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方法論記事

ウォートンゼリー間葉系幹細胞とその由来エクソソーム/小さな細胞外小胞の単離

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DOI：

10.3791/66778

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2025年11月11日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

この記事について

サマリー

臍帯組織は、間葉系幹細胞 (MSC) の豊富で容易に入手できる非侵襲的な供給源です。このプロトコルでは、ヒトウォートンゼリーMSC(WJ-MSC)の単離および特性評価のための詳細な手順が提供され、続いて、それらの由来エクソソームまたは小さな細胞外小胞を単離するための簡単な短いプロトコルが提供される。

要約

再生医療の分野では、間葉系幹細胞(MSC)が特に注目を集めています。ウォートンゼリーと呼ばれる臍帯 (UC) 組織由来の MSC は、さまざまな用途で特に確立されています。他のMSC供給源と比較して、ウォートンのゼリーMSC(WJ-MSC)は多くの利点があり、通常は医療廃棄物として処分されるUCから分離されています。したがって、WJ-MSCは、胚性幹細胞に関連するものと同様の倫理的問題を引き起こしません。単純で再現性のある外植片技術を使用して、UC 組織から WJ-MSC を単離しました。単離から5〜10日以内に、WJ-MSCは線維芽細胞形状の接着細胞として出現します。単離後、細胞は14〜18日で約80%のコンフルエントに達します。その後、継代3で、単離されたWJ-MSCは、脂肪形成、骨形成、および軟骨形成間葉系に沿って分化するように誘導することによって完全に特徴付けられました。さらに、CD34、CD14、HLA-DRなどの陰性分化クラスター(CD)表面マーカー、およびCD105、CD90、CD73、CD44などの特徴的なMSC表面マーカーの免疫表現型検査がテストされました。さらに、沈殿試薬は、これらのWJ-MSCのコンディショニング培地からエクソソーム/小さな細胞外小胞(sEV)を単離するための簡単なアプローチで使用されました。単離後、透過型電子顕微鏡でエクソソーム/sEVを観察し、粒度分析を用いて平均サイズを計算しました。要約すると、WJ-MSC は、エクソソーム/sEV を生産するための工場として使用できる幹細胞の、すぐに入手できる非侵襲的で再生可能な供給を提供します。これらのWJ-MSCおよびその由来エクソソーム/sEVは、幅広い治療および下流の研究アプリケーションに使用できます。

概要

ほんの数年前まで、幹細胞は医学の主導権を握ると考えられていました 1,2。しかし、胚性幹細胞 (ESC) によってもたらされる倫理的懸念は、この分野での急速な進歩を妨げる大きな障害でした3。これにより、幹細胞、特に出生後に臍帯(UC)から分離できる幹細胞の代替再生可能資源の探索に対する多くの関心が高まりました4。UCは、妊娠中の母親の体内の胎盤と胎児に自然に結合します。UC の生来の役割は、血管を介した継続的かつ十分な血液供給で成長中の胎児に栄養を与え、胎児の運動中に起こり得るねじれ、圧迫、またはよじれを回避することにより、これらの血管を確実に保護することです5。解剖学的には、ヒトUCは、ムコイド結合組織内に埋め込まれ、羊膜上皮の外層内に囲まれている2つの動脈と静脈で構成されています6。UC マトリックス、または 3 つの臍帯血管を囲むムコイド結合組織は、「ウォートンゼリー」(WJ) として知られており、主にプロテオグリカンとコラーゲン7 でできています。

最近、間葉系幹細胞(MSC)は、幅広い再生医療アプリケーションのための効果的な新しい治療法として多くの注目を集めています7,8,9,10,11,12。MSCで最も興味深いのは、単離の容易さ、および実証された免疫調節活性と多能性です13,14,15。一般的にMSCの他の優れた利点、特にWJに由来するものは、ESCとは異なり、移植時に奇形腫が現れないこと、および数回の細胞継代後でもそれらの幹性特性を維持するという事実である16,17。したがって、MSCは実際にさまざまな疾患に革命的な治療介入を提供できると考えられています8,18,19。2006年に、国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)がMSCの適切な特性評価のための特定の最小基準を定義したことを指摘することが重要です20。まず、標準的な培養条件で成長/培養した場合、MSCはプラスチック付着性であると考えられています。第二に、MSCは、CD90、CD105、CD73などの特徴的な分化クラスター(CD)表面マーカーを発現し、CD14、CD34、CD45などの他のマーカーの発現を示してはなりません。第三に、MSCはin vitroで骨形成、脂肪形成、および軟骨形成系統に分化する必要があります20。今日に至るまで、MSCは、骨髄(BM)、脂肪組織21などの成体組織や、胎盤、UC血液(UCB)、UCマトリックス22,23などの胎児/周産期の供給源を含む複数の供給源から分離されています。ここで注目すべきは、MSCの採取の成功率を比較すると、UCB24,25から約6%にすぎないのに対し、WJ組織からほぼ100%に達すると報告されていることです。したがって、UCBは確かに造血幹細胞の豊富な供給源ですが、MSCの優れた供給源とも考えられていますが、WJ26、27、28よりも大幅に低くなります。

WJ-MSCは、正真正銘の(典型的な)MSCであるにもかかわらず、成体のMSCと同様の特性を持ちながら、さまざまな多能性/ ESCマーカーの発現も持っているため、他のタイプのMSCと比較した場合に例外的です17,29。したがって、WJ-MSCは成体幹細胞と胚性幹細胞の中間のどこかにあると考えられている17。興味深いことに、WJ-MSCはヒトMSCとESCの両方のマーカーを発現することがわかっており、いくつかの継代にわたってステム性を維持することができます16。幸いなことに、移植時に奇形腫を形成しません 17.これは、ESCおよび他のMSCと比較して、それらのユニークなトランスクリプトームプロファイルによって解明することができる29,30。WJ-MSCは、成体MSCよりも、さらには一般的に他の種類の幹細胞よりもさまざまな利点があります。彼らの隔離手段は、出生時に日常的に廃棄されるUCを介して容易に利用できるため、医療廃棄物と見なされます。したがって、ESCとは異なり、WJ-MSCには倫理的な懸念がなく、BM-MSCとは異なり、侵襲的技術を介して分離されます31。さらに、他のMSCタイプと同様に、WJ-MSCはヒト白血球抗原D関連(HLA-DR)の発現を欠いており、特にヒト白血球抗原G(HLA-G)を発現することがわかっており、これはそれらに余分な免疫特権を提供する32。これは、WJ-MSCが、in vivoで胎児と母体の界面で通常発生することをシミュレートする免疫抑制的役割を示すことを示唆しています33,34,35。最後に、UCBから分離された類似体と同様に、WJ-MSCはバンキング36に大きな可能性を秘めています。これらすべての利点を考慮すると、WJ-MSCはMSCベースの治療の新しいゴールデンスタンダードであると提唱されています30。

興味深いことに、多くの研究により、MSC は主にパラクリンシグナル伝達を介して治療効果を示すことが明らかになりました。多くの場合、このような効果は、MSCによって分泌されるエクソソーム/小さな細胞外小胞(sEV)に応答して発生することが報告されています37。エクソソーム/sEVは、細胞の内膜系から獲得されるナノサイズの生理活性小胞として知られています。それらは、タンパク質、mRNA、ならびにマイクロRNAや長いノンコーディングRNA(LncRNA)などのノンコーディングRNAの特定の貨物をボトル内のメッセージとして移送するシャトルとして機能する38。その結果、それらはレシピエント細胞を再プログラムすることができ、本質的な細胞機能を操作する「シグナルソーム」として示されます39。MSC 由来のエクソソーム/sEV は、無細胞の代替手段である可能性があるという点で、MSC 療法に対する優位性を実証しています。親MSCと同様に、エクソソーム/ sEVは、いくつかの疾患で治療効果と細胞再生を誘発することがわかっています。ただし、親細胞とは異なり、生物学的障壁をより簡単に通過できます。さらに、重大な安全上の懸念はありません。それらは、免疫拒絶反応や長期的な腫瘍形成のリスクを与えません40。さらに、エクソソーム/sEVは、遺伝情報を伝達するために自然に装備されているドラッグデリバリーシステムの手段として遺伝子治療アプリケーションに採用することができ41。したがって、エクソソーム/ sEVは確かに、さまざまな疾患の新しい治療介入のためのエキサイティングな新しい道に火をつけました42,43,44。

このプロトコルでは、UC組織からのWJ-MSCの単離および特性評価のための徹底的な段階的な外植片ベースのプロトコルが提示されます。これに続いて、これらの WJ-MSC の条件付け培地からエクソソーム/sEV を単離するための簡潔なプロトコルが続きます。

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プロトコル

すべての実験と手順は、承認されたガイドラインに従って実施され、エジプトのカイロにあるアインシャムス大学薬学部 (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) とエジプトのカイロにあるエジプトの英国大学薬学部 (CL-2309) の両方によって承認されました。UC は、親から署名されたインフォームドコンセントを得た後に取得されました。

1. ヒト臍帯からのWJ-MSCの単離

  1. 分娩直後に臍帯(UC)(長さ約15cm)を採取するための容器(密閉収集袋)に約30〜40mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れます。採取したUCを氷上に維持し、採取から最大4〜5時間以内に処理します。
    注:サンプルは、MSC収量を大幅に低下させるため、4〜5時間後に処理することはできません。PBSと容器が滅菌されていることを確認してください。
  2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、および0.25 μg/mLアムホテリシンBを補完した低グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(LG-DMEM)で構成されるWJ-MSC用の完全な培地を調製します。
  3. ウェルあたり3 mLの完全培地を6ウェルプレートに入れ、培地を含む6ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2に設定したCO2インキュベーターに入れて温めて準備します。
  4. バイオセーフティキャビネットに、10 cmの細胞培養皿を8個用意し、それぞれに10 mLの滅菌PBSを充填します。
  5. 滅菌鉗子を使用して、慎重に、密封されたビニール袋から PBS を含む最初のペトリ皿に UC を移し、血液を洗い流します (すべての血液がサンプルから洗い流されるまで、この手順を繰り返します)。
  6. 滅菌綿棒に70%エタノールをスプレーし、それを使用してUCを30秒間拭きます。
  7. UCを滅菌PBSで満たされた新しいペトリ皿に移し、残留エタノールを除去します。
  8. UCを滅菌PBSで事前に満たされた別のペトリ皿に移し、滅菌ハサミを使用して、UCを小さな断片(それぞれ約3 cm)に切ります。次に、長さ3cmの破片を新鮮な滅菌PBSを入れた別のペトリ皿に移し、切断プロセス中に血液が放出されないようにします。
    注: この時点から、UC ピースは氷上に維持され、その後のすべての処理ステップも維持する必要があります。これは、ゼラチン状物質の放出を回避し、UC組織からのWJ-MSCの単離手順を確実に成功させるために非常に重要です。収集したUCを最大4〜5時間以内に処理することは、分離プロセスの成功にとって非常に重要です。以前は、UC は収集後より長い期間で処理されていましたが、残念ながら、手順は成功した結果を示しませんでした (データは示されていません)。
  9. 滅菌PBSで満たされたペトリ皿でUC片を1つずつ(氷上で)処理を開始します。滅菌ハサミと鉗子を使用して血管を切り取り、ウォートンゼリー(WJ)組織を分離します。次に、透明なWJ片を、氷上の滅菌PBSで満たされた別のペトリ皿に入れます。
    注:UCピースからWJ組織を分離する際、最初の切開は、血管を切断しないように、血管から離れたUCピースの透明な側で行われます。その後、血管を挟み、切り回し、引き離します。
  10. すべてのUCピースで前のステップを繰り返して、血管のない透明なWJ組織を取得します。
    注:WJ組織の単離中にPBS溶液が血まみれまたは不明瞭になった場合は、必要に応じて、UC片の処理および血管の除去中にPBSペトリ皿を交換します。
  11. 収集したWJ片を滅菌PBSで満たされた新鮮な10 cm細胞培養皿に移してPBSで洗浄します。
  12. 滅菌された鋭利なメスと鉗子を使用して、収集したWJ組織を長さ10mmの小さな断片に切断します。
  13. WJ片を、ステップ1.3で事前に調製した6ウェルプレートに移します。ウェルあたり5〜6個のWJ片を配置し、次にWJ組織外植片を含む6ウェルプレートを、CO2インキュベーターで37°Cの5%CO2を含む加湿雰囲気中でインキュベートし、3日間邪魔せずに放置します。
  14. WJ組織外植片を配置してから4日目 に、外植片を乱さないように注意しながら、ウェルあたり1mLの培地を慎重に添加します。
    注意: WJピースが取り付けられているプレートの底に触れたり引っ掻いたりしないでください。
  15. WJ組織外植片を配置してから6日目 に前のステップを繰り返します。
  16. WJ組織外植片を配置してから8日目 (つまり、外植片配置のほぼ1週間後)に、外植片配置後12〜14日目 まで、1日おきにウェルあたり培地の半分を交換し始めます。各ウェルから約2.5 mLを除去し、新鮮な2.5 mLの完全な温培地(37°C)を加えて、各ウェルから培地の半分を交換します。
    メモ: ウェルの表面から培地を引き出し、WJピースが取り付けられているプレートの底に触れたり引っ掻いたりしないようにしてください。WJ-MSCは通常、外植片を配置してから5〜10日以内にWJ組織外植片の下および周囲に現れます。
  17. 倒立顕微鏡(10倍倍率)で6ウェルプレートを日常的に観察し、放出された細胞が増殖し、それらのコンフルエンスが増加し、50〜60%に達している場合は、次のステップに進みます。そうでない場合は、手順 1.16 を繰り返します。又。WJの作品は時間の経過とともにサイズが大幅に縮小します。
  18. ウェルの底に取り付けられたWJ外植片をそっと取り外し、すべての培地を取り除きます。WJ外植片の除去は、通常、最初に配置してから12〜14日目に行われます。
    メモ:メディアを取り外すときは、プレートを45°の角度でわずかに傾けて、すべてのメディアが確実に取り除かれるようにします。
  19. 各ウェルを2 mLのPBSで洗浄し、プレートを穏やかに回転させてから、PBSを廃棄します。この洗浄手順を2回繰り返します。
    注:PBSをウェルの壁にそっと添加し、ウェルの底に触れないようにして、細胞の乱れがまったくないようにします。
  20. ウェルあたり2 mLの温かい完全培地(ステップ1.2で説明したとおりの正確な組成の培地)を穏やかに加え、6ウェルプレートを37°Cで5%CO2 の加湿条件下でインキュベートします。
  21. 細胞が約80%のコンフルエントに達するまで、1日おきに培地を完全に交換します(ウェルあたり2 mLの完全培地)。
  22. 細胞が約80%のコンフルエントに達したら、トリプシン-EDTAを使用して細胞をT25細胞培養フラスコに継代します(1つの6ウェルプレートから得られた全細胞を1つのT25培養フラスコに継代することができ、T25フラスコあたり8〜9 mLの完全培地を使用します)。これらのWJ-MSCはP1細胞として表されます。
    注:毒性作用を避けるために、トリプシン-EDTAで細胞を長時間放置しないでください。通常、細胞の剥離には3分で十分です。さまざまなサプライヤーが、さまざまな効力を持つトリプシン-EDTAを提供できます。したがって、インキュベーション時間を指定する際には、これを考慮する必要があります。
  23. メディアは一日おきに交換してください。細胞が約80%のコンフルエントに達したら、トリプシン-EDTAを使用して細胞をT75細胞培養フラスコに継代します(1つのT25培養フラスコから得られた全細胞は、1つのT75培養フラスコに継代できます。これらのWJ-MSCはP2細胞として表されます。
  24. メディアは一日おきに交換してください。細胞が約80%のコンフルエントに達したら、トリプシン-EDTAを使用して細胞を分離し、T75フラスコあたり約0.75 x 106-1 x 106 細胞の密度でWJ-MSCを播種します。これらのWJ-MSCはP3細胞として表されます。
    注:このプロトコルで説明されている将来の実験のために、P3-P5の間の細胞を使用します。
  25. 80%FBS、10%完全培地(ステップ1.2で説明)、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)で構成される凍結保存培地を使用して、単離されたWJ-MSCを液体窒素中で凍結保存します。
    注:WJ-MSCs単離の全ステップの概略図を 図1に示します。

2. 各種CD表面マーカーのフローサイトメトリー分析を用いた免疫表現型解析による単離WJ-MSCの特性評価

  1. 継代4でトリプシン-EDTAを使用して細胞を剥離します。細胞をPBSで2回洗浄し、血球計算盤を使用して細胞数を数えます。
    注:トリプシン処理中の最小インキュベーション時間(3分間)は、損傷を与えることなく細胞を正常に剥離するために重要です。トリプシン-EDTAとの長時間のインキュベーションは、細胞表面マーカーに損傷を与え、免疫表現型検査アッセイの結果に悪影響を与える可能性があります。
  2. 約100,000個の細胞(暗所条件)を、フィコエリトリン(PE)またはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)のいずれかで標識したヒトモノクローナル抗体を4°Cで20分間インキュベートします:抗CD90 PE、抗CD73 PE、抗CD105 FITC、抗CD44 PE、抗CD34 PE、抗CD14 PE、および抗HLA-DR FITC、および抗HLA-DR FITC、および未染色細胞をコントロールとして使用し、未染色細胞をコントロールとして使用します
  3. 細胞をPBSですすぎ、その後500 μLのFACSバッファーに再懸濁します。フローサイトメトリー45を用いて解析する。

3. さまざまな間葉系系統に対する単離された WJ-MSC の分化の可能性の評価

  1. 脂肪生成の分化
    1. 細胞を完全増殖培地に再懸濁します(ステップ1.2で説明)。その後、24ウェルの組織培養プレートで3.7 x 104 細胞/ウェル(0.5 mL培地/ウェル)の密度で細胞を培養します。次に、37°Cで5%CO2 の加湿条件下でインキュベートします。 次に、次に、1日おきに、セルがほぼ100%のコンフルエントに達するまで培地を交換します。これには通常約3〜4日かかります。
    2. 増殖培地を取り除き、脂肪生成分化培地と交換して脂肪生成を誘導します。LG-DMEM培地を、100 μg/mLのストレプトマイシン、100 U/mLのペニシリン、0.25 μg/mLのアムホテリシンB、および間葉系幹細胞機能同定キットに付属の脂肪生成サプリメントで補完します。その後、培地を3日ごとに穏やかに(0.5 mL /ウェル)交換し、脂質液胞の破壊を避けます。
    3. 約21日後、顕微鏡検査を使用して、脂質液胞をオイルレッドで染色し、脂肪生成の分化を評価します。
    4. オイルレッドの新鮮なストック溶液を準備します。30 mgのオイルレッド染色剤を10 mLのイソプロパノールに溶解し、室温で少なくとも30分間休ませます。次に、2部の二重蒸留水(ddH2O)と3部の原液を混合し、よく混合し、室温で10分間休ませて作業溶液を調製します。その後、0.22 または 0.45 μm のフィルターを使用してろ過します。
      注:最良の染色結果を得るには、オイルレッドステインを新しく準備してください。
    5. 脂肪生成分化の記録を成功させるには、細胞をPBSで2回洗浄し、中性緩衝10%ホルマリン(0.75 mL/ウェル)で15分間固定します。その後、1 mL/ウェルを使用してPBSで細胞を2回洗浄します(各洗浄後にPBSを廃棄する前に、細胞を約5分間インキュベートします)。
      注:増殖培地(ステップ1.2で説明)に維持された細胞は、対照の非誘導細胞として使用されます。細胞の損傷を避けるために、中性緩衝ホルマリンを細胞に直接ではなく、壁にゆっくりと添加します。PBSによる最終洗浄後、非効率的な染色を避けるために、オイルレッド染色作業溶液を添加する前にPBSを完全に吸引することが重要です。
    6. 最終洗浄後、細胞(1 mL/ウェル)をオイルレッドワーキング溶液で染色し、37°Cで60分間インキュベートします。 次に、染色液を抜いて廃棄し、細胞をPBSで2回優しくすすぎます。次に、顕微鏡下で、染色された脂質滴を観察します。
  2. 骨形成の分化
    1. 細胞を完全増殖培地に再懸濁します(ステップ1.2で説明)。その後、24ウェル組織培養プレートで、7.4 x103 細胞/ウェルを播種し(0.5 mL培地/ウェルを添加)、湿度の高い条件下で37°Cで5%CO2 、37°Cでインキュベートし、ほぼ70%のコンフルエントに達します。
    2. 約70%のコンフルエントで、増殖培地を、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、および0.25 μg/mLアムホテリシンBとともに、10%FBSで補完されたLG-DMEM培地に骨形成サプリメントを組み込んだ分化誘導培地に置き換えます。
    3. 3日に1回分化培地を交換し、約21日間骨形成誘導を継続します。
    4. アリザリンレッドS染色の作業溶液を調製します。9 mLのddH2Oを持参し、200 mgのアリザリンレッドS染色剤を溶かし、次に水酸化アンモニウムとHClを使用してpHを4.1〜4.3に調整します。次に、ddH2Oで容量を10 mLまで完成させます。その後、フィルター(0.22または0.45 μm)を使用して溶液をろ過し、沈殿物を除去します。
    5. 誘導期間の終わりに、細胞をPBSで2回すすぎ、中性緩衝10%ホルマリン(0.75 mL /ウェル)を使用して固定し、15分間休ませます。その後、PBS(1 mL /ウェル)を使用して細胞を2回すすぎ、すすぎごとに細胞を5分間インキュベートするようにします。
      注:増殖培地(ステップ1.2で説明)に維持された細胞は、対照の非誘導細胞として使用されます。
    6. ステップ3.2.4で調製した2%アリザリン-レッドS作業溶液を、前のステップの固定細胞に加え、室温で約45〜60分間暗所でインキュベートします。
    7. 続いて、染色液を廃棄し、細胞をddH2Oで2回、次にPBSで1回すすぎ、染色されたカルシウムに富む細胞外マトリックスを観察することにより、顕微鏡下で骨形成の成功を評価します。
  3. 軟骨形成分化
    1. 細胞を完全増殖培地に再懸濁します(ステップ1.2で説明)。その後、24ウェル組織培養プレートで、7.4 x 103 細胞/ウェルを播種し(0.5 mLの培地/ウェルを追加)、これらを5%CO2 、37°Cの湿度条件下で3日間インキュベートし、ほぼ90%のコンフルエントに達します。
    2. 約90%のコンフルエントで、インスリントランスフェリンセレン(ITS)を添加した無血清DMEM / F12、および間葉系幹細胞機能同定キットに付属の軟骨形成サプリメントを、0.25 μg/mLのアムホテリシンB、100 U / mLペニシリン、2 mM L-グルタミン、および100 μg/mLのストレプトマイシン46とともに使用して、軟骨形成分化の誘導を開始します。
      注:完全な軟骨形成分化誘導培地は、2〜8°Cで暗所に保管されます。
    3. 軟骨形成分化誘導を約21日間継続します。その間、メディアは3日ごとに交換してください。
    4. アルシアンブルー染色液を次のように調製します。まず、ddH2Oで3%氷酢酸を調製します(3 mLの氷酢酸を加え、ddH2Oで最大100 mLまで充填します)。次に、20 mgを20 mLの3%氷酸溶液に加え、約30分間放置し、その後、0.22 μmまたは0.45 μmのフィルターを使用してろ過して沈殿物を除去することにより、アルシアンブルー染色作業溶液を調製します。
    5. 誘導期間の終わりに、細胞をPBSで2回すすぎ、10%中性緩衝ホルマリン(0.75 mL /ウェル)を使用して固定し、15分間休ませます。その後、PBS(1 mL/ウェル)を使用して細胞を2回洗浄します。毎回細胞を5分間インキュベートするようにしてください。
      注:増殖培地に維持された細胞(ステップ1.2で説明したとおり)は、対照の非誘導細胞として使用されます。
    6. 固定細胞を0.1%アルシアンブルー調製作業溶液中で37°Cで約60分間インキュベートします。 細胞をddH2Oで2回、PBSで1回すすぎ、残留染色を除去します。次に、顕微鏡検査を使用して、染色された硫酸化プロテオグリカンを観察します。

4. WJ-MSCsコンディショニング培地からのエクソソーム/sEVの単離

  1. WJ-MSCを完全増殖培地に再懸濁し(ステップ1.2で説明)、これらのWJ-MSCを150,000細胞/ウェル(2 mL培地/ウェル)の密度で6ウェル組織培養プレートに播種し、5%CO2の湿度条件下で37°Cでインキュベートします。
  2. 無血清(SF)エキソソーム収集培地を次のように調製します:2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および0.25 μg/mLアムホテリシンBを添加した低グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(LG-DMEM)。
    注:エクソソーム収集培地は、完全増殖培地(ステップ1.2で説明)と同じ組成を持っていますが、FBSはありません。
  3. 6ウェルプレート(ステップ4.1で調製)に従い、増殖培地を使用して1日おきに培地を交換します(ステップ1.2で説明)。細胞が約75〜80%のコンフルエンスに達するまで顕微鏡で細胞を観察します。
  4. 70%のコンフルエントに達したら、PBS(1 mL /ウェル)で細胞を2回洗浄し、無血清(SF)エキソソーム収集培地(1.5 mL /ウェル)(ステップ4.2で説明)を加え、5%CO2の湿気の多い条件下で37°Cで48時間インキュベートします。
  5. 48時間後、前のステップで15 mL遠心分離収集チューブに入れた6ウェル組織培養プレートからWJ-MSCsコンディショニング培地を収集します。次に、以下の連続した遠心分離およびろ過ステップを実行して、収集されたコンディショニング培地47を除去する。
    注:トリパンブルー排除色素を使用し、続いて血球計算盤を使用して細胞をカウントし、収集されたコンディショニング培地を導き出すために最初に使用された細胞の生存率を評価します。生存細胞は理想的には90%以上である必要があります。その後、収集した細胞ペレットを-80°Cで保存し、将来の調査に必要になります。
    1. 収集したコンディショニング培地を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、浮遊細胞を取り除きます。次に、上清を回収し、この回収した上清(コンディショニング培地)の次の遠心分離ステップを実行します。
    2. ステップ4.5.1から得られたコンディショニング培地を3000 x g で4°Cで15分間遠心分離し、壊死細胞と細胞破片を取り除きます。
      注:遠心分離ステップは4°Cで行うことが好ましいが、室温でも同様の結果が得られる。
    3. 前のステップで得られた上清を0.22 μmフィルターに通して新しいコレクション50 mLポリプロピレンチューブに通し、残留細胞破片や大きなEVを取り除きます。
      注:ろ過されたコンディショニング培地は、エクソソーム/sEVを単離するための後続のステップにすぐに使用したり、4°Cで冷蔵庫に保存して3日以内に使用したり、エクソソーム/sEVを単離する必要があるまで-80°Cで長期保存したりできます。-80°Cで保存された透明化されたコンディショニング培地は、最大1〜3か月以内に処理されることが好ましい。早ければ早いほど良いです。
  6. 7.5 mLの透明化コンディショニング培地(ステップ4.5から得られた)を15 mLの遠心分離管に入れ、1.5 mLの試薬を加えます。試薬を培地に1:5の比率で添加します(つまり、培地5 mLごとに1 mLのExoquick-TC沈殿試薬)。その後、チューブを上下に反転させ、数回フリックして、沈殿試薬と培地が適切に混合されるようにします。
    注:沈殿試薬は重くて粘性のある試薬です。したがって、必要な量はゆっくりと慎重に引き出し、目的の量が完全に転送されるようにする必要があります。
  7. 沈殿試薬を含む培地を含むチューブを4°Cで直立した状態で約16時間(少なくとも12時間)一晩保存します。
  8. 翌日、培地/沈殿試薬混合物を1500 x g で4°Cで30分間遠心分離します。 遠心分離後、エクソソーム/sEVペレットは、チューブの底に沈殿した非常に小さな白またはベージュのペレットとして現れます。
    注:この遠心分離ステップは、室温でも同様の結果で行うことができます。この遠心分離ステップの終了時にエクソソーム/sEVペレットが見えない場合は、4°Cでさらに20〜30分間、3000 x g でさらに遠心分離時間を追加できます。遠心分離時間が長くなった後でもエクソソーム/EVペレットが見えないままになることがありますが、これは少量のエクソソーム/sEVが存在することを意味します。この場合、チューブの下部5〜10 μLを残してプロトコルを続行します。
  9. 上清を吸引し、残留培地/沈殿試薬混合物を1500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 次に、沈殿したエクソソーム/ sEVペレットを乱すことなく、非常に慎重に残りの微量の液体を吸引します。
  10. ペレットのサイズと視認性に応じて、エクソソーム/ sEVペレットを100〜300 μLの滅菌PBSに懸濁します。その後、これらのエクソソーム/sEVは、すぐに利用するか、その後の実験のために-80°Cの超冷凍庫に保管することができます。
    注:同じ培地(ステップ4.9で説明)に対して複数の遠心分離管から開始し、エクソソーム/ sEVペレット(ステップ4.10で得られた)が見えない場合、それらすべてから収集されたエクソソーム/ sEVペレットは、約100〜300 μLの滅菌PBSを使用してプールされ、それらすべてが一緒にプールされた懸濁液。
  11. メーカーが記載しているように、市販のビシンコニン酸(BCA)タンパク質定量キットを使用して、収集したエクソソーム/sEVをタンパク質含有量と比較して定量します。
    注:WJ-MSC由来エクソソーム/sEVのすべての単離ステップの概略図を 図2に示します。

5. 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いた単離エクソソーム/sEVのイメージング

  1. ペレットサイズと可視性に応じて、新たに単離されたエキソソーム/ sEVを100〜300 μLの滅菌PBSに懸濁します(ステップ4.11で前述したように)。
    注:TEMイメージングには、凍結エクソソーム/ sEVではなく、新たに単離されたエクソソームを使用することがはるかに好ましい
  2. 20 μLのエクソソーム/sEV懸濁液をカーボンコーティングされたグリッドにピペットで移動させ、10分間乾燥させます。
  3. 配置したエクソソーム/sEVをグルタルアルデヒド溶液(蒸留水中2%)を用いて約15分間固定します。
  4. その後、固定エクソソーム/sEVを2%酢酸ウラニルで染色し、暗所で約3分間放置した後、デフォルトのTEM設定を使用して透過型電子顕微鏡(TEM)(倍率20000)で調べます。

6. 粒度分析装置を用いた単離エクソソーム/sEVの平均サイズの決定

  1. 新たに単離されたエクソソーム/sEVを滅菌PBS pH 7.4で1:250の比率で希釈します。
  2. 単離されたエクソソーム/sEVの平均粒度分布を、粒度分析装置を25°Cで測定します。

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結果

WJ-MSCの単離と特性評価

図3に示されているように、小さな線維芽細胞様細胞は、これらの外植片を播種してから5〜10日以内に、WJ外植片組織の下および周囲に最初に現れました(図3A)。これらの放出されたWJ-MSCは増殖を続け、通常、分離後14〜18日以内に約80%のコンフルエントに達します。ここで注目に値するのは、外植片組織が培養中もサイズが縮小し続け、単離日に6ウェルプレートに最初に播種してからほぼ12〜14日後に除去されることです。これらのWJ外植片組織を除去する場合、図3Bに示すように、WJ-MSCは通常、除去された外植片の下に高密度で存在し、P0として示されます。...

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ディスカッション

このプロトコルでは、ヒトUC組織からWJ-MSCを単離し、その由来エクソソーム/ sEVを単離するための詳細な手順を提示することができました。UCは、MSCを取得するための容易に入手可能な未開発の非侵襲的供給源であり、収集または処理のための特別な機器は必要ありません11,15,30,32,48。UC 組織から WJ-MSC を単離するために、さまざまなプロトコルが利用されています。基本的に、このプロトコルとは異なり、組織外植片32,48、および化学酵素消化49が、単離

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開示事項

すべての共著者は、この研究に関連する利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、エジプトのアインシャムス大学 - 戦略計画研究支援助成金 (2024/2025) と、エジプトのカイロにあるエジプトの英国大学 (BUE) のナノテクノロジー研究センター (NTRC) - アクセス賞 (2019/2020) によって部分的に資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルシアンブルー8GXシグマ・オルドリッチ、アメリカA3157
アリザリン レッド Sシグマ・オルドリッチ、アメリカA5533
水酸化アンモニウムフィッシャー・サイエンティフィック、ドイツ1336-21-6
ヒト用CD-105抗体、FITCR&D systems Inc.、ミネソタ州、アメリカ合衆国FAB10971F
ヒトCD-14に対する抗体、PE抗体ベックマン・カウルター、アメリカ合衆国IM0650U
ヒトCD-34、PE(PE)に対する抗体ベックマン・カウルター、アメリカ合衆国IM1420
ヒトCD-44、PEに対する抗体ベックマン・カウルター、アメリカ合衆国A32537
ヒトの抗体CD-73、PER&D systems Inc.、ミネソタ州、アメリカ合衆国FAB5795P
ヒトCD-90抗体、PER&D systems Inc.、ミネソタ州、アメリカ合衆国FAB2067P
ヒトの抗体 HLA-DR、FITCベックマン・カウルター、アメリカ合衆国IM1638U
ビシンコニン酸(BCA)タンパク質定量キットサーモフィッシャー23227
バイオセーフティキャビネット、層流、MSCアドバンテージサーモ・サイエンティフィック、アメリカ
CO2インキュベーター、ダイレクトフォーマサーモ・サイエンティフィック、アメリカ
冷却遠心分離機シグマ、ドイツ
冷却遠心分離機エッペンドルフ、ドイツ
CytoFLEXフローサイトメーター アメリカ合衆国フロリダ州ベックマン・コールター
ジメチルスルホキシド(DMSO)フィッシャー・サイエンティフィック、ドイツBP231-100
DMEM - 低血糖 1 g/Lロンザ、スイス12-707F
DMEM/F12 ロンザ、スイス12-719F
DNAase/RNAseフリー水ギブコ・サーモフィッシャー、アメリカ10977-035
エタノール絶対量、分子生物学グレードシグマ・アルドリッヒ、ドイツ24103
エクソクイック-TCシステム・バイオサイエンス(SBI)、アメリカEXOTC50A-1沈殿剤
胎児用牛血清(FBS)ギブコ・サーモフィッシャー、ブラジル10270-106
ホルムアルデヒド 37%フィッシャー・サイエンティフィックBP531-500
氷河酢酸シグマ・アルドリッヒ、ドイツA38S-500
グルターアルデヒド溶液 シグマG7776
塩酸(HCl)フィッシャー・サイエンティフィック、ドイツA144-212
逆立顕微鏡オリンパス、日本
L-グルタミンギブコ・サーモフィッシャー、アメリカ25030-024
間葉幹細胞機能識別キット R&D systems Inc.、ミネソタ州、アメリカ合衆国SC006
マイクロプレートリーダークロメート、Awareness Technologies、アメリカ
オイルレッドステインシグマ・オルドリッチ、アメリカO0625
ペニシリン-ストレプトマイシン-アンフォテリシンギブコ・サーモフィッシャー、アメリカ15240062
リン酸塩緩衝生理食塩水を1回、Ca/Mgなしロンザ、スイスBE17-516F
揺らす水浴韓国、ダイハン・ワイズバス
シリンジフィルター、0.2ミクロンコーニング、アメリカ合衆国431224
透過式電子顕微鏡JEM-1200EX II、全(ドイツ)
トリパンブルー ギブコ・サーモフィッシャー、アメリカ15250061
トリプシン-ベルセン-EDTA、1回ロンザ、スイスCC-5012
ウラニル酢酸塩溶液(2%)電子マイクロソピサイエンス、アメリカ22400-2
UV可視光度計島津、日本
渦動サイロゲックス
ゼータサイズャーナノZNマルバーン・パナリティカル社(イギリス) 粒子サイズアナライザー

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