り返します。
    6. 上清を廃棄し、最終ペレットを300 μLのバッファーA(BSAなし)で再懸濁し、Bradfordアッセイを使用してミトコンドリアタンパク質濃度を定量します。前回と同様に再度遠心分離を行い、セクション3に進みます。

3. Blue Native分析用サンプルの調製

  1. ミトコンドリア画分(哺乳類細胞培養物または組織から得られたもの)をBNサンプルバッファー(50 mM NaCl、50 mMイミダゾール、5 mMアミノカプロン酸、4 mM PMSF)に再懸濁して、約10 mg/mLのタンパク質濃度を得ます。さまざまなタイプのサンプルの期待収量については、 表2 を参照してください。
  2. ジギトニン(10%ストック溶液)を添加してミトコンドリア膜を可溶化し、ジギトニン4g/ミトコンドリアタンパク質1g(ステップ3.1で調製したミトコンドリア懸濁液10μLに対してジギトニン10%ストック4μL)の比率を得ます。
    注:界面活性剤とタンパク質の比率(g / g)は、再現性のある結果を得るために、サンプルの種類ごとに最適化する必要があります。2-8gのジギトニン/gのミトコンドリアタンパク質が、ほとんどの組織に最適であることがわかりました34,35。
  3. ピペッティングで優しく上下させて混ぜます。サンプルを氷上で5分間インキュベートします。
    注:このステップの後、ミトコンドリア懸濁液はより明確になるはずです(不透明から半透明にシフトします)。そうでなければ、洗剤の量が正しい膜可溶化に不十分であることを示している可能性があります。
  4. マイクロフュージ(約20,000 × g )で4°Cで25分間全速力で遠心分離し、不溶性物質を除去します。
  5. 上清を新しいチューブに集めます。上清に、初期再懸濁量の1/3に相当する5%G-250(Coomassie Blue G-250 5% in 0.75 Mアミノカプロン酸)を加えます(ステップ3.1、これはタンパク質の最終比率1.6 gのCoomassie/gに相当)し、ピペッティングで混合します。
  6. ゲルにロードする前に氷上に保管するか、アリコートを-80°Cで凍結してください。

4. Blue Nativeゲル電気泳動

注:電気泳動は冷蔵室(4-8°C)で行われます。冷蔵室設備がない場合は、電気泳動タンクに冷却ブロックを導入できます。市販の3〜13%天然ポリアクリルアミドゲル29が使用されるが、所望の勾配濃度の自家製ゲルも使用することができる38,39。

  1. 上部と下部のチャンバーにそれぞれ冷陰極Aと陽極バッファーをロードします。あるいは、サンプルをウェルにロードしてから、上部チャンバーにカソードバッファーAを慎重に充填します。
    注:当研究室では市販の電気泳動バッファーを使用していますが、 表1に示すように調製することができます。
  2. 30〜100μgのミトコンドリアタンパク質をロードします。
    注:通常、10レーンゲル(0.5 x 0.15 cmウェル)にウェルあたり30〜50 μgのタンパク質(WB用)または40〜100 μgのタンパク質(IGA用)をロードします。カソードAバッファーにはクマシーブルーG-250が含まれており、濃い青色をしているため、サンプルローディング時にゲルウェルが見えにくくなっています。例えば、このステップ中にピペットチップを配置するのを助けるために、赤いマーカーで各ウェルの中心をマークすると便利です。ネイティブ分子量マーカーは、BN-PAGE法を設定する際に、グラジエントゲルが適切に形成されていること、および複合体とSCパターンが正しいものであることを確認するのに役立ちます。
  3. 80-100Vで25-30分間運転し、次に160-180Vで、電流を12mA/ゲルに制限し、染料がゲルの底に達するまで(合計で~125-165分)運転します。
  4. ゲル内活性アッセイ(IGA)を実施する場合は、色素前面がゲルの中央にあるとき(ラン開始後~1時間後)に、カソードバッファーAをカソードバッファーBに置換します。
    注:G-250色素への結合により、一部のバンド(主に複合体V、MWが~600 kDaの「内部」メーカーと見なすことができる)が見えるため、ラン直後にゲルを染色せずに文書化できますが、通常、SCおよび個々の複合体は染色またはIGAアッセイなしでは見えません。IGAアッセイまたはWBに使用するゲルは、染色または固定しないでください。
  5. カセットからゲルを分解し、Coomassie blue染色(セクション5)、IGA分析(セクション6)、またはWB免疫検出(セクション7)を続けます。

5. ゲル染色

  1. Coomassie青色色素溶液(Coomassie色素R-250を40%メタノール、10%酢酸に0.25%で、10〜15分間染色)を使用して、室温(RT)でゲルを10〜15分間染色します。
  2. RTで40%メタノールと10%酢酸で数回の洗浄(通常は4〜5 x 15分)で脱染します。
  3. ゲルを文書化します。

6. ゲル活性(IGA)アッセイ

  1. 電気泳動が終了する前に、さまざまな呼吸複合体の分析用のIGA溶液を調製し、それらを暗闇で維持します(たとえば、暗い色のプラスチックボックスを使用するか、アルミホイルで覆うなど)。各バッファーの構成を 表1に詳述します。
  2. 使用するゲルまたはレーンをできるだけ小さいプラスチックの箱に入れて、それを収容します。
  3. ゲルを覆うのに十分な量の適切な溶液(通常、5または10のゲルレーンでそれぞれ5または10 mL)を加え、軽く振とう(60-80 rpm)しながらRTでインキュベートし、光を避けてインキュベートします。
    注:インキュベーションの時間は、分析する複合体と、ロードされるサンプルの性質と量によって異なります。CI と CIV は、最も簡単で迅速に結果を出すことができます。したがって、CI活性は通常数分後に見え始めますが、CIIとCIVは観察に~30分、CVは~1.5-2時間かかります。反応はすべての場合において数時間継続することができ、インキュベーションを冷蔵室(4-6°C)に移すことで、例えば一晩(ON)インキュベーションすることでシグナルの増強速度を減らすことができます。CIII活性は、透明なネイティブ電気泳動(CN)でのみ機能し、BN34では機能しません。
  4. 適切なバンドができたら、アッセイ溶液を取り出し、蒸留水で2回洗浄し、ゲルを40%メタノールと10%酢酸(メタノールのみで固定するCVを除く)で30分間固定して反応を停止します。
    1. IGAによるCI検出後にCIV活性を解析するには、ゲルを蒸留水で2回洗浄し、CI活性を記録し、ゲルを50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)と2回30分間インキュベートし(固定せずに)、次に完全なCIV反応緩衝液で複合体IVバンドが現れるまで(通常は室温または4°CでONインキュベート)します。
  5. ゲルを文書化します。
    注:ATPase活性については、開発されたバンドが白色であるため、ゲルを文書化するときは、透明なバンドが見えるように暗い背景に置いてください。

7. ウェスタンブロット解析

  1. 表1に従って転写バッファーを調製し、電気泳動が終了するまで4°Cに保ちます。
  2. ゲルをトレイに置き、転写バッファーを追加します。室温で10〜15分間インキュベートします。
  3. ゲルと同じサイズのPVDFメンブレンを切断し、攪拌下で10秒間メタノール中で活性化します。蒸留水で数回洗浄し、転写バッファーを加えます。室温で10〜15分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
  4. 転写サンドイッチを下から上に、ゲルとメンブレンの間の気泡を避けて、次の順序で準備します:カセットの黒い面-スポンジ-吸い取り紙-ゲル-メンブレン-吸い取り紙-スポンジ-カセットの透明な面。
  5. カセットを閉じてロックし、サンドイッチをトランスファータンクに正しい向き(黒面を負極に向けて)に置きます。
  6. トランスファータンクにトランスファーバッファーを充填し、マグネチックスターラーを追加してバッファーを攪拌し、電源を80Vで2時間、または100Vで1時間接続します。4〜8°Cの移送(冷蔵室など)で、移送システムの冷却ブロックを使用して移送します。
  7. メンブレンを回収し、検出するさまざまな呼吸器複合体に対する特異的抗体を使用して、標準的なウェスタンブロットプロトコルを続行します29。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記のプロトコルに従って得られるミトコンドリアの収量は、細胞株または組織の種類、サンプルの性質(すなわち、新鮮組織または凍結組織を使用する場合)、または均質化プロセスの効率などのいくつかの要因によって異なります。さまざまな細胞株および組織からのミトコンドリアの予想収量を 表2に示します。ミトコンドリア画分が得られたら、次のステップは呼吸器SCパターンの分析であり、これは粗ミトコンドリアサンプルの可溶化とBN-PAGEによる電気泳動分離、続いてIGA分析またはWB免疫検出の後に行われます。 図1 は、培養細胞株とマウス肝臓ミトコンドリアサンプルの標準的なクーマシー染色後のラン直後の未染色ゲルレーンの様相とバンドのパターンを示しています。

図2A、Bでは、IGAアッセイを使用した後のヒト細胞とマウス細胞のSCアセンブリパターンの間に明確な違いが観察できます。したがって、遊離複合体Iはマウス細胞では観察されますが、ヒトミトコンドリアでは検出されません。複雑なIV-IGAパターンは、両方のヒト細胞株(図2B)で非常に類似していますが、図2Aで分析した2つのマウス細胞株間に違いがあります。これらの違いは、BL6細胞がSCAF18の変異型を発現するという事実によるものです。

SCパターンは、ここで説明するミトコンドリア単離のプロトコルで得られた、小さなサンプルで機能するため、より大きなサンプルに使用される「従来の」プロトコルに関して維持されます。これは、レーン1および6(3gの肝臓および1.1gのBATからの従来のプロトコルを用いてミトコンドリア単離後に得られた)を、それぞれ、レーン2および5(本明細書で提示されたプロトコルを用いて約0.1gの両組織から得られた)と比較することにより、 図2Cで見ることができる。可塑性モデルで提案されているように、呼吸複合体とSCの相対的な割合は、細胞の種類と代謝状態によって異なります。 図2C、Dに示すように、異なる組織は異なるSCアセンブリパターンを示しています。したがって、脳のミトコンドリアは、他の組織と比較した場合、遊離複合体Iのレベルが非常に低く、SCの割合が高く、BATはCVのレベルが低く(図2A)、SC III+IVの量が多い(図2D)という特徴があります。心臓のミトコンドリアは高レベルのSCとCVを示します.CVアセンブリパターンは、培養細胞株とマウス肝臓のミトコンドリアサンプルと非常によく似ています(図2E)。

SCアセンブリは、 図3 に示すように、脾臓制御細胞と腫瘍細胞から得られた2つのサンプルについて、WBによっても分析できます。この場合、通常、30〜50μgのミトコンドリアタンパク質は、特定の抗体を持つさまざまな複合体やSCを検出するのに十分です。 図 4 は、これらのプロトコルの適用中に発生する可能性のある主な落とし穴の一部を示しています。ゲルのグラジエントを間違えると、 図4Aのレーン1のように、ゲル中のアクリルアミド濃度が通常よりも高いため、SCがレーン上部のウェルの近くに留まる、異常で望ましくない移動パターンが生じる可能性があります。比較的短時間であっても、サンプルを高温(ここでは37°Cおよび40°Cで10分間)でインキュベートすると、SCおよびCIが劣化します(図4A レーン2-4)。同様に、界面活性剤とタンパク質の比率は、良好な結果と適切なゲル分離のために重要です。ジギトニン1g当たりタンパク質1gの比率が2g未満では、バンド分解能は徐々に低下し、低濃度(0.5g/g)では、SCに対応する領域の塗抹標本のみが見える(図4B)。

figure-results-1
図1:培養細胞株(L929Balbc)とマウス肝臓からのジギトニン透過性ミトコンドリアのBNGE分離後のミトコンドリア複合体とスーパー複合体のパターン。 左側のレーン(1および2)は、CVのみが検出可能なラン直後の未染色ゲルの側面を表し、右側のレーン(3および4)は、クマシー染色後のバンドのパターンを示しています。略語:BNGE = Blue Native gel electrophoresis;CV =複素数V;SCs = スーパーコンプレックス。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:異なる細胞株およびマウス組織から単離されたミトコンドリアのIGA解析 (A,B)(A)マウスまたは(B)ヒト細胞株から単離されたミトコンドリアにおける示された複合体のゲル内活性。L929Balbcは、前述の40,41のように、Balb/cJマウス血小板からL929neo細胞にミトコンドリアを移すことにより、当研究室で作製した伝染性細胞株である。BL6線維芽細胞は、BL6マウスの耳生検から当研究室で作製した不死化細胞株です。(C)マウスミトコンドリアからのCI−IGAパターンは、3gの肝臓(レーン1)および1.1gのBAT(レーン6)から始まる従来の方法、またはここで提示され、すべての場合において約0.1gの組織(レーン2、肝臓、レーン3、心臓、レーン4、脳、およびレーン5BAT)のいずれかを使用して単離された。(D)マウスの肝臓、心臓、脳、およびBATミトコンドリアにおけるCIV-IGAパターン(パネル2C、レーン2-5に示すCI-IGAの後に実行)。(E)マウス培養細胞および肝臓におけるCV-IGA活性の解析。レーンあたり約60〜75μgのミトコンドリアタンパク質をロードしました。略語:IGA =ゲル内活性;SCs = スーパーコンプレックス;CI = 複素数 I;BAT =褐色脂肪組織。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:脾臓サンプル中のさまざまなミトコンドリア複合体とスーパー複合体のWB免疫検出。脾臓コントロール(Spleen M9)および腫瘍(Tumor M9)サンプルから得られたミトコンドリア複合体とSCのBlue Native PAGE分離後、それらをPVDFメンブレンに移し、示されたCI、CIII、CIV、およびCIIサブユニット(それぞれパネルA-D)を認識する抗体と順次ハイブリダイズしました。レーンあたり約50 μgのミトコンドリアタンパク質をロードしました。アスタリスクは、前のウェスタンブロットから残っているシグナルを示します。略語:SC =スーパーコンプレックス;CI = 複素数 I;CIII = 複素数 III;CIV = 複素数 IV;CII = 複素数 II.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:Blue-Native PAGEによるSC分析の落とし穴。 CI IGAは、異なる可溶化条件下での(A)新鮮マウス肝臓および(B)凍結ラット肝臓から単離されたミトコンドリアの解析。(A)レーン1、間違ったゲルグラジエント濃度(通常の3〜13%ではなく8〜13%)。レーン2-4、サンプルを氷上で10分間インキュベートするか、ロード前にそれぞれ37°Cと40°Cでインキュベートします。(B)凍結ラット肝臓から得られたミトコンドリアのCIのIGA後パターンで、異なるジギトニン/タンパク質比を可溶化して得られたもの。略語:SC =スーパーコンプレックス;PAGE = ポリアクリルアミドゲル電気泳動;CI = 複素数 I;IGA = ゲル内活性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

中程度組成
低張バッファー10 mM MOPS、83 mM スクロース、pH 7.2
高張バッファー30 mM MOPS、250 mM スクロース、pH 7.2
均質化バッファーA10 mM トリス、1 mM EDTA、0.32 M スクロース、pH 7.4
均質化バッファーAT225 mM マンニトール、1 mM EGTA、75 mM スクロース、0.01% BSA pH 7.4
均質化バッファー AT2225 mM マンニトール、1 mM EGTA、75 mM スクロース、0.02% BSA pH 7.4
BNサンプルバッファー50 mM NaCl、50 mM イミダゾール、2 mM アミノカプロン酸、1 mM EDTA pH 7.0
ジギトニンソリューション50 mM NaCl、50 mM イミダゾール、5 mM アミノカプロン酸、4 mM PMSF 中の 10% ジギトニン
BNローディングバッファ5% Coomassie Blue G(0.75 Mアミノカプロン酸含有)
BNカソードバッファーA50 mM トリシン、15 mM Bis-Tris pH =7.0 (4 °C)、0.02% G-250 (クマシーブリリアントブルー G-250)
BNカソードバッファーB50 mM トリシン、15 mM Bis-Tris pH=7.0 (4 °C)、0.002% G-250
BNアノードバッファ50 mM Bis-Tris、pH=7.0
コンプレックスI IGA基板5 mM Tris-HCl pH 7.4、0.1 mg/mL NADH、2.5 mg/mL ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)
コンプレックスII IGA基板50 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.4、20 mM コハク酸ナトリウム、0.2 mM フェナジンメトスルフェート(PMS)、2.5 mg/mL NBT
コンプレックスIIIのIGA基板50 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.2、0.05% ジアミノベンジジン (DAB)
コンプレックスIV IGA基板CIIIと同じ溶液に50 μMシトクロムcを加えたもの
コンプレックスV IGA基板35 mM トリス、270 mM グリシン pH 8.3、14 mM MgSO4、0.2% Pb(NO3)2、8 mM ATP
染色液40%メタノールおよび10%酢酸中の0.25%のクマシー染料R-250
脱染・固定ソリューションメタノール 40%、酢酸 10%
転送バッファ48 mM トリス、39 mM グリシン、20% メタノール

表 1: バッファーとメディアの構成。

細胞タイプ/組織開始金額期待収量(μgミトコンドリアタンパク質)レーン数(50-60μg/レーン)
培養細胞
MDA-MB-468100 μL vpc300-400μg6-9
143B派生100 μL vpc200-350μg4-7
マウス線維芽細胞100 μL vpc150-200μg3-5
心100ミリグラム400-500μg10-12*
骨格筋100ミリグラム300-400μg8-10*
肝臓100ミリグラム400-500μg8-10
脾臓50ミリグラム150-250μグラム3-5
蝙蝠100ミリグラム200-300μg4-6
脳100ミリグラム250-300μg5-8

表2:異なる細胞タイプおよびマウス組織からのミトコンドリアの予想収量。 心臓や骨格筋から得られるミトコンドリア画分は、他の組織から得られるものよりも純度が高くなります。したがって、ゲルに少量を充填することができます(*)。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明するプロトコルで導入された方法論的適応は、ミトコンドリアの複雑な活性を維持しながら損失を回避し、収量を増加させることを目的としています(これは、十分な量のサンプルの利用可能性が損なわれた場合に重要です)そして、組織または細胞株の予想されるSCのパターンを再現することを目的としています( 図2Cを参照)).この目的により、SCを適切に検出するために高いミトコンドリア純度が必要ないため、可能な限りステップ数、回数、および体積が削減されました。

したがって、低速遠心分離による核および未破壊細胞の均質化および除去後、ミトコンドリアを含む上清を1.5mLポリプロピレンチューブに移し、その後の遠心分離を行って粗ミトコンドリア画分を得るためのマイクロフュージで、従来のプロトコルと比較して速度を上げ、時間と体積を減らします。これにより、比較的短時間で複数のサンプルを処理することができます:綿密な見積もりでは、10個のサンプルを~2-2.5時間で処理できます(均質化の開始(プロトコルステップ1.6.または組織の場合と同等)から、ゲルにロードする準備ができているSCsフラクションの取得(プロトコルステップ3.7)および活性を維持しながら損失を最小限に抑えます。元のSchäggerのグループプロトコールに関する別の変更は、SCsフラクションの取得のための膜可溶化後、単純なマイクロフュージ遠心分離(プロトコルステップ3.4)による超遠心分離ステップを置き換えることです。

この手順には、いくつかの重要な手順があります。まず、細胞破壊の効率、特に培養細胞の場合(プロトコールステップ1.8の後の注を参照)、特に小細胞の場合。組織および細胞株は、細胞破壊の難易度がさまざまである:例えば、心臓および筋肉では、このステップは通常、肝臓または脾臓よりも効率が悪いが、前者はミトコンドリア含量が高いため、収量で補われる。筋肉や心臓から単離した場合にミトコンドリアの収量を改善するための1つの代替手段は、均質化前にサンプルをトリプシンで処理することです。脳は、手作業による均質化が軽度で効率が悪いため、また、以前に報告されているように、この組織の細胞型の変動が大きいため、細胞破壊の効率が低い別の組織である 42。これは、私たちのプロトコルで提案されているように、2番目の均質化ステップ(ステップ2.7.4)によって部分的に補償できます。一方、細胞の破損が過度に多い場合、SCを含む最終サンプルは核DNA断片で汚染され、電気泳動の進行を妨げる可能性があります。この問題は、ジギトニンを添加してミトコンドリア膜を可溶化すると、試料の粘度が上昇することを示しており、DNAse Iによる処理で解決できます。

次に、界面活性剤とタンパク質の比率が低すぎると、膜の可溶化効率が低下し、凝集体が形成される可能性があります。これは、ゲルにおいて、高分子量SCにおける分解能の低さ( 図4参照)またはオリゴマー43に対応する複数のバンドを与えるCIVとして現れる可能性がある。比率が高すぎると、SC(主にCI-SC)の細分化につながる可能性があります。第三に、手順全体( 図4を参照)でサンプルを加熱しないようにし、凍結融解の繰り返しサイクルを避けることが重要です。

表2に、いくつかの細胞タイプと組織サンプルの予想収量の要約を示します。値は概算であり、セルの破損効率とソースの性質によって異なります。組織の場合、出発物質が凍結されている場合、新鮮なサンプルよりも高い収率が得られる傾向があります。ロード可能なレーン数の推定値(レーンあたり50〜60μgのミトコンドリアタンパク質の負荷を考慮)が示されています。

ここで紹介するプロトコールは、さまざまな組織や細胞タイプを小さなバリエーションでカバーしており、新鮮なサンプルや凍結サンプルで使用でき、高価な精製キットやグラジエントを使用せずに、シンプルな機器と比較的低コストで済みます。ただし、特定の細胞タイプやサンプルで使用するため、また、たとえば脳シナプスミトコンドリアや筋肉のサルコレンマルミトコンドリアなどの特定のミトコンドリア集団が分析の対象である場合には、いくつかの適応が必要になる場合があります。

正確な生理学的役割と病理学的状況へのSCの潜在的な関与はまだ定義されていないため、SCのダイナミクスとそれらの組み立て、安定性、および機能に影響を与える要因の分析が必要です。我々のプロトコールは、特に複数の実験条件を比較する必要がある場合に、小さなサンプルサイズで、さまざまな細胞タイプや組織から、SCパターンで再現性のある結果を得ることを可能にする貴重なツールとなり得る。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) からの助成金番号「PGC2018-095795-B-I00」、およびアラゴン州立行政局 (DGA) (https://www.aragon.es/) からの助成金「Grupo de Referencia: E35_17R」および助成金番号「LMP220_21」から PF-S および RM-L への支援を受けました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
酢酸PanReac131008
アミノカプロン酸フルカ アナリティカル7260
ATPシグマ・アルドリッチA2383
ビス トリスアクロンス オーガニックス 327721000
ブラッドフォードアッセイバイオラド5000002
クーマシー ブルー G-250Serva17524
クーマシーブルー R-250メルク1125530025
シトクローム cシグマ-アルドリッチC2506
ジアミノ  ベンジジン (DAB)シグマ-アルドリッチD5637
ジグマ-アルドリッチD5628
EDTAPanReac131669
EGTAシグマ-アルドリッチE3889
脂肪酸フリー BSAロシュ10775835001
グリシンPanReacA1067
ホモジナイザー テフロン乳棒デルタラボ196102
イミダゾールSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
メタノールLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1モノクローナル抗体Invitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein GelsInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 モノクローナル抗体Invitrogen459100
ニトロブルーテトラゾリウム塩 (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF 膜アマシャム10600023
フェナジンメタスルフェート (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL SubstrateThermo Scientific32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA モノクローナル抗体Invitrogen459200
コハク酸ナトリウムSigma-AldrichS2378
ストレプトマイシン/ペニシリンPAN バイオテクノロジーP06-07100
スクロースSigma-AldrichS3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 モノクローナル抗体Invitrogen459140
XCell SureLock Mini-CellInvitrogen EI0001
ジグマ-アルドリッチ D5637

References

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