このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

嚢胞性線維症に関連する多微生物バイオフィルムの増殖によるコミュニティ表現型の調査

1.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/66785

⸱

2024年4月19日

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

この記事について

サマリー

このプロトコルは、細菌の種間相互作用の影響を調査するために使用できる嚢胞性線維症(CF)肺関連の4種の多微生物バイオフィルムモデルについて説明しています。

要約

ほとんどの in vitro モデルは、実際の環境で観察された複雑な相互作用から生じる細菌の表現型を完全に調査する能力を欠いています。これは、多臓器遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)を患っている個人の気道で検出される、治療が困難な慢性の多微生物バイオフィルムベースの感染症の文脈で特に当てはまります。複数のマイクロバイオーム研究により、CF患者の気道で検出される微生物組成が定義されていますが(pwCF)、これまでのところ、重要なCF関連の肺の特徴を完全に統合した in vitro モデルはありませんでした。したがって、混合種CF肺感染症の病因を引き起こすメカニズムを調査する能力には、大きな知識のギャップが存在します。ここでは、最近開発された4種の微生物群集モデル( Pseudomonas aeruginosa、 黄色ブドウ球菌、Streptococcus sanguinis、およびCF様条件で増殖した Prevotella melaninogenica )について述べる。このシステムを利用することにより、いくつかの病原体の抗菌難性など、臨床的に関連性のある表現型が観察され、分子レベルで調査されました。この in vitro モデルの有用性は、慢性CF肺感染症の状況における種間相互作用の研究を容易にする標準化されたワークフローにあります。

概要

多臓器遺伝性疾患である嚢胞性線維症(CF)気道で検出されるような疾患の原因となる微生物を根絶することを目的とした戦略は、しばしば失敗します1。つまり、粘液が豊富なCF肺環境で増殖する弾力性のあるバイオフィルム様微生物群集の存在は、数十年にわたる慢性感染症を引き起こす可能性があります2。さらに、最前線の抗菌薬(Abx)とモジュレーターの利用により、CF患者(pwCF)の転帰が改善されましたが、緑膿菌や黄色ブドウ球菌などの標準的なCF病原体に対して通常採用される「1つのバグ、1つの感染」臨床アプローチは、これらの個人の肺で検出された治療が困難な感染症を解決するのに効果がありませんでした3,4。5、6、7。

過去20年間で、複数の研究が慢性CF肺疾患に対する私たちの理解を変えました8。つまり、pwCFの気道で検出される感染は、単一の病原体のみによって引き起こされるのではなく、本質的に多微生物性であることが報告されています8。さらに、混合種CF肺感染症の病因はまだよくわかっていませんが、臨床的証拠は、気道で 黄色ブドウ球菌 と 緑膿菌 の両方に同時感染したpwCFは、これら2つの病原体のいずれかにコロニーを形成した個人よりも肺機能を悪化させることを示しています9。

CF病原体間の種間相互作用は、CF治療薬の利用によって多微生物バイオフィルムベースの感染が容易に根絶されず、最終的に患者の転帰に影響を与える理由であると仮定されています3。これを裏付けるように、in vitro 研究では、緑膿菌、黄色ブドウ球菌などの微生物間の相互作用が、バンコマイシンやトブラマイシンなどの最前線の CF 薬に対する Abx 反応性などの臨床的に関連する表現型に影響を与える可能性があることが示されています 6,10,11。したがって、混合種感染の文脈でCF病原体を根絶することを目的とした現在の治療戦略を再検討することは、まだ達成されていません。

微生物ベースのCF肺感染症の管理におけるゴールドスタンダードは、臨床介入を導くための抗菌薬感受性試験(AST)の利用に大きく依存しています12。しかし、ASTは通常、豊富でよく混合された培養物で培養された細菌の単一培養を使用して行われ、これはCF気道3,13で検出された微生物の増殖条件を反映していません。患者の転帰と治療の成功との間に大きな隔たりがあることから、臨床報告では現在、CF肺の重要な特徴を統合した新しいアプローチの開発が提唱されています12,14。

2つ以上の病原体を含むCF関連の細菌多種in vitroシステムを開発した研究はほとんどありません15,16。しかし、これらのモデルは、(1)CF肺の多微生物およびバイオフィルムのような性質を完全に反映しているわけではなく、(2)CF気道15,16で検出されたものに近似する栄養および環境条件を使用していない。Jean-Pierreらは最近、CF肺由来の大規模な16S rRNA遺伝子データセットのマイニングと計算を通じて、上記の特徴を統合したin vitro共培養モデルを開発した10。このシステムには、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌属、およびプレボテラ属が含まれ、CF気道のような状態で成長し、最大14日間安定しています。また、著者らは、Prevotella spp.の地域特異的な増殖と、これらのCF病原体のAbx応答性におけるいくつかの変化が、まだ同定されていないメカニズムを通じて報告された10。この扱いやすいin vitroシステムは、pwCF10の気道で頻繁に検出される緑膿菌の一般的な変異体のAbx難治性に関連する機構に焦点を当てた問題を掘り下げる可能性も提供しました。したがって、このプロトコルの目標は、CF関連の多くの問題に取り組むためにさらに拡大する可能性のあるin vitroバイオフィルムを成長させるための標準化された実験ワークフローをCF研究コミュニティに提供することです。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1.人工痰培地の調製

注:このプロトコル全体を通じて、人工喀痰培地(ASM)は、以前にTurnerら17によって発表されたSCFM2から修飾されたCF関連培地として定義されています。以下は、このメディアを準備する手順の説明です。ストックソリューションと保管条件については、 材料の表 を参照してください。このバージョンのASMは、元のバージョンの緩衝能力が長期にわたって安定したpHを許容しないという点で、Turnerら17 とは異なります。すなわち、 Streptococcus spp.や Prevotella spp.のような嫌気性菌による発酵活性は、増殖培地の酸性化をもたらす(未発表の観察結果)。そのため、3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)の濃度を10 mMから100 mMに調整しました。

注:2x ASMベース(ASMb)ストック溶液を調製すると、ASM10,18に存在する分子の最終濃度に影響を与えることなく、ムチン、寒天、水などの成分の添加が容易になります。2x ASMbは事前に調製し、4°Cで最大2週間暗所に保存できます。媒体が黄色に変わった場合は、捨ててください。

  1. 2x ASMベースストックを調製するには、400 mLのdiH2Oが入った清潔なビーカーに、攪拌しながら以下を加えます。
    1. 0.2 M NaH2PO4 6.50 mL を添加します。H2Oストック;6.25 mLの0.2 M Na2HPO4 ストック。1 M KNO3 ストック348 μL;0.25 M K2SO4 ストック 1.084 mL。
    2. トリプトファンを含まない4.0gの酵母合成ドロップアウトを追加します。3.032gのNaCl;20.92gのMOPS;1.116 gのKClと0.124 gのNH4Cl。
    3. 9.30 mLの1 M L-乳酸ストックを添加します。2.70 mLの1.1 Mグルコースストック。1 M CaCl2.2H 2Oストック1.75 mL;0.25 M N-アセチルグルコサミンストック 1.20 mL と 3.6 mM FeSO4.7H 2O ストック 1.00 mL。
    4. 0.1 M トリプトファンストック 660 μL を添加します。606 μL の 1 M MgCl2.6H 2O ストック;ニシンの精子からのデオキシリボ核酸0.60g;250 mg/mL 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)ストック400 μL。
    5. すべての成分を添加したら、5 M NaOHストックでpHを6.80に調整します。diH2Oで500 mLまで完成させ、0.22 μmフィルターを使用して滅菌し、4°Cで保存します。
  2. 10 mg/mL(2x)ムチンストックを調製するには、250 mLのdiH2Oが入った清潔なガラス瓶を使用し、攪拌しながら以下の処理を行います。
    1. ブタの胃から5.0gのムチンを加えます - タイプII。懸濁液を10分間混合します。diH2Oで500 mLまで完全化します。
    2. 121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。使用するまで4°Cに保ちます。
  3. ASM を再構成します。
    注:この手順は、実験の日に実行する必要があります。
    1. 2x ASMbストックと10 mg/mLムチンストックを1:1の容量比で混合します。
    2. 使用前に十分に渦巻かせてください。

2. 多微生物群集選択培地の調製

注意: 以下は、1 Lのメディアの容量を準備するために必要な量です。

  1. マンニトール塩寒天培地(MSA)および シュードモナス 分離寒天培地(PIA)を調製するには、製造元の指示に従ってください。
  2. Prevotella Selective Agar(PSA)を調製するには、清潔なガラス瓶に以下を追加します。
    1. 30.0gのトリプシン大豆ブロス(TSB)。寒天15.0g。酵母エキス5.00g。0.50gのL-システイン塩酸塩。
    2. 0.5 mg/mL ヘミンストック 10.0 mL。10 mg/mL メナジオンストック 100 μL
    3. 940 mLのdiH2Oを加えて攪拌します。121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。
    4. 冷めたら(つまり、ボトルを素手で保持できる)、攪拌しながら50.0mLの脱毛羊の血液を追加します。50 mg / mLカナマイシンストック2.00 mL。.50 mg/mL バンコマイシンストック 150 μL。10 mg/mLポリミキシンBストック500 μL。
  3. Streptococcus Selective Agar(SSA)を清潔なガラス瓶で調製するには、以下を追加します。
    1. TSBの30.0g。寒天15.0g。
    2. 950 mLのdiH2Oを加えて攪拌します。121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。
    3. 冷めたら(つまり、ボトルを素手で保持できる)、攪拌しながら50.0mLの脱毛羊の血液を追加します。1.00 mLの10 mg / mLポリミキシンBストック。.1.00 mLの10 mg / mLオキソリン酸ストック。.
      注:プレートに注ぎ、最大1か月間4°Cに保ちます。使用する前に、プレートを接種する前に最大24時間前に室温で乾かしてください。PSAは 、P.メラニノジェニカ および プレボテラインターメディアで検証されています。SSAは、 S. sanguinisおよび Streptococcus milleri グループ(Streptococcus constellatus、 Streptococcus intermedius、 および Streptococcus anginosus、SMGとして示される)で検証されています。新しい株をテストする場合は、これらの選択培地を de novo で検証することを強くお勧めします。

3.細菌の液体培地の調製と増殖条件

  1. 緑膿菌と黄色ブドウ球菌を日常的に増殖させるには、無菌のリッチ培地(例:リゾジェニーブロス(LB)またはTSB)を使用してください。
    1. LB/TSB寒天プレートで以前に成長させた単一のコロニーを37°Cで20〜24時間選択することにより、液体を一晩開始します。
    2. ブロスカルチャーを37°Cで一晩成長させ、250rpmで16〜18時間振とうします。
  2. 連鎖球菌属を増殖させるには、0.5%酵母抽出物(THB-YE)を添加した無菌のトッドヒューイットブロスを使用してください。
    1. 5%除細動羊の血液(血液寒天プレート)を補充したTSB寒天プレートで以前に増殖した単一のコロニーから、37°C + 5%CO2で24時間液体培養を開始します。
    2. THB-YE培養物を嫌気的に、または37°C + 5%CO2 で18〜22時間振とうせずに一晩成長させます。
  3. プレボテラ属を成長させるには、清潔なボトルに以下を追加して、1Lのプレボテラ成長培地(PGM)を準備します。
    1. TSBの30.0g。酵母エキス5.00g。0.50gのL-システイン塩酸塩。0.5 mg/mL ヘミンストック 10.0 mL と 10 mg/mL メナジオンストック 100 μL
    2. 990 mLのdiH2Oを加え、121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。ボトルをアルミホイルで包んで光から保護します。
    3. Prevotella spp.コロニーを血液寒天培地上に増殖させ、37°Cで48時間嫌気的にインキュベートします。
    4. PGMで単一のコロニーを接種し、37°Cで24時間嫌気的に振とうせずに一晩成長させます。
      注:PGMは室温で最大2週間保存できます。使用前に各増殖培地で無菌試験を実施することを強くお勧めします。嫌気性チャンバーを使用しない場合は、コロニーのパッチから Prevotella 属の液体を一晩中開始する必要があるかもしれません。.

4. 共培養実験の準備

注: 図1 は、実験ワークフローをまとめたものです。実験のセットアップは、調製時間が1時間未満であれば、酸素条件で行うことができます。それ以上時間がかかると予想される場合は、嫌気性チャンバー(10%CO2、10%H2、および80%N2 混合ガス)を使用して実験を行うことを強くお勧めします。嫌気性ジャーは、実験サンプルのインキュベートにも使用できます。

  1. 単一栽培と共培養の準備
    注:すべての遠心分離ステップを10,000 x g で室温で2分間実行します。共培養では、96ウェルプレートに接種する直前に細菌サンプルを混合します。通常、 緑膿菌 および 黄色ブドウ球菌 株の容量は、一晩の培養から収集されます。 Streptococcus spp.および Prevotella spp.の場合、一晩の量は2〜4 mLの間で変動する可能性があります。.これらの容量は、テストする条件の数に応じて調整できます。
    1. 一晩培養した細菌液を使用して、次の手順を実行します。
      1. 緑膿菌および黄色ブドウ球菌株の場合は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して2回洗浄します。
      2. Streptococcus spp.およびPrevotella spp.の場合は、滅菌PBSで一度洗浄してください。
        注意: ペレットは簡単に失われる可能性があるため、ピペットを使用して上清を慎重に捨ててください。
      3. 洗浄後、各ペレットを1x水で希釈したASMb1 mLに再懸濁します。
      4. 滅菌PBSで各サンプルを1:10に希釈し、OD600を測定します。
      5. ASM ですべてのカルチャを OD600 0.2 に調整します。
      6. OD600 = 0.2懸濁液を使用して、細菌サンプルをASMで希釈し、単一培養および共培養の最終OD600 (各微生物について)にします。
      7. 5秒間徹底的に渦巻きます。
        注:例えば、OD600 = 0.01で合計1 mLの緑膿菌モノカルチャーASM懸濁液を調製するには、OD600 = 0.2で50 μLの緑膿菌を950 μLのASM容量に加えます。共培養では、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌、およびプレボテラ属懸濁液をそれぞれ50 μLをOD600 = 0.2で取り、ASM800 μLに加えます。
      8. ピペットを使用して、無菌プラスチック平底96ウェルプレートの3つの別々のウェルに100 μlの単一培養および共培養懸濁液を加えます。
      9. プレートを無酸素状態で37°Cで24時間インキュベートします(振とうなし)。
        注:ここでは、他の酸素濃度(例:.、マイクロオキシン、正常酸素症)も使用できます。ただし、モデルは無酸素状態で開発および検証されています。モノカルトおよび共培養細菌懸濁液を段階希釈して開始接種を確認し、PIA、MSA、SSA、およびPSAにプレーティングすることを強くお勧めします。各細菌種の目標開始濃度は、1 × 107 CFU/mL(P. aeruginosa)、3.5 × 106 CFU/mL(黄色ブドウ球菌)、1.2 × 106 CFU/mL(連鎖球 菌属)、4.6 × 106 CFU/mL(Prevotella spp.)です。細菌性接種物も、Jean-Pierreら10によって記述されているように、改変することができる。
  2. バイオフィルム形成後のメディアを交換してください。
    1. インキュベーションの24時間後、マルチチャンネルピペットを使用して吸引することにより、付着していない(プランクトン性)細胞を除去します。
    2. 事前に形成されたバイオフィルムに100 μLの新鮮なASMまたは目的の処理薬(抗生物質、代謝物など)を補充します。
    3. 無酸素状態でプレートを37°Cでさらに24時間インキュベートします。
      注:これらの手順は、すばやく(つまり、1分未満)実行すれば、有酸素的に実行できます。それ以外の場合は、嫌気性チャンバーを使用してください。

5. サンプルの収集とメッキ

  1. さらに24時間のインキュベーション後、マルチチャンネルピペットで非接着性(プランクトン性)細胞を吸引します。
    注:プランクトン画分は、保持し、段階希釈し、選択培地に播種するか、または廃棄することができます。
  2. 125 μLの滅菌PBSを使用してバイオフィルムを2回優しく洗浄し、ボリュームを廃棄します。
  3. 50 μL の滅菌 PBS を添加し、96 ピンリプリケーターを使用してプレートから細胞を穏やかにこすり落とすことにより、バイオフィルムを剥離します。
  4. 再懸濁したバイオフィルム細胞を、新しい滅菌96ウェルプレートの列Aに移します。
    注:96ウェルプレートには、行BからHに滅菌PBSが含まれます。
  5. プランクトン(必要な場合)およびバイオフィルム画分の10倍段階希釈を行います。
  6. 各希釈サンプルの3〜5 μLをPIA、MSA、SSA、およびPSAにプレートします。
  7. 接種スポットを乾かします。

6. 選択的プレートとコロニー形成ユニット(CFU)の計数インキュベーション

  1. 緑膿菌および黄色ブドウ球菌については、37°Cで18-20時間インキュベートしてください。
  2. Streptococcus sppの場合は、無酸素状態で37°Cで24時間インキュベートします。
  3. Prevotella sppの場合、無酸素条件で37°Cで48時間インキュベートします。
  4. インキュベーション後、コロニーをカウントし(スポットあたり~10-35)、mLあたりのCFUを計算します。
  5. 視覚化ツールを使用してデータをプロットします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

図2に示されているように、いくつかの表現型が報告されており、これには、(1)単一栽培と比較して混合プランクトン群集を増殖させた場合の緑膿菌および黄色ブドウ球菌の生存細胞数の減少、(2)S.sanguinis細胞の多微生物増殖の増加、および(3)Jean-Pierreらによって以前に報告されたP.メラニノジェニカの混合群集増殖が含まれます10。

さらに、 図1 に示すように、バイオフィルムコミュニティが確立されると、 in vitro システムは目的の分子(Abx、代謝物など)の試験にも使用できます。すなわち、共培養で増殖した微生物は、(1)感受性の増加(P.aeruginosa-図3A)、(2)感受性の低下(黄色ブドウ球菌 および <...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

この臨床的に情報に基づいたin vitro共培養システムの有用性は、多微生物特異的な細菌機能を検出する能力にあります。すなわち、このモデルを利用することで、Prevotella spp.のコミュニティ特異的な増殖(図2)から、P. aeruginosa、S. aureus、S. sanguinisの最前線のCF Abxに対する感受性の変化(図3)まで、微生物の表現型を報告しています。さらに、図2に示されているデータは実験室株を代表するものですが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)株、SMG、緑膿菌10のSMG、P.インターメディア、臨床分離株など、各微生物のさまざまな種/株を使用して同様の結果が得ら...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は開示しないことを宣言します。

謝辞

George A. O'Toole博士とThomas H. Hampton博士は、 in vitro 多微生物コミュニティモデルの設計と開発において重要な役割を果たしたことに感謝します。原稿について有益なコメントをくださったSophie Robitaille博士に感謝します。この研究は、F.J-PにJEAN21F0された嚢胞性線維症財団の助成金によって支援されました。原稿の 図1 はBioRenderを使用して作成されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)Fisher ScientificNC0387928クロロホルム中の250 mg/mLのストックをボトル内で直接調製します。-20°Cに保ちます。 最終濃度 200 μ2x ASMベースでg / mL。
3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)SigmaM1254最終濃度 200 mM 2X ASM ベース中。
96ピンレプリケーターフィッシャーサイエンティフィック05-450-9ディスポーザブルレプリケーターも使用可能。猫の #NC1567338。
蓋付き96ウェル滅菌標準プレートフィッシャーサイエンティフィック62406-081
寒天フィッシャーサイエンティフィックDF0145-17-0
アナロパック 2.5 L 長方形ジャーフィッシャーサイエンティフィック23-246-385
CaCl2*2H2O フィッシャーサイエンティフィックC79-500Mストックを水で調製し、0.22 μmフィルター。最終濃度は2x ASMベースで3.5 mM。
脱脂羊の血液連鎖球菌とプレボテラの成長プレートを準備します。
ニシン精子からのデオキシリボ核酸SigmaD7290最終濃度 1.2 mg/mL 2x ASM ベース中。
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA14498301 mg/mL ストック(3.6 mM)を水で調製し、0.22 μmフィルター。アルミホイルで包んで保管してください。最終濃度は 2x ASM ベースで 0.0072 mM です。
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3水中の20%ストック(1.1 M)として調製し、オートクレーブで滅菌します。最終濃度は2x ASMベースで6 mM。
ヘミンシグマ51280ミン100mgを1M NaOH2 mLに溶解し、水で容量を200 mLまで上げます。琥珀色のボトルまたはアルミホイルで包まれた通常のボトルに4°Cで保管してください。
K2SO4Fisher ScientificP304-5000.25 Mストックを水に調製し、0.22 μでろ過滅菌します。mフィルター。最終濃度は2x ASMベースで0.54 mM。
カナマイシン50 mg/mL の水溶液を調製します。0.22 μmフィルターをかけて4°Cで保存します。
KClFisher ScientificP217-500最終濃度 30.0 mM (2x ASM ベース中)。
KNO3Fisher ScientificP263-5001 Mストックを水に調製し、0.22 &muでろ過滅菌します。mフィルター。最終濃度は 2x ASM ベースで 0.70 mM です。
L-システイン塩酸塩ッシャーサイエンティフィックAAA1038922
L-乳酸 シグマL1750Mストックを水に調製し、0.22 μmフィルター。pHを7.0に調整します。最終濃度は2x ASMベースで18.6 mM。
L-トリプトファンSigmaT02540.2 M NaOH に 0.1 M ストックを調製し、0.22 μmフィルター。4°Cで冷蔵保管してください。アルミホイルで包まれたC。最終濃度は 2x ASM ベースで 0.132 mM です。
マンニトール塩寒天フィッシャーサイエンティフィックB11407メーカーの推奨を使用して調製します。
MenadioneSigmaM562596-100%エタノールに溶解した10 mg / mLストック溶液を準備します。4°で保存します。アルミホイルで包まれたC。使用前に渦巻きます。
MgCl<サブ>2*6H<サブ>2O フィッシャーサイエンティフィックAA12288A91 M ストックを水に溶かし、0.22 μmフィルター。最終濃度は 2x ASM ベースで 1.21 mM です。
豚の胃からのムチン - II型 SigmaM237810 mg/mL (2x) のストックを水に調製し、オートクレーブ前に十分に混合します。4°Cに保ちます。
Na2HPO4Fisher ScientificS375-5000.2 Mストックを水に調製し、0.22 μmフィルター。最終濃度は2x ASMベースで2.5 mM。
N-アセチルグルコサミン シグマA86250.25 Mストックを水に調製し、0.22 μmフィルター。ストックは4°Cで冷蔵保管します。最終濃度は2x ASMベースで0.6 mMです。
NaClFisher ScientificS271-500最終濃度 103.7 mM (2x ASM ベース中)。
NaH2PO4*H2OフィッシャーサイエンティフィックS369-5000.2 Mストックを水で調製し、0.22 &muでろ過滅菌します。mフィルター。最終濃度は2x ASMベースで2.6 mM。
NaOHFisher ScientificS318-5005 Mストック溶液を調製します。2x ASMベースストックのpHを調整するために使用します。
NH4ClフィッシャーサイエンティフィックA661-500最終濃度 4.6 mM 2x ASM ベース。
オキソリン酸10 mg/mL ストック溶液 0.5 M NaOH を調製します。0.22 μmフィルターをかけて4°Cで保存します。
ポリミキシンB10 mg/mLの原液を水で調製します。0.22 μmフィルターをかけて4°Cで保存します。
Pseudomonas Isolation 寒天ッシャーサイエンティフィックDF0927-17-1メーカーの推奨を使用して調製します。
トッドヒューイットブロスフィッシャーサイエンティフィックDF0492-17-6メーカーの推奨を使用して準備します。
トリプシン大豆スープフィッシャーサイエンティフィックDF0370-17-3メーカーの推奨を使用して調製します。
バンコマイシンは、水に50 mg / mLのストック溶液を準備します。0.22 μmフィルターをかけて4°Cで保存します。
酵母エキスフィッシャーサイエンティフィックB11929
トリプトファンなしの酵母合成ドロップアウト SigmaY1876最終濃度 8.0 mg/mL (2x ASM ベース中)。
1 ヘフィ 1 培地 フィ

参考文献

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

嚢胞性線維症バイオフィルム微生物コミュニティモデルin vitroモデルPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusStreptococcus sanguinisPrevotella melaninogenica薬剤耐性マイクロバイオーム相互作用
嚢胞性線維症に関連する多微生物バイオフィルムの増殖によるコミュニティ表現型の調査
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。