健康なブタの新鮮な糞便からのバシトラシン産生 バチルスlicheniformis の分離、精製、および同定

サマリー

このプロトコルは、健康なブタの糞便からのバシトラシン産生 Bacillus licheniformis の単離、精製、および同定のための詳細なプロセスの完全かつ包括的な説明を提供します。

要約

Bacillus licheniformis とバシトラシンは、医学、化学、水産養殖、農業、および副業製品の分野で巨大なアプリケーション市場と価値があります。したがって、バシトラシンの産生が高い B.licheniformis の選択は非常に重要です。この実験プロトコルでは、高収率のバシトラシンを含む バチルス 菌を単離、精製、および健康なブタの新鮮な糞便から同定しました。 Micrococcus luteus に対する二次代謝物バシトラシンの阻害効果も試験されました。薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを使用して、バシトラシンの定性的および定量的検出を行いました。 B. licheniformis の生理学的および生化学的特性は、関連するキットによって決定されました。 B. licheniformis の系統関係は、遺伝子配列検出を用いて決定され、構築されました。このプロトコルは、動物の新鮮な糞便からの B. licheniformis の標準的な分離、精製、および同定プロセスを複数の視点から説明および紹介し、 工場でのB. licheniformis とバシトラシンの大規模な利用方法を提供します。

概要

Bacillus licheniformisは、Firmicutes科のバチルスの一種で、水、土壌、動物の腸など様々な環境に広く分布しています¹。B. licheniformisは短くて頑丈な棒状の構造をしており、個々に動きます²。コロニーはほぼ丸くくすんでおり、中央の膨らみと灰色がかった白のきれいな縁があります³。それは強力な成長および繁殖能力を持ち、単糖類、多糖類、ケトース、有機酸4などのさまざまな炭素源から栄養素を吸収して利用^{することができます。}成長と発達の後期段階では、B. licheniformisは休眠胞子の形で存在し、バシトラシン、リケニシン、サーファクチンなどの抗菌物質を産生することができます。また、栄養不足や極端な外部環境にも耐えることができます⁵。明らかなコドンの好みはなく、効率的な分泌システムがB. licheniformisの異種タンパク質分泌を決定し、これはBacillus subtilis⁶の2倍です。プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ⁷などの酵素製剤の製造によく使用されます。内因性毒素がないため、食品安全株として認定され、EFSA⁸によってQPSにリストされています。したがって、生理活性化合物の生産など、いくつかの潜在的な用途があり、これらは水産養殖、農業、食品、生物医学、および製薬業界で幅広い用途があります。また、B. licheniformisは動物の腸内細菌叢の重要な成分であり、動物が生産能力を向上させ、腸内細菌叢のバランスを改善し、病気を予防するように促すことができます。2004年にB. licheniformis ATCC14580の全ゲノムが解析され、転写翻訳、タンパク質のフォールディング、分泌機構の背景情報が徐々に理解されてきました⁹。この遺伝情報は、分子レベルでの遺伝子改変を助長し、B. licheniformisの大規模な生産を促進することに貢献しています。

バシトラシンは、 B. subtilis および B. licheniformisの二次代謝により非リボソームペプチド合成酵素によって産生されるドデカ環式ペプチド抗生物質です。バシトラシンは、バシトラシンA、B、Cなどのさまざまな成分で構成される混合物であり、各成分間で1つまたは2つのアミノ酸が異なります。このうち、バシトラシンAは最も強い生物活性を有する¹⁰。バシトラシンは、 ブドウ球 菌や Micrococcus luteus などのグラム陽性菌や、細胞壁の形成を阻害し、膜結合タンパク質と相互作用することにより、一部のグラム陰性菌を阻害することができる¹¹。一方、バシトラシンは安全で安定しており、薬剤耐性を生じにくく、他の抗菌薬¹²と互換性があります。したがって、バシトラシンは医療および獣医学の実践で使用されています。また、その高速な排泄率および低い吸収率のために、それはまた動物飼料¹³のための添加物として使用することができる。

B. licheniformisは 腸にコロニーを形成し、胃腸微小環境を改善することができます。異なる動物の消化管内の異なる供給源からのバチルスの接着および繁殖能力および関連する生理学的機能は異なる。ブタ由来の B.licheniformis は、ブタや他の家畜の腸内でのコロニー形成をより助長します。腸内プロバイオティクスの相対的な存在量と宿主¹⁴の健康状態との間には密接な関係があります。離乳した子豚にB . licheniformis ミックスを栄養補助食品として摂取すると、微生物叢の組成と代謝活性が変化して腸の生態系が改善され、腸粘膜にも影響を与える¹⁵。動物の糞便は、動物の腸内細菌叢の種類と量を反映することができます。このプロトコルは、健康なブタの糞便からのバシトラシン産生 バチルス 属の単離と精製について説明しています。糞便は、配合飼料を与えられていない太湖雌豚に由来し、養豚場で優れた生産性能を発揮します。分離株は、その形態学的特性、物理化学的特性、および生化学的同定に基づいて 、B. licheniformisとして 同定されました。

プロトコル

すべての実験手順は、南京工科大学の倫理委員会によって文書化され、承認されました。糞便は、専門的で標準的な養豚場で育てられた約2歳の太湖雌豚( 材料表を参照)に由来します。

1. メディアの準備

1. ルリア・ベルターニ(LB)液体培地:円錐形のボトルにNaCl10g、酵母エキス粉末5g、トリプトン10gを加え、1Lに蒸留水を加えて攪拌し、ガラス棒で溶解します。100mLのミディアムを500mLの円錐形ボトルに移し、通気性のあるシーリングフィルムでしっかりと結びます。オートクレーブ内で121°Cで20分間滅菌します( 材料の表を参照)。
2. LB固体培地:円錐形のボトルにNaCl 10 g、酵母抽出物粉末5 g、トリプトン10 g、寒天粉末20 gを加え、蒸留水1 Lに加え、ガラス棒で溶解し、通気性のあるシーリングフィルムでしっかりと結びます。オートクレーブで121°Cで20分間滅菌します。培地を50°Cに冷やしたら、20mLの培地をペトリ皿に注ぎ、冷ましてから逆さまに保管します。
3. バシトラシン発酵培地:大豆ミール8g、可溶性デンプン4g、0.1g(_NH4)_2SO4、CaCO 30.6g_、蒸留水100mLを500mLの円錐形ボトルに加え、ガラス棒で攪拌してよく溶かし、通気性のあるシーリングフィルムでしっかりと結びます。オートクレーブ内で121°Cで20分間滅菌します(材料の表を参照)。
4. M. luteus 懸濁液: M. luteus のリングを選択し、ステップ 1.2 で調製した LB 培養プレートで接種します ( 材料の表を参照)。37°Cの恒温インキュベーターで16時間培養します( 材料の表を参照)。5 mLの生理食塩水をプレートに加え、穏やかに振とうしてコロニーを溶出させます。OD600を測定し、試験管で溶液を希釈して、OD600で0.3〜0.7の懸濁液を得ます。 M. luteus の懸濁液は、後で使用するために4°Cで保存してください。
5. 抗菌活性アッセイ培地:ステップ1.4で調製した M.luteus 懸濁液1mLを、ステップ1.2で調製した液体LB固体培地100mLに加え、わずかに振とうします。 すぐにM. luteus を含むこの溶液を5mL取り、LB培養プレートに均等に広げます。

2.健康な豚の新鮮な糞便からのバチルスの分離と精製

1. 9 mLの生理食塩水と1.0 gの新鮮な豚の糞を150 mLの三角フラスコに加えます。.マグネチックスターラー( 材料表を参照)で室温60 rpm / minで15分間撹拌します。
2. 糞便抽出物を80°Cのサーモスタットウォーターバス( 材料の表を参照)に20分間入れて、胞子を生成しないバクテリアを殺します。
3. 懸濁液を250 mLの三角フラスコに入れた100 mLのLB液体培地に加え、シェーカー( 材料表を参照)で180 rpm/min、37°C、8時間培養します。
4. 培養細菌溶液を生理食塩水^10-1から^10-8までの順次希釈を行います。^10-6、^10-7、10-8の細菌希釈液0.1 mLを個々のLB培養プレートに塗布し、乾燥させます。10分後、プレートを逆さまにして、37°Cの恒温インキュベーターに48時間置きます。
5. 接種リングを使用して、 B. licheniformis (クリーミーな白色、柔らかい粘稠度、粘液状の外観、凸状、平坦な隆起、不規則な形状)¹⁶に類似したコロニーを選択し、ステップ1.5で調製した抗菌活性アッセイ培地にジグザグパターンを使用してそれらを縞模様にします( 図1を参照)。
6. プレートをインキュベーターに37°Cで48時間入れ、コロニーの周囲に阻害ゾーンがあるかどうかを観察します。

3. M. luteus の活性阻害のスクリーニング

1. 阻害ゾーンを生じたコロニーを1つ選択し、100 mLのLB液体培地に加え、シェーカー内で37°C、180 rpm/minで12時間培養します。
2. ステップ1.3で調製したバシトラシン発酵培地に5mLの培地を接種し、37°Cで48時間培養します。
3. 発酵ブロスを遠心チューブに集め、13,400 x g 、4°Cで15分間遠心分離した後、0.22 μmの微多孔質フィルターメンブレンを使用してろ過します( 材料の表を参照)。
4. オックスフォードカップを新鮮な抗菌活性アッセイ培地プレートに加え、オックスフォードカップに50μLの濾液(発酵上清)を加えます( 材料の表を参照)。インキュベーターで37°Cで12時間培養します。インキュベーション後、バーニアキャリパーで抑制ゾーンの直径を測定します( 材料の表を参照)。
5. その後の実験のために、阻害ゾーンの直径が15 mmを超える菌株と対応する発酵上清を選択します。

4. 薄層クロマトグラフィーによるバシトラシンの同定

1. 60 mgのバシトラシン標準物質を加え、10 mLの容量ボトル中の1% EDTA-2Na( 材料の表を参照)に溶解して、6.0 mg / mLのバシトラシン溶液を作ります。.
2. 発酵上清1mLを1%EDTA-2Naで10mLに希釈します。活性シリカゲル薄層プレート上に5 μLのサンプルと5 μLのバシトラシン標準溶液をスポットします( 材料の表を参照)。
3. 100 mL の n-ブタノール - 酢酸 - 水 - ピリジン - エタノール(60:15:10:6:5)をクロマトグラフィータンクに加えます( 材料表を参照)。シリカゲルの薄層プレートをクロマトグラフィータンクに入れます。蓋をして、室温で30分間放置します。
4. シリカゲル薄層プレートを取り出し、1%ニンヒドリンを含むブタノール-ピリジン溶液(99:1)( 材料表を参照)をスプレーし、茶色がかった赤い斑点が現れるまで105°Cで5分間加熱します。標準試料とサンプルの R_f (Retention Factor Value) を次の式に従って計算します。
   R_f = スポット移動距離/溶媒移動距離。

5. HPLCによるバシトラシンの検出

1. 2 mLの微量遠心チューブに0.3 mLの発酵上清と1.2 mLの50%エタノールを加え、手で5分間振とうし、4°Cで12時間放置します。
2. 13,400 x g で15分間遠心分離し、0.22 μmの微多孔質フィルターメンブレンでS1とラベル付けしたサンプルボトルにろ過します( 材料の表を参照)。
3. バシトラシン母液の調製:0.4 gのバシトラシン標準試料(60 U / mg; 材料の表を参照)、100 mLの40 g / L EDTA-2Na( 材料の表を参照)を100 mLのメスフラスコに加えて、240 U / mLのバシトラシン母液を調製します。.
4. 3 mLのバシトラシン母液と21、9、3、1、0 mLの超純水を、それぞれA1、B1、C1、D1、およびE1とラベル付けされた試験管に加えます。0.22 μmの微多孔質フィルターメンブレンでろ過した後、濾液をA2、B2、C2、D2、およびE2とラベル付けされたサンプルボトルに入れます。
   注:バシトラシン標準溶液の濃度は、30、60、120、180、および240 U / mLです。.
5. A2、B2、C2、D2、E2、S1をHPLC機器のテストトレイに入れます。1000 mL の 50 mM/L ギ酸アンモニウムと 1000 mL のアセトニトリルを移動相トレイにセットし、それぞれ移動相 A と B に設定します。
   注:ギ酸アンモニウムのpHは、ギ酸で4.0に調整する必要があります。
6. C18 (5 μm, 4.6 mm x 250 mm) HPLCカラムをカラムに示されている方向に取り付けます( 材料表を参照)。
7. 移動相のパラメーターを0分、77%A、23%Bに設定します。30分、70%Aおよび30%B;40分、60%Aおよび40%B;50分、60%Aおよび40%B;51分、77%A、23%B;58分、77%Aおよび23%B.サンプルサイズを100μLに設定します。流量、1.0 mL/分;カラム温度、30°C。
8. 「 実行 」ボタンをクリックして、プログラムを実行します。

6. 形態学的同定

1. LB培養プレート上で菌株を希釈し、最も高いバシトラシン力価でコーティングし、インキュベーターで37°Cで48時間培養します。以下に説明するようにコロニーの形態を染色し、観察します。
2. スライドに滅菌精製水を一滴加え、少量のコロニーを拾い上げ、水滴に加えます。均等に塗り、スライドを自然乾燥させてから、炎にかけます。
3. クリスタルバイオレットを1分間加えてサンプルを染色し、水道水ですすいでください。ヨウ素を1分間添加してサンプルを染色し、蒸留水ですすいでください。
4. アルコール95%を加え、スライドを振って1分間脱色した後、蒸留水ですすいでください。
5. サフランを1分間加えてサンプルを染色し、蒸留水ですすいでください。スライドを自然乾燥させ、油浸した顕微鏡でコロニーの形態を観察します( 材料の表を参照)。

7. 生理学的・生化学的同定

1. 2 mLの滅菌生理食塩水を試験管に加え、接種リングを使用してプレートから単一のコロニーを滅菌生理食塩水に接種し、細菌懸濁液を取得します。
2. Bacillus Biochemical Identification Strip上のV-P、クエン酸、ゼラチン、7%塩化ナトリウム、pH 5.7、硝酸塩還元、およびデンプン加水分解を測定するために、各穴に100 μLの細菌懸濁液を加えます(材料の表を参照)。
3. 接種リングを使用して、別の単一のコロニーを選択し、 バチルス 生化学的同定ストリップの嫌気性成長生化学チューブ上のジグザグパターンでそれらを縞模様にします。
4. 接種リングを使用して他のコロニーをピッキングし、 バチルス 生化学的同定ストリップ上のプロピオン酸、D-キシロース、L-アラビノース、およびD-マンニトールの同定のために、それらを細孔に垂直に穴を開けます。

8. 株遺伝子配列の決定

1. バクテリアDNA抽出キットを使用して菌株のDNAを抽出します(材料の表を参照):2mLのシード液を5mLの微量遠心チューブに加え、11,500 x gで1分間遠心分離します。上清を捨て、110 μL のバッファー (20 mM Tris、pH8.0、2 mM Na 2-EDTA、1.2% Tritonを含む) と 70 μL の 50 mg/mL リゾチーム溶液をペレットに加え、37 °C で 30 分間インキュベートします。
2. 100 mg/mL RNase Aを4 μLを15秒間加え、室温で5分間放置します。20 μLのプロテイナーゼK溶液を加え、よく混ぜます。
3. 220 μLの緩衝液GBを加え、ペレットが懸濁するまで15秒間振とうし、70°Cで10分間放置して溶液を透明にし、短時間遠心してチューブ壁の水ビーズを取り除きます。
4. 220 μLの無水エタノールを加え、15秒間完全に衝撃を与え、短時間分離します。溶液と凝集沈殿物を収集管の吸着カラムCB3に移し、13,400 x g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 500 μL のバッファー GD を吸着カラムに加え、13,400 x g で 30 秒間遠心分離し、上清を捨てます。600 μL の PW をカラムに加え、13,400 x g で 30 秒間遠心分離し、上清を捨てます。
6. 吸着カラムを回収チューブに戻し、13,400 x gで2分間遠心分離し、上清を捨てます。
7. 吸着カラムを室温で10分間置き、乾燥させます。カラムを遠心分離チューブに移し、100 μLの溶出バッファーTEを吸着膜の中央に加えます。
8. 室温で5分間放置して遠心チューブに流れを回収し、13,400 x gで2分間遠心分離します。
9. 25 μL の 2x マスターミックス ( 材料表を参照)、ステップ 8.8 で得られた DNA サンプル2.5 μL、2 μL の 27F フォワードプライマー、2 μL の 1492R リバースプライマー、18.5 μL の二重蒸留 H₂O を 0.1 mL PCR チューブに加えます。
   注:プライマーの遺伝子配列は、27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'および1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'です。
10. PCRチューブをPCRマシン( 材料表を参照)に以下の条件下で挿入します:95°Cで10分間の予備変性、95°Cで30秒間の変性、55°Cで30秒間のアニーリング、72°Cで90秒間の延長、72°Cで7分間の延長。変性、アニーリング、伸長の3ステップサイクルを32倍に実行します。
11. 5 μLの製品を取り出し、1%アガロースゲルを用いて120 Vで30分間電気泳動を行います。
    1. 500 mgのアガロースを50 mLの1x TAEバッファーに溶解します。アガロースが完全に溶解するまで、溶液を電子レンジで1〜2分間加熱します。DNA染色用色素5 μLを加え、ゲルトレイに注ぎ、オリフィスプレートを挿入します。固まるまで室温で30分間放置します。ゲルを電気泳動タンクに入れ、1x TAEバッファーを加えてゲルを浸します。2 μL の 2 kb DNA ラダー (10 mg/μL) を 2 μL を 1 つ目のウェルに加え、5 μL の PCR 産物を 1 μL のローディング色素と混合してゲルの残りのウェルに加えます。
12. ゲルをゲルイメージングシステムに入れ、写真を撮ります。DNAストリップを紫外線下で素早く切断し、秤量します。
13. マイクロ遠心チューブにストリップを追加し、等量のPN溶液を追加します。ゲルが完全に溶解するまで、チューブを50°Cのウォーターバスに保管します。
14. 500 μL の平衡液体 BL を吸着カラム CA2 に加え、13,400 x g で 1 分間遠心分離し、上清を捨てます。
15. 溶解したゲル溶液を吸着カラムCA2に加え、室温で2分間置き、13,400 x g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。
16. 吸着カラムCA2にPW600μLを加え、13,400 x g で1分間遠心分離し、上清を捨てて1回繰り返します。
17. 吸着カラムCA2をコレクションチューブに入れ、13,400 x g で2分間遠心分離し、上清を捨てます。
18. 吸着カラムCA2を室温で10分間置いて完全に乾燥させた後、清潔な遠心分離管に入れます。
19. 室温で2分間懸濁した吸着フィルムに溶出バッファーEB50μLを加え、13,400 x g で2分間遠心分離してDNA溶液を回収します。
    注:上記の溶液または試薬は、精製キットに含まれています( 材料の表を参照)。
    1. 収集したDNA溶液を専門のシーケンシング会社( 資料表を参照)に送付し、シーケンシングを依頼してください。NCBIのGenBankデータベースにあるBlastによるシーケンシング結果を比較します。配列相同性に従って、異なる系統を選択し、MEGA-Xの最尤法によって系統樹を構築して、系統の種関係を決定します。

結果

この実験では、健康なブタの新鮮な糞便から48株の バチルス 菌が単離され、1001から1048までの番号が付けられました。そのうち15株は M. luteusに対して抗菌活性を持っていました。15株から、 表1に示すように、バシトラシンの力価を高速液体クロマトグラフィーで測定しました。その中で、 B. licheniformis No. 1026はバシトラシン価が456.35 ± 21.75 U/mLと最も高かったため、No. 1026をその後の実験に選択した。

TLCによる同定結果を図2Aに示します。1026株の発酵液とバシトラシン標準液の主点の位置は同じで、_Rf値は0.61であった。HPLC分析の場合、バシトラシンの標準曲線方程式はy = 50.287x - 250.55で、相関係数R² = 0.9968です(図2B)。発酵上清のピーク時間はバシトラシン標準試料(図 2C)と一致していたため、静菌物質はバシトラシンとして同定され、バシトラシンの力価は 456.35 ± 21.75 U/mL でした。

No.1026株のコロニーをLB培地で12時間培養した( 図3A参照)。コロニーは丸く透明で水滴の形をしており、完全な突起と端っこがありました。12時間から24時間の間に、細菌は成長の後期段階に入った。 図3Bに示すように、コロニーは梅状に広がり、中心が折りたたまれて形成され、徐々に色が濃くなり、乳白色になります。これは、 B. licheniformis¹⁶のコロニー形態の説明と一致しています。縁には透明な粘液が溜まっていました。グラム染色後、 図3Cに示すように、1026株を顕微鏡下で観察しました。細胞は紫色の棒状で、グラム陽性菌を示しています。

表2に示すように、No.1026株は嫌気性環境で増殖する可能性があります。この菌株は、V-P試験、クエン酸塩の利用、硝酸塩の還元、およびデンプン加水分解で陽性と判定されました。この株は、ほとんどの炭素源を分解して利用することができました。それはB.licheniformisと同じ生理学的および生化学的特性を持っていました。

株No.1026の16S rDNAフラグメントのサイズは約1400 bpでした(図4A)。GenBankのNo.1026株の塩基配列決定結果は、 B. licheniformis DSM 13の塩基配列決定結果と99.58%の類似性を示した。次に、 図4Bに示すように、系統樹が構築されました。 B. licheniformis DSM 13 の進化的枝長は 0.000 であり、 B. licheniformis であることを示しています。

1026番株の形態学的、生理学的、生化学的特性と16S rDNA遺伝子配列の相同性解析に基づき、1026番株は B. licheniformisと同定された。

図1:株の接種の概略図。 接種リングは、コロニーをピッキングし、抗菌活性アッセイ培地上にジグザグパターンでそれらをマークするために使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:静菌物質の同定 (A)薄層クロマトグラフィー。(B)バシトラシンのHPLC標準曲線。(C)HPLCクロマトグラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:菌株No.1026の形態学的特性とグラム染色。 (A)12時間および(B)24時間でのコロニー形態、(C)グラム染色。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:株番号1026の分子生物学的同定 (A)株番号1026 16S rDNAの遺伝子増幅。(B)株番号1026の系統樹。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

いいえ。	バシトラシン力価 (U/mL)	いいえ。	バシトラシン力価 (U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215円37±11銭73銭
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

表1:抗菌活性株のバシトラシン力価。

項目	業績	項目	業績
嫌気性成長試験	+	D-マンニトール試験	+
V.Pアッセイ	+	ゼラチン試験	+
クエン酸利用試験	+	7%NaCl試験	+
プロピオン酸試験	+	pH5.7試験	+
D-キシロース試験	+	硝酸塩還元試験	+
L-アラビノース	+	デンプン加水分解試験	+

表2:株番号1026の生理学的および生化学的同定。

ディスカッション

B. licheniformisは、単純な培養条件と速い砂糖の消費で急速に成長し、成熟した発酵技術は工業生産コストを節約するのに役立ちます¹³。B. licheniformisとその分泌物であるバシトラシンの広範な適用は、その有望な市場価値を決定しました。農業では、B. licheniformisは、土壌の肥沃度を高め、根の発達を促進し、有機物の分解を助けることにより、植物の成長と栄養素の取り込みを改善するためのバイオ肥料として採用されています¹⁵。工業用酵素生産のために、B. licheniformisは、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼなどのさまざまな酵素を生産し、食品加工、洗剤製造、皮革加工、繊維産業におけるかけがえのない市場価値を決定します¹⁶。B. licheniformisおよびバシトラシンの優れた抗菌薬理活性に鑑み、細菌および真菌1によって引き起こされる様々な感染症の治療に医療分野で使用され^てきた。一方、ハーブ植物の成長と植物への薬理学的に活性な成分の蓄積を考慮すると、B. licheniformisは植物の成長を促進する可能性があるだけでなく、ロディオラ由来のサリドロシドなどの化合物の生産にも有用です^17,18。B. licheniformisとバシトラシンの上記の利点により、産業、農業、水産養殖、バイオテクノロジー、医療業界で広く有用になります。したがって、バシトラシンの高収率によるB. licheniformisの分離と精製は、その後の大規模な生産と適用を確実にするための決定的な要因です。

バシトラシンは化学合成によって調製できますが、そのステップは面倒で、多くの副産物があります。産業界では、バシトラシンは主にトウモロコシ粉と B.licheniformisによって発酵された大豆ミールの二次代謝プロセスによって生成されます。バシトラシンの現代の工業生産では、高コストと低収率がそのさらなる適用を妨げています¹⁰。したがって、高収量のバシトラシン株をスクリーニングし、原材料の利用率を向上させることが、バシトラシンの生産を改善するための鍵となります。

現在、高収量バシトラシン株の育種は、土壌などからの自然育種、既存のバシトラシン産生株を用いた突然変異育種、遺伝子工学に基づく育種が中心となっています。自然育種操作は簡単で、スクリーニングされた株は安定した生産能力を持っていますが、プロセスに時間がかかり、作業負荷が大きくなります。突然変異育種は突然変異率が高く、繁殖期間が短縮されるが、その突然変異がその後の世代で安定的に受け継がれるわけではない¹⁶。遺伝子工学に基づく育種は、高収量系統¹⁰を得るためにより対象とされているが、外来性遺伝子の導入によって引き起こされる安全性の懸念がある。健康な成体動物の糞便には、植物相のバランスを保つことができるプロバイオティクス資源が豊富に含まれています。

本論文では、極限環境下で休眠胞子を産生する B. licheniformis の特性¹⁹に基づき、健康なブタの糞便希釈液を高温環境下に置いて、耐熱性のない非胞子産生細菌や真菌を死滅させた。 M. luteus は、成長後期に B. licheniformis による静菌ペプチドの産生に感受性があり、観察しやすいように黄色の色素を生成するため、阻害ゾーン評価に基づく抗菌活性のスクリーニングに用いられます。 B. licheniformisの形態と類似したコロニー形態によれば、細胞形態は短い棒状で、グラム陽性、生理学的および生化学的特性である B. licheniformis、16 s RNAは B. licheniformisと密接に関連しており、1026番の株が B. licheniformisであると決定します。静菌性物質は、TLCおよびHPLCによってバシトラシンとして同定されました。これにより、バシトラシン産生 性B. licheniformisが 得られた。また、スクリーニングに時間がかかる、操作にある程度の経験が必要となるなどの欠点もあります。

要約すると、この実験プロトコルは、バシトラシン産生 B.licheniformisの取得と日常的な実験室同定プロセスを包括的かつ詳細に紹介しました。これは、幅広いアプリケーションの見通しと計り知れない市場価値^{を持っています20}。これらの方法は、シンプルで実現可能であり、実装が容易であり、間違いなく B. licheniformisの大規模生産の効果的な参考となるでしょう。この論文は、他の抗菌ペプチドの菌株の作製に関するスクリーニングのアイデアも提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2 ×Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing,China	P252-01
2kb DNAマーカー	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China	BM121-01
アセトニトリル	上海アラジン生化学技術有限公司, 上海, 中国	A104443
寒天粉末	上海マックリン生化学技術有限公司, 上海, 中国	A800730
アガロース	上海アラジン生化学技術有限公司、上海、中国	A104062
硫酸アンモニウム((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.、上海、中国	10002917
クレーブ滅菌器	Zealway Instrument Inc.、厦門、中国	GI36DWS
バチルス生化学的同定ストリップ	青島海博バイオテクノロジー株式会社、青島、中国	HBIG14
バシトラシン	上海Yuanyeバイオテクノロジー株式会社、上海、中国	B65740
細菌DNA抽出キット	Tiangen Biochemical Technology Co.、Ltd.、北京、中国	DP209
通気性シーリングフィルム	北京Leiborunバイオテクノロジー株式会社。	BS-QM-01A
ブタノール	上海アラジン生化学技術有限公司、上海、中国	B433378
C18(5 & MU;メートル、4.6 ×250 mm) HPLCカラム	日照Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
炭酸カルシウム (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
クロマトグラフィータンク	南京Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
Conical bottle	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
恒温インキュベーター	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
リン酸二カリウム (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	上海アラジン生化学技術有限公司、上海、中国	E397526
電子天秤	メトラー・トレド・インターナショナル株式会社	FA2104
エチルアルコール	上海アラジン生化学技術有限公司、上海、中国	E130059
ゲルミディ精製キット	Tiangen Biochemical Technology Co.、Ltd.、北京、中国	DP302
ガラス棒	成都Yibang Kexi Instrument Co.、Ltd.	1294
糖	上海マックリン生化学技術Co.、株式会社、上海、中国	D823520
グラムの染色液キット	青島海博バイオテクノロジー株式会社、青島、中国	HB8278
高性能液体クロマトグラフ	Agilent Technologies、Inc.、カリフォルニア、アメリカ	1260
水平電気泳動装置	北京Liuyiバイオテクノロジー株式会社、北京、中国	DYCP-31DN BIOMATE
接種リング	上海ムーチェンバイオテクノロジー株式会社、上海、中国	3171026
マグネチックスター	ラーWiggens GmbH Co.、Ltd.、ドイツ	WH220 PLUS
メチルアルコール	上海アラジン生化学技術有限公司、上海、中国	M116115
微量遠心チューブ	上海ムーチェンバイオテクノロジー株式会社、上海、中国	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection、蘇州、中国	BNCC102589
微多孔質フィルター膜	南通スリ実験装置有限公司	PES0.22
Ninhydrin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	N105629
光学顕微鏡	光学機器工場, 上海, 中国	DYS-108
豚の糞	南京Quanfu Pig Farm, 南京, 中国
ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) アンプ	蘇州 Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd.,蘇州、中国	ETC811
プロフェッショナルシーケンシング会社	General Biology (Anhui) Co., Ltd., 安徽省, 中国
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, China	HYL-C
Silica gel GF254 薄層プレート	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Yantai, China	HPT-HSGF5025023
塩化ナトリウム (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Ltd., Shanghai, China	S805275
Sodium Citrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	C39197100001
可溶性デンプン	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S817547
サーモスタットの水浴槽	上海Heheng器械装置Co.、株式会社、上海、中国	DK-8D
トリプトン	上海アラジンの生化学技術Co.、株式会社、上海、中国	T139519
Ultra GelRed	南京VazymeのバイオテクノロジーCo.、株式会社、南京、	中国GR501-01
超純粋な水器械	Merck KGaA Co.、株式会社、ドイツ	MilliDirect-Q8
超音波清浄	江蘇Huaguan電器グループCo.、株式会社、江蘇省、中国	SB-100DT
のノギス	三風株式会社、日本	N20P
酵母エキス粉末	Vicbioバイオテクノロジー株式会社、北京、中国	LP0021