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方法論記事

疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築

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DOI:

10.3791/66787

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2024年5月10日

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1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

この記事について

サマリー

この研究は、蛍光A549-iRFP細胞の多細胞スフェロイドの肺内接種に基づく同所性非小細胞肺がん(NSCLC)モデルを示しています。このモデルは、長波長蛍光の動的 in vivo モニタリングに従って、臨床NSCLC病期を再現し、シスプラチンに応答します。

要約

非小細胞肺がん(NSCLC)は、複雑で不均一な腫瘍微小環境を伴う致死性の高い疾患です。現在、がん細胞懸濁液の皮下接種に基づく一般的な動物モデルは、NSCLCの腫瘍微小環境を再現していません。ここでは、三次元多細胞スフェロイド(MCS)の肺内接種を採用したマウスの同所性肺がん異種移植モデルについて説明します。具体的には、蛍光ヒトNSCLC細胞(A549-iRFP)を低付着96ウェルマイクロプレートでコラーゲンと共に3週間培養してMCSを形成し、これを胸腺ヌードマウスの左肺に肋間接種して同所性肺がんモデルを確立しました。

A549-iRFP細胞株のMCSは、元のA549細胞株と比較して、抗がん剤に対して同様の反応を示しました。A549-iRFP細胞の長波長蛍光シグナルは、スフェロイド体積、細胞生存率、細胞タンパク質レベルなど、がん細胞増殖の一般的なマーカーと強く相関していたため、蛍光イメージングによる in vivo でのがん増殖の動的モニタリングが可能になりました。マウスへの接種後、A549-iRFP MCS異種移植片は、原発腫瘍の拡大、隣接する二次腫瘍の出現、対側右肺および遠隔臓器へのがん細胞の転移など、NSCLCの臨床病期によく似た段階を経て確実に進行しました。さらに、このモデルは、ベンチマークとなる抗肺がん治療薬であるシスプラチンに反応し、予想される毒性とがんの進行が遅いことが示されました。したがって、このNSCLCのマウス同所性異種移植モデルは、疾患の進行を再現し、潜在的な抗がん剤の開発を促進するためのプラットフォームとして機能します。

概要

すべての腫瘍性疾患の中で、肺がんは最も多くの生命損失をもたらすだけでなく、米国で毎年2番目に多い新規患者数を主張しています1。この壊滅的な悪性腫瘍は、現代医療における大きな障害となっており、その複雑な生物学とより効果的な治療法のより深い理解が求められています2。非小細胞肺がん(NSCLC)は肺がんの85%を占め、固形腫瘍に発展する傾向があります3。肺がんにおける最も重要な課題の1つは、動的で不均一な腫瘍微小環境であり、これはがんの進行と治療介入に対する反応に深く影響します4,5,6。NSCLCのさまざまな段階におけるがん細胞とその微小環境との相互作用をより深く理解するには、NSCLC進行の組織学的特徴を再現する洗練された病理学的モデルが必要です。

この点で、同所性動物モデルは、NSCLC研究の有望な手段として浮上しています。一般的に採用されている皮下異種移植モデル7とは異なり、同所性モデルは、起源の臓器に直接接種されるがん細胞を特徴としています。肺がんの場合、これはがん細胞を直接肺組織に移植することを意味する8,9。その結果、肺がんの同所性モデルは、隣接する組織、血管、免疫成分を含む天然の腫瘍微小環境をよりよく模倣し、それらの生理学的および臨床的関連性を向上させます。

三次元多細胞スフェロイド(MCS)は、腫瘍環境の特徴を再現するための別の有望なアプローチを表しています。ほとんどのがんは、さまざまな細胞間相互作用、細胞外マトリックス、酸素と栄養素の勾配など、複雑な腫瘍微小環境によって特徴付けられます10,11。従来の2D細胞培養には、これらの腫瘍特異的な特徴を再現するための空間的および構造的な複雑さが欠けています12。対照的に、適切なサイズのMCSは、低酸素および壊死性のコアを持つ不均一な構造を特徴としており、これは腫瘍内の微小環境だけでなく、抗がん療法における薬剤耐性の主要なメカニズムである薬物浸透に対する生理学的障壁も再現しています13,14,15。

同所性動物モデルとMCS培養技術の両方を利用して、MCSは免疫不全マウスに接種され、乳癌および前立腺癌の同所性モデルの構築に成功しました16,17。ここでは、肺がんのマウス同所異種移植モデルを構築および特徴付けるための詳細な方法論を報告します。この方法は、蛍光ヒト肺がん細胞(A549-iRFP)18に由来する3D MCSの肺内接種を採用しています。このモデルは、NSCLCの4つの臨床病期と密接に並行する病期を通じて肺がんのin vivo進行を観察する絶好の機会を提供します。さらに、このモデルの異種移植癌は、臨床的に確立された抗肺癌薬であるシスプラチンに応答しました。

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プロトコル

動物実験は、太平洋大学の動物管理・使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました(動物プロトコル19R10および22R10)。本研究では、体重 5 〜 6 週齢、体重 20 〜 25 g の 8 匹の雄の胸腺ヌード マウスを、参照されたげっ歯類の餌で飼育し、病原体を含まない (SPF) 条件下で飼育しました。ケージ、寝具、飲料水はオートクレーブ滅菌され、定期的に交換されました。マウスでの腫瘍接種の概略図を 図1に示します。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. A549-iRFP細胞の3次元MCSの確立

  1. A549-iRFP細胞(ヒト肺腺がん)を5% CO2 、37°Cの加湿雰囲気でインキュベートし、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、および1 μg/mLピューロマイシンを含む完全増殖培地DMEMで増殖させます。
  2. 0.3% コラーゲンを添加した 100 μL の完全増殖培地を使用して、A549-iRFP 細胞を 96 ウェル超低接着の丸底スフェロイドマイクロプレートに播種し、播種密度 4,000 細胞/ウェルで行います。
  3. マイクロプレートを300 × g で4°Cで7分間遠心分離し、MCSの形成を促進します。顕微鏡でMCSの形態を調べ、遠心分離後の細胞凝集を確認します。
  4. 48時間後、各ウェルに100 μLの完全増殖培地を添加して、ウェルあたり200 μLの増殖培地の総容量を達成します。
  5. 各ウェルの100 μLの増殖培地を、1日おきに新鮮な完全増殖培地と交換してください。

2. A549-iRFP MCS の特性評価

  1. 顕微鏡を使用してMCSの形態を観察および画像化し、位相差顕微鏡の画像に基づいてMATLABの参照ソフトウェアを使用したシミュレーションによりMCSの体積を推定します。
    1. ImageJソフトウェアで1つのMCSイメージを開きます。
    2. フリーハンド選択を使用して MCS のエッジを選択し、ROI マネージャーに追加します。
    3. [編集] |選考 |マスクを作成します。
    4. [編集] |反転。
    5. [ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。
    6. ReViSPソフトウェアを開きます。
    7. 保存した TIFF 画像を開く には、[参照] をクリックします。
    8. 「開始」をクリックして、MCSシミュレーションを完了します。
  2. 700 nm チャネルの赤外イメージングシステムを使用して iRFP 蛍光シグナルを測定し、ソフトウェア(Image Studio など)を使用して蛍光シグナルを定量します。
    1. Image Studioソフトウェアを開きます。
    2. 「チャンネル」タブで、「700」を選択し、「強度」 = 5 を選択します。
    3. 「Scan Controls」タブで、「84 μm」、「Medium」、「0.0 mm」、「Flip Image」を選択します。他のすべてはデフォルトのままにします。
    4. [開始] をクリックしてスキャンを開始します。
  3. ベンダーのプロトコルに従って、3D細胞生存率アッセイを使用して細胞生存率を評価および定量化します。
  4. ベンダーのプロトコルに従って、BCA Assayを使用して細胞タンパク質を評価および定量します。

3. 腫瘍接種のためのMCS選択

注:MCSをスフェロイドマイクロプレートに播種し、定期的な増殖培地交換で2〜3週間増殖させた後、腫瘍接種に適した以下の特性を持つMCSを選択します。

  1. 顕微鏡でMCSの形態を観察し、全体的に滑らかなエッジを持つ丸い形状のMCSを選択しますが、5〜10個の粗い出芽( 図2Fの矢印)があり、直径が700〜800μmの範囲です。
  2. iRFP蛍光を測定し(ステップ2.2を参照)、蛍光シグナルが平均から1標準偏差以内にあるMCSを選択します。

4. 肺内MCS接種

注:動物を取り扱う前に、70%イソプロピルアルコールスプレーを使用して、手術ステーションとツールを清掃してください。

  1. 80 mg/kg ケタミンと 12 mg/kg キシラジンの IP 注射で各マウスに麻酔をかけます。マウスの足を鉗子でつまんで、完全な麻酔を確保します。
  2. 痛みを軽減するために、塩酸ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)10μLを皮下に注入します。.
  3. 乾燥を防ぐために目に眼科用軟膏を塗ります。
  4. マウスを背側の姿勢に置き、手足を伸ばした位置にテープで固定します。
  5. ヨウ素とアルコールの綿棒で背中の皮膚を滅菌します。
  6. 左背中の手術用ハサミを使用して0.5〜1cmの切開部をカットします(図1B)。鉗子を慎重に使用して、胸壁と肺の動きが見えるまで筋肉と脂肪組織を分離します。
  7. 選択したMCSをマイクロプレートからピペットを使用して、氷冷PBSが入ったガラスシャーレに移します。
  8. 20 Gの針を100 μLのガラス製シリンジに取り付け、氷上で予冷し、PBSとマトリゲルの予冷混合物(1:1 v / v)を20 μL吸引します。
  9. シリンジを使用して、ペトリ皿から1つのMCSを最小量のPBS-マトリゲル混合物ですばやく吸引し、MCSを針の金属部分に保ちます。
    注意: MCSが針から滑り落ちないように、シリンジとプランジャーをしっかりと握ってください。
  10. 針を 2 つの肋骨の間に垂直に ~3 mm の深さまで静かに挿入し、MCS を含む 20 μL の PBS とマトリゲルの混合物をすべてゆっくりと注入します。
    注意: 肺、血管系、または心臓の損傷を防ぐために、挿入中に過度の力を入れないでください。
  11. 針を慎重に取り外し、傷口に三重の抗生物質軟膏を塗布します。
  12. 切開部をサージカルクリップで密封し、2週間後に取り外す必要があります。
    注:縫合線が蛍光イメージングを妨げる可能性があるため、切開部を縫合しないでください。ヌードマウスは手術後に自然に治癒することができます。
  13. 動物を赤外線ヒートパッドの上に置き、体温を維持するために実験室用ワイプで覆います。動物が目を覚まし、適切に動くまで、少なくとも30〜60分間動物を監視します。
  14. 痛みを軽減するために、最初の48時間、1日3回、10μLの塩酸ブプレノルフィン(0.3 mg / mL)を皮下注射します。.

5. 術後モニタリング

  1. 3〜4日ごとに体重を測定します。
  2. 腫瘍異種移植片からのiRFP蛍光シグナルを、700nmチャネルの小動物イメージングシステムで3〜4日ごとに測定します:左、右、背側、腹側の4つの姿勢で、マウスをイソフルラン吸入(流量:1.5〜2 L / min、1.5%イソフルランを含む酸素)により2〜3分間麻酔下に保ちます。
  3. 異種移植片がんのin vivo での正味蛍光強度を、ソフトウェア(Image Studioなど)を使用して定量化します。
    1. 固定四角形 (A1、200 x 125 ピクセル) をマウスの胸部領域のサンプリング ウィンドウとして使用します。
    2. フリーハンド機能を使用して、長方形 (A1) 内のマウスの形状を追跡し、領域 A1 の蛍光強度 (F1) を測定します。
    3. 別の小さな長方形(A2、25 x 40ピクセル)を使用して、大腿部のマウスの背景蛍光(F2)を測定します。
    4. 式(1)を使用して、各マウスの異種移植がんの正味蛍光強度を計算します。
      figure-protocol-1(1)

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結果

A549-iRFP MCS の特性評価
A549-iRFP MCSは、コラーゲンと遠心分離の助けを借りて、スフェロイドマイクロプレートでの培養に成功しました。MCSが1週間後に直径約500μmに達したとき、A549とA549-iRFP MCSの両方をさまざまな抗がん剤および製剤に3日間曝露した後、さらに4日間薬物フリー増殖培地で維持しました。A549-iRFP MCSは、親A549細胞の応答パターンと密接に類似した応答パターンを示しました。A549およびA549-iRFP MCSは、肺がんに対する第一選択の抗がん剤の1つであるシスプラチンと同様の用量反応曲線とIC50値を示しました(図2A)。A549およびA549-iRFP MCSの生存率は、他の抗がん剤または製剤によって同程度に阻害されました(図2B)。

A549-iRFP MCS ...

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ディスカッション

A549-iRFP MCSの構築は、簡単で再現性の高いラボ手順であり、複数の細胞株のMCS形成に変換することができます。遠心分離とコラーゲンの助けを借りて生成されたMCSは、3〜4日以内により一体的で固形腫瘍のような構造を示します。この方法により、堅牢なスフェロイドが形成され、その一体構造を長期間、通常は2〜3週間、または小さな出芽が出現し始めるまでさらに長く維持できます。遠心分離とコラーゲンを用いることで、MCSの形成を標準化し、実験モデルにおけるMCSの一貫性と信頼性を確保しました。このアプローチにより、結果の再現性が向上し、腫瘍増殖速度の変動性が最小限に抑えられるため、腫瘍の生物学と治療介入を研究するためのより堅牢なプラットフォームが提供されます。

従来の2D単層細胞培養とは対照的に、3D MCSは、この研究では少なくとも6週間という、はるかに長い期間にわたって増殖することができます。がんの成長と進行を監視するには、動的で長期的な定量的測定が非常に有益です。既存の3D MCSアッセイの多くは、測定中に破壊的であるため、長期的な評価への有用性が制限されています。iRFP蛍光シグ...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、パシフィック大学からのSAAGおよびSEED助成金によって支援されました。Odyssey Infrared Imaging 205 システムへのアクセスを許可してくださった William Chan 博士と、SpectraMax iD3 プレートリーダーへのアクセスを許可してくださった John Livesey 博士に感謝します。動物プロトコルに関する技術的なアドバイスをいただいたメラニー・フェルムリー博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 & マイクロ;L ガラスシリンジハミルトンPart/REF #80601
20 G ニードルモフィッシャーサイエンティフィック14 826D
96ウェル超低付着スフェロイドマイクロプレート コーニング15-100-173
A549-iRFPイマニス ライフサイエンス CL082-STAN
AIN-93M 成熟げっ歯類の食事 Research Diets株式会社
アテミックヌードマウスチャールズリバーラボラトリーズ株式会社株コード:490;ホモ接合体
BCAピアス23227
プレノルフィン塩酸塩パターソン獣医NDC番号:42023-179-05
CellTiter-Glo 3D細胞生存率アッセイPromegaG9683
GibcoA1064401 
DMEMCorningMT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJオープンソースツール (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio LI-CORバージョン5.2
イソフルランパターソン獣医NDC番号:17033-0091-25
ケタミンパターソン獣医NDC番号:50989-0161-06
顕微鏡 キーエンス型番:BZ-X710
マトリゲルコーニングCB-40234
オデッセイ 赤外線イメージング 205 システム LI-COR型番:9140
PBSCorningMT21040CV
Pearl Trilogy 小動物イメージングシステム LI-CORモデル番号:9430
ペニシリン-ストレプトマイシン コーニングMT30002CI
ピューロマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック社
AAJ67236XF MATLAB の ReViSP ソフトウェア Sourceforgeのオープンソースツール(https://sourceforge.net/projects/revisp/)N / A
サージカルクリップ - AutoClipシステムファインサイエンスツール12020-00
キシラジンパターソン獣医NDC番号:61133-6017-01
サーD10012Mブコラーゲン

参考文献

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).
  4. Ducote, T. J., et al. Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers. Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).
  5. Lim, Z. F., Ma, P. C. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).
  6. Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).
  7. Peterson, J. K., Houghton, P. J. Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development. Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).
  8. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).
  9. Mclemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  11. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).
  12. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  13. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  14. Huang, B. W., Gao, J. Q. Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research. J Control Release. 270, 246-259 (2018).
  15. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  16. Sethi, P., et al. 3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation. Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).
  17. Valta, M. P., et al. Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).
  18. Huang, Y., et al. Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer. J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).
  19. Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. Lung cancer: Biology and treatment options. Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).
  20. Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. The eighth edition lung cancer stage classification. Chest. 151 (1), 193-203 (2017).

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