静電容量式バイオセンサを用いた動的マルチパラメータ血小板機能評価

Summary

ここでは、静電容量式バイオセンサーを用いた新しい動的マルチパラメータ血小板機能アッセイのプロトコールを紹介します。このアプローチは、生理学的関連性を高めるために半硬質の微小環境内で設計されており、血小板数、刺激強度、および活性化経路に敏感な3つの出力パラメータを提供します。

Abstract

血小板は、接着、拡散、顆粒分泌、凝集、細胞骨格収縮などの一連の調節応答を通じて、血液凝固に基本的な役割を果たします。しかし、現在のアッセイは、非生理学的条件下での血小板機能の部分的な分析に限定されています。したがって、生理学的環境における血小板機能の動的で多面的な性質を反映した改良されたアッセイが必要です。これに関連して、従来のアッセイと比較して、より生理学的に関連性のあるex vivo半硬性微小環境で血小板機能に関連するいくつかの重要なパラメーターを測定するための新しいアプローチが導入されています。この方法では、高度な電気バイオセンサーである膜静電容量センサー(MCS)を利用し、3つの異なる読み出しを通じて凝固プロセスに関する独自の洞察を提供します。これらの測定値は、血小板数、刺激強度、および特定の活性化経路の変動に非常に敏感です。純粋な電気センシングプラットフォームとして、MCSは、一次止血機能障害を検出し、治療効果を評価し、止血と血栓症における血小板の役割についての幅広い理解を進めるための診断ツールとして大きな可能性を示しています。

Introduction

特殊な血液細胞である血小板は、損傷後の出血を止めるための止血反応を調整し、血管の治癒を促進する上で極めて重要です¹。さらに、それらはまた、血栓塞栓症の世界的な死亡の主な原因である血栓症の重要なメディエーターとして機能します2,3,4,5,6。血管損傷が発生すると、血小板は一連の複雑で制御された多段階の機能プロセスを経ます。これらには、内膜マトリックスへの接着、細胞内カルシウムの流入が血小板のコンフォメーション変化を引き起こすこと、活性化、顆粒分泌、凝集、および細胞骨格の収縮が含まれ、最終的には止血栓を形成して安定化し、損傷部位を密閉し、出血を防ぎます^7,8。抗血小板薬と治療戦略^9,10,11の著....

Protocol

この研究提案は、ワシントン大学内部審査委員会(UW-IRB;スタディID:STUDY00005211)。研究に参加したすべてのボランティア被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. メンブレン静電容量センサー(MCS)の作製手順

注:MCSセンサーは、従来の微細加工技術を利用して製造されました。このバイオセンサーは、上部(T-)と下部(B-)の膜静電容量チップ(MCC)で構成されていました。簡単に説明すると、製造手順を 図1に示します。

1. T-MCCの微細加工ステップ(図1A)
   1. T-MCCのレイアウト設計は、4インチシリコンウェーハ基板の標準CADレイアウトソフトウェアで行います。
   2. 標準的なマスク製造プロセス^29,30を使用して、デザインをクロムガラスフォトマスクに転写します。
   3. ....

Results

この研究は、血小板機能の動的評価を行うことを目的としています。上記のプロトコルに従って、c-PRP溶液を調製し、血小板をT-MCCのFn被覆電極に播種した。フリーフローティング血小板を洗浄ステップで洗い流し、付着した血小板を活性化するためにアゴニストを添加しました。詳細な結果と議論は、前回のレポート²⁸で見つけることができます。

図4Aは、あらかじめ決められた血小板数(250 x 10³血小板^μL-1)のc-PRP溶液の結果を示しています。測定の接着フェーズ(図4B)では、静電容量は時間とともに直線的に減少しました。付着した血小板をトロンビンで活性化した後(最終濃度:3.5 U ^mL-1)、静電容量の読み取り値は指数関数的に減少して定常状態になりました(図4C)。データ解析のための上記のプロト.......

Discussion

この研究は、単一のデバイス内での接着と活性化後の血小板動態の両方を評価する、血小板機能を評価するための新しい静電容量ベースの方法を開拓し、そのようなアプローチの最初の報告された例を示しています。この新しい実験プロトコルは、ウォッシュアウト手順を通じてフィブリン形成と血漿凝固因子の影響を打ち消す比較的簡単な技術を導入しています。これにより、血小板機能に影響を与えるさまざまな要因を識別できる測定が可能になります。従来の光学ベースの評価アッセイと比較して、この静電容量センサーは、接着と凝集の側面を統合することにより、血小板機能のより動的な評価を提供することが期待されています。重要なのは、多様な血小板機能障害を独自のモードで検出する能力を示し、既存の評価方法とは一線を画していることです。

提案されたセンサーシステムは、微細加工技術、標準化された試験プロトコル、および包括的なデータ分析を採用することにより、血小板機能の動的マルチパラメータ評価を可能にし、高い精度、信頼性、および安定性を確保します。ランダムに選択されたセンサー.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ドデカンチオール	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof ethanol	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3Dプリンター	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3Dプリンティング材料	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
アデノシン 5′-二リン酸	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP Aspirin
	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	A2093-100G
深部反応性イオンエッチング	Omega Engineering, Inc.	SPTSレイピアDRIE
ジメチルスルホキシ	Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国	D8418-50ML	DMSO
高真空蒸着システム	CHA	SEC-600
ヒト フィブロネクチン	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P1767-250G
LCR meter	Keithley Instruments, Inc., OH, U.S.A	Keithley EL 4980AL
LCRメーター・ホルダー	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCA-50-4
Mask Aligner System	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
マイクロポジショナー	Signatone, CA, U.S.A	S-725
ニードルプローブ	Signatone Corporation, CA, U.S.A	SCAT5T-4	12.5 μm 半径
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
反応性イオンエッチング	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
silicon substrate	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubes	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode's buffer	Boston Bioproducts, U.S.A.	BSS-375
UV photoresist	AZ electronic materials, NC, U.S.A.	AZ 9260	15umの