方法論記事

炭素含有粒子状物質に曝露された気道マクロファージの炭素含有量の測定

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DOI:

10.3791/66781

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2024年7月12日

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1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、個々の粒子状物質曝露レベルでの内部被ばく線量を評価することを目的として、気道マクロファージの炭素含有量を測定するための詳細な実験プロトコルについて説明します。

要約

肺マクロファージは、食作用粒子において用量依存的なパターンを示します。飲み込んだ後、これらのマクロファージは喀痰とともに排泄され、マクロファージと粒子を光学顕微鏡で可視化し、定量化することができます。特に、哺乳類の体内の元素炭素は、もっぱら外部の汚染物質に由来します。その結果、気道マクロファージ(CCAM)の炭素含有量は、炭素含有粒子状物質(PM)への個々の曝露を正確に推定する有効な曝露バイオマーカーとして機能します。この記事では、喀痰の収集、保存、処理、スライド調製、染色、およびマクロファージの写真取得と分析を含むプロトコルについて説明します。マクロファージ核を抜去した後、炭素粒子が占める細胞質面積の割合(PCOC)を計算し、各マクロファージの炭素含有量を定量化しました。結果は、炭素含有PMへの曝露後のCCAMレベルの上昇を示しています。要約すると、この非侵襲的で、正確で、信頼性が高く、標準化された方法により、標的細胞内の炭素粒子の直接測定が可能になり、誘導された喀痰による個々のCCAMの大規模な定量に利用されます。

概要

周囲の大気汚染は、呼吸器疾患や心血管疾患による死亡と関連しており、人間の健康に深刻な脅威をもたらしています1,2。疫学データによると、直径2.5μm以下の大気粒子状物質(PM2.5)への慢性的な曝露は、世界中で400万人から900万人の早期死亡の原因となっています。PM2.5は、2015年のGlobal Burden of Disease, Injuries, and Risk Factors Study(GBD)3,4,5,6において、世界の死亡の5番目に重要な危険因子としてランク付けされました。研究によると、WHOの大気汚染ガイドラインを順守することで、PM2.5曝露による年間51,213人の死亡を防ぐことができることがわかっています3。現在、ほとんどの研究は個人内被ばくの評価を欠いており、個々のばく露レベルから遠く離れた、より大きな地域のモニタリングサイトでの大まかな評価のみに基づいています。尿中PAHsやベンゾ(a)ピレンなど、内部被ばくの利用可能なバイオマーカーは、粒子状物質被ばくと健康影響との関連を反映していない7,8,9。これにより、健康への影響と正確な関係を確立できなくなります。したがって、個人の粒子状物質曝露レベルを反映するマーカーの検索は、個人の正確な曝露評価の鍵の1つです。

気管支に吸入された粒子は、気管支の毛様体振動を通じて痰とともに排泄される可能性があります。肺胞に繊毛粘液流輸送系がないということは、肺胞に入る粒子の主要なクリアランス経路が、食作用とマクロファージによる転座であることを意味します10,11。肺の解剖学的構造に基づいて、不溶性粒子異物の除去は遅いです。これにより、粒子状物質が長期間にわたって肺細胞と相互作用し、さまざまな生物学的影響を引き起こし、肺組織や他の臓器に損傷を与えることができます12,13。粒子状物質による刺激はマクロファージの活性化につながり、肺内の炎症性因子のカスケードを引き起こし、全身性炎症反応を引き起こす可能性があります14。マクロファージのサイトカインストームの誘発におけるマクロファージの細胞性の重要な役割を考慮すると、肺マクロファージからの炭素粒子粒子は、空気中の炭素核粒子曝露の生物学的に有効な線量を反映している可能性があると理論化されている15。さらに、哺乳類の細胞には元素状の炭素の凝集がなく、炭素を含む粒子を光学顕微鏡で黒色粒子状物質として観察できることから、肺胞および気管支のマクロファージの収集およびそれらの中の炭素含有量の測定は、粒子状物質曝露を評価するためのマーカーとして役立つことができる16。

この研究では、気道マクロファージの炭素含有量(CCAM)として知られる、個々の粒子状物質曝露レベルを正確に評価する方法が特定されました。具体的には、参加者が超音波ネブライザーによって生成された高張生理食塩水を吸入した後、集団喀痰サンプルが収集されました。次に、これらのサンプルを固定液を使用して保存しました。気道マクロファージを単離、染色、光学顕微鏡で撮影して、炭素含有粒子を含むマクロファージを同定し、それを定量しました。この方法は、個々の粒子状物質の曝露レベルを正確に評価するための生物学的マーカーを提供します。これは、粒子状物質への曝露と健康への影響との関係を調査するための方法論的基盤を確立し、PM曝露と肺疾患などの健康転帰との関連を調査するための研究基盤として機能します。

プロトコル

この研究は、中国疾病管理予防センター(NIOHP201604)の労働衛生毒物管理研究所の医療倫理委員会から承認を受け、研究および生物学的サンプルの収集に先立って、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを取得しました。この研究では、カーボンブラック工場で1年以上働いており、カーボンブラックエアロゾルにさらされたカーボンブラックパッカーが選択されました。有害な要因への重大な職業的曝露がない水道工場の水道労働者は、研究を確立するための対照集団として地元から募集されました。研究集団には、以下の包含基準と除外基準が選択されました:カーボンブラックパッカーの選択基準には、ほとんどのシフトでカーボンブラックと直接接触することと、カーボンブラック曝露エリアでの最低1年間の作業が含まれていました。水道労働者は、作業環境でカーボンブラックやその他の汚染物質に職業的にさらされていない場合に含まれていました。除外基準には、がんなどの慢性疾患を持つ労働者、過去3か月間にX線被曝を受けた人、肺結核、肺手術、ウイルス性心筋炎、先天性心疾患、最近の発熱、または炎症の病歴のある人、および最近抗生物質を服用した労働者が含まれていました。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1.喀痰の保存

  1. 以下の手順に従って、固定液を調製します。
    1. 2%ポリエチレングリコール(PEG1500)を水浴で溶かします。溶かしたPEG1500 20mLを遠心チューブに入れます。遠心分離管に50%エタノール20mLを加え、よく振とうして母液を作ります。
    2. 母液40mLを50%エタノール960mLに徐々に注ぎます。溶液をよく振って、サッコマンノ固定溶液を形成します。溶液は冷暗所に保管してください。
  2. 調製した固定液20〜30mLを、約2mLの喀痰が入った遠心チューブに加えます。中身をよく混ぜます。
    注意: 総容量が40mLを超えないようにしてください。
  3. 遠心分離管をシールフィルムで密封します。冷暗所に保管してください。準備ができたら、チューブを実験室に運び、さらに処理します。
    注意: 常にPEG1500を水浴で溶かし、処方された投与量に従って使用してください。

2. 喀痰中の細胞懸濁液の調製

  1. 実際の投与量に従って、0.1 gのジチオスレイトールを生理食塩水100 mLに溶解して消化液を調製します。.調製した溶液を4°Cで最大48時間保存します。
  2. 喀痰を含むチューブを1,998 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
  3. 上清を捨てます。沈殿物に等量の喀痰消化物を加えます。渦巻き、混合物をよく振とうします。
    1. チューブを37°Cのウォーターバスに完全に液化するまで(10〜15分)置きます。
      注意: 液化プロセス中はチューブを連続的に振ってください。
  4. 液化混合物を70μmのフィルターメンブレンでろ過します。
  5. ろ過した溶液を500 x g で7分間、4°Cで遠心分離します。
  6. 上清を捨て、細胞沈殿物を保持します。
  7. 細胞沈殿物をデュシェンヌ型リン酸緩衝液に再懸濁します。再懸濁した溶液を500 x g で4°Cで7分間遠心分離し、純粋な細胞沈殿物を得ます。

3. 細胞塗抹標本の調製

  1. 200〜600μLのリン酸緩衝液を細胞沈殿物に加えます。内容物を完全に混ぜます。細胞のカウント結果に基づいてバッファー量を調整します(>1.0×105 細胞を目指します)。
  2. 細胞懸濁液20μLを採取し、ヘマトクリット法17を用いて細胞塗抹標本を作製する。
  3. 塗抹標本を自然乾燥させます(48時間以内)。塗抹標本を市販の染色液で10秒間固定します。
  4. 塗抹標本を染色液に8秒間浸します。染色中は、スライドをゆっくりと上下に持ち上げ、流水で余分な汚れを洗い流してください。
  5. 塗抹標本をB染色液で8秒間染色します。染色中はスライドを持ち上げ、流水で余分な汚れを洗い流してください。
    注:染色液AおよびBは、市販の染色キットに含まれています。
  6. スライドを無水エタノールに2回、毎回2〜3秒間浸します。
  7. 乾いたら、適量の中性ガムを塗ります。スライドをカバースリップで密封します。

4. CCAMの定量分析

  1. 100倍オイルレンズ対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用します。ランダムに選択され、よく染色され、形態学的に無傷のマクロファージの画像をキャプチャします。各サンプルについて50枚のマクロファージ写真をランダムに撮影します。
  2. Image Jソフトウェアで以下の手順に従って画像解析を実行します。
    1. スケールを測定し、実際の長さとピクセル間変換 (282 ピクセル = 10 μm) を決定します。画像Jでスケールを設定し(分析>スケールの設定)、 距離 (ピクセル単位)、 実際の長さ、長さの単位(μm)、 およびティックグローバル。
    2. 不規則な形状を使用してセルの輪郭を描きます。背景を削除します(フリーハンド選択、編集、 >外側をクリア)。セルの総面積を測定します (分析>測定)。
    3. 原子核を切り取ります(編集>切り取り)。グレースケール画像を白黒に変換します(Image > Type > 8ビット)。
    4. 各細胞染色に固有のグレースケール値を調整して、炭素粒子を正確にカウントします(画像> >しきい値の調整 > 適用、分析、>>測定)。
    5. 測定面積とImage Jソフトウェアでの画像解析に基づいて、サンプルあたり50個のマクロファージの炭素含有量を計算します。

結果

固定液で保存および処理された喀痰は、形態学的検査中に光学顕微鏡下で無傷のマクロファージ形態を示しました。マクロファージは、透明、円形、または腎臓の形をした、染色しやすい細胞核を示しました。染色後、細胞核は青紫色に見え、細胞質は淡いピンク色または水色でした。顕微鏡的な磁場は最小限の不純物を示し、細胞の同定を容易にしました。細胞内では、黒色炭素粒子が小さな凝集体ではっきりと見え、炭素粒子の定量分析を可能にしました。

喀痰マクロファージの代表的な画像を図1に示し、さまざまな細胞内のさまざまな数の炭素粒子を示しています。たとえば、図1Aは炭素粒子を示していませんが、図1Dは最も高い濃度を示しています。CCAMの値は、マクロファージ(A-D)でそれぞれ0.00%、2.24%、6.64%、34.61%と測定されました。CCAMパラメータ決定プロセスでは、マクロファージサイズの変動や炭素粒子と細胞核との重なりから生じるバイアスを軽減するために、各マクロファージの炭素含有量の定量的評価が行われました。CCAMの計算と解析は、図2に示すように、研究対象者あたり50のマクロファージに対して行われました。

この研究では、特定のアセチレンカーボンブラック工場のカーボンブラックパッカー(CBP)を曝露群として選択し、有害な要因への明らかな職業的曝露がなかった地元の水プラントのウォーターポンプ労働者を対照群(非CBP)として募集しました。 図 2 に示す結果は、対照群と比較して、カーボンブラック包装労働者の CCAM が高いことを示しています。

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図1:気道マクロファージ内の炭素粒子を示す光学顕微鏡画像。細胞質の黒い色は炭素粒子を表します。パネル(A-D)は、気道マクロファージの代表的な画像を示しており、それぞれが異なるレベルのCCAMを示します。マクロファージ(A-D)のCCAM値は、それぞれ0.00%、2.24%、6.64%、34.61%であった。最も高いCCAMレベルは(D)で観察されました。スケールバー:10μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:母集団におけるCCAMの量的レベル。 細胞質的に無傷で十分に染色されたマクロファージ 50 種類を、研究対象ごとに分析および定量するために無作為に選択しました。データは、スチューデントの t検定を使用して分析されました:* P < 0.05。CBP:カーボンブラックパッカー。非CBP:対照群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究では、誘導された喀痰由来のCCAMを大気中の粒子状物質への内部曝露の生物学的マーカーとして使用するための詳細な実験プロトコルを提示します。CCAMは光学顕微鏡で検出および定量化でき、健康への影響との関係を反映する正確な内部曝露バイオマーカーとして機能します。したがって、便利で信頼性が高く、効率的な誘導喀痰保存方法とCCAM定量法を確立し、最適化して方法論的手順を標準化する必要があります。

肺マクロファージの炭素含有量の測定には、肺マクロファージの収集、塗抹、染色、写真撮影、画像分析など、いくつかのステップが含まれます。現在、肺マクロファージを収集するための2つの方法がある:誘発された喀痰と肺洗浄、それぞれに独自の利点と制限がある18,19。肺洗浄は多くの均質な肺マクロファージを生成することができますが、麻酔やその他の病状を必要とする外傷性のサンプリング方法です。したがって、大規模な一般集団のサンプリングには適していません。対照的に、誘発された喀痰は実行が容易で、非侵襲的であり、一般集団の大規模なサンプリングに適しています。また、繰り返しサンプルを取得することもできます。肺洗浄は肺胞または遠位細気管支からマクロファージを取得しますが、誘発された喀痰は気道に由来する可能性のあるマクロファージを取得します。この研究では、欧州呼吸器学会20 によって発行された標準プロトコルに従って、誘発された喀痰を実施しました。

誘発された痰の成功率は、噴霧された吸入生理食塩水の濃度や患者21,22,23の呼吸器疾患の存在など、さまざまな要因の影響を受けます。喀痰サンプルはまた、唾液を含んでもよく、これはマクロファージの炭素含有量の測定を妨害し、サンプル24中の気道マクロファージの数を潜在的に減少させる可能性がある。この研究の運用手順は標準化されており、方法は単純で、再現性は高かった。噴霧された吸入流量のサイズ、誘導時間の妥当性、誘導中のインターバルの存在などの要因が、誘発された喀痰の成功率に影響を与えることが観察されました。これらの考慮事項は、粒子状物質曝露のバイオマーカーとしてのCCAMの正確で信頼性の高い測定を確保するために重要です。

50%エタノールと2%ポリエチレングリコールからなるサッコマンノ固定液は、通常、気管支肺胞洗浄液などの生体サンプルを保存するための固定剤として使用されます。この研究では、疫学フィールド調査から得られた喀痰を保存するために、この固定液を初めて利用しました。その結果は、マクロファージ中の炭素のその後の定量化を満たしており、これは、朝に喀痰細胞を保存して明確な癌細胞塗抹標本を得るのと同様のものである25。操作手順が標準化され、方法が単純で、再現性が高かった。本研究における喀痰保存の誘導効果は、(1)固定液の構成が容易であること、(2)保存のための冷蔵が不要で大規模な疫学調査に便利であること、(3)試料を光から離れた涼しい場所で保存できること、などが挙げられます。染色後の顕微鏡下での鮮明な視界、識別可能な核、最小限の不純物、および完全な細胞形態。これは、形態学の点で、直接の喀痰処理および塗抹適用よりも優れています26。

実験方法に関しては、次の詳細が注目されました:喀痰は、完全に液化するまで37°Cの水浴中で消化中に定期的に振とうされました。液化後、遠心分離の前に70 μmのメンブレンでろ過を行い、不純物を除去してバックグラウンドをより明確にしました。細胞沈殿物を再びDPBSで洗浄してから、スライドに塗抹しました。余分な液体は、スライドを流水で洗浄することにより、染色中に除去されました。スライドホルダーは、残留を防ぐためにステインIとステインIIの間で交換されました。写真撮影のために、完全な形態と良好な染色を有するマクロファージを無作為に選択し、CCAMの定量に影響を与えた27。

この研究の定量分析ソフトウェアオプションには、Image SXM と Image J28 があります。Image SXMでは、精度を高めるために解析前に手動で画像編集を行う必要があるため、必要な時間が大幅に長くなります。また、単一細胞タイプの処理に限定されます。対照的に、この研究で使用したImage Jソフトウェアは、画像処理の特異性が高く、互換性が広くなっています。他の分野では、蛍光標識細胞の選択とその後の解析にハイコンテントスクリーニング顕微鏡法が採用され、自動化されたハイスループット操作が達成されています。方法論的研究の将来の方向性は、喀痰中のマクロファージの自動標識とスクリーニング手順の開発を含むかもしれない29。Image Jの処理中、CCAM測定に影響を与える要因には、サンプル情報に関する測定者の知識とグレースケール値のしきい値の決定が含まれます。ブラインドアプローチを採用すると、観察者のバイアスを減らすことができ、再現性を評価するために一部のサンプルを繰り返し測定する必要がある場合があります。高度な専門知識を持つ2人による独立した画像キャプチャと解析により、マクロファージの同定精度を高めることができます。

この研究では、国立労働安全衛生研究所 (NIOSH) の標準的な方法を使用して、被験者の職業粒子状物質への曝露を評価しました。カーボンブラックの包装エリアと対照群の水道プラント労働者の作業エリアにおける微小粒子状物質(PM2.5)レベルとPM2.5関連元素炭素(EC)含有量について、複数の評価が実施されました。カーボンブラック(CB)粒子の最大99.6%は空力直径が2.5μm未満で、96.7%は1.0μm未満でした。2012年の秋には、CB包装施設の平均PM2.5レベルは1立方メートルあたり800マイクログラムであり、PM2.5関連のECレベルは1立方メートルあたり657.0マイクログラムでした30,31。2018年秋のCBの幾何平均は637.4μg/m3、PM2.5関連のECレベルは364.6μg/m3でした。どちらの観測結果でも、EC/TC比は92.5%を超えており、CBがほぼ純粋なECであることと一致しています。したがって、この研究から、マクロファージ中の炭素粒子は、主にカーボンブラック30,31への曝露に由来すると推測できる。その結果、本研究でカーボンブラックに曝露した集団の労働環境中のPM2.5濃度は637.4μg/m3であり、対照集団の労働環境中のPM2.5濃度(130.0μg/m3)よりも有意に高く、対照集団の約5倍であった。カーボンブラックに曝露された集団の元素炭素レベルは364.6μg/m3であり、対照集団の2.0μg/m3よりもはるかに高かった。

要約すると、この研究では、高張生理食塩水誘発性喀痰を利用してサンプルを収集し、肺マクロファージを取得し、細胞塗抹標本を作成し、50マクロファージ内の炭素含有量を定量化しました。この研究方法論は、大規模な集団サンプルに適応させ、粒子状物質への個人の内部曝露レベルを正確に評価するために使用できます。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(82273669年、82241086年、42207488年)、山東省の泰山奨学生プログラム(No.tsqn202211121)、および山東省の高等教育の優れた青年奨学生のためのイノベーションとテクノロジープログラム(2022KJ295)によって財政的に支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3 mL滅菌ストローShanghai YEASEN Biotechnology Co., Ltd84202ES03
50 mL 遠心分離管Thermo Fisher Scientific, USA339652
Absolute ethyl alcoholSinopharm Group Chemical Reagent Co. Ltd64-17-5
Cedar oilShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC805296
Diff-quick stainingsolutionShanghai YEASEN Biotechnology Co., Ltd40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LtdD8220
デュシェンヌ型リン酸緩衝液 (DPBS)Thermo Fisher Scientific, USA14190144
顕微鏡カメラ日本オリンパス株式会社DP72
中性樹木ガムSolebo Bio Co., LtdG8590
ナイロンフィルターメンブレン 70umBD Falcon Bioscience, USA211755
光学顕微鏡オリンパス株式会社BX60
ポリエチレングリコールSinopharm Group Chemical Reagent Co. Ltd.25322-68-3
超遠心機Thermo Fisher Scientific, USASL40R
Viscous slide江蘇省 SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. Ltd.
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