超高速ドップラー超音波を用いたマウスの肝血管系のイメージングと定量化

サマリー

高い空間分解能(100μm)と感度を備えた超高速ドップラー超音波(UFUS)は、肝臓血管系の包括的な定性的概要を得るための適切な非侵襲的イメージングモダリティを表しています。UFUSはまた、微小血管系の定量的測定を容易にし、血管疾患のメカニズムの理解を深めることを目的としています。

要約

血管系の非侵襲的な in vivo イメージングは、げっ歯類の疾患メカニズムを研究するための強力なツールです。ドップラー超音波法による微小血管系の高感度イメージングを実現するためには、超高速イメージングの概念を用いたイメージングモダリティが好まれる。超音波スキャナーのフレームレートを毎秒数千フレームに上げることで、従来のドップラーモードでの感度が約1cm/sだったのに対し、血流の感度を2mm/sまで向上させ、微小循環に関する機能情報を取得することが可能になります。超高速ドップラー超音波(UFUS)イメージングは、神経血管結合を通じて脳の活動を捉えることができる神経科学で採用されるようになりましたが、呼吸に関連する大きな動きのために腹部臓器の血管系をイメージングする際にはより大きな課題を提示します。解剖学的に横隔膜の下に位置している肝臓は、特に面外運動や振動呼吸運動の影響を受けやすいです。これらのアーチファクトは、ドップラーイメージングに悪影響を与えるだけでなく、血管構造の解剖学的解析や血管パラメータの計算を複雑にします。ここでは、UFUSによるマウスの肝血管系の定性的および定量的イメージング分析を紹介します。主要な解剖学的血管構造を特定し、肝臓の肉眼的解剖学的構造のグラフィカルなイラストを提供し、それをドップラーの読み出しに基づく肝臓血管系の詳細な解剖学的評価と比較します。さらに、微小血管系の肝臓の血液量を経時的に確実に測定するための定量化プロトコルを開発しました。さらなる研究を検討するために、定性的血管解析は包括的な概要を提供し、肝臓疾患のマウスモデルを扱う研究者のための標準化された用語を提案します。さらに、非侵襲的な補完的方法として超音波を適用する機会を提供し、 in vivo で肝臓の血管欠損を検査し、臓器の深部にある機能微小血管の変化を測定してから、組織切片の ex vivo 染色を使用してミクロンレベルで血管の異常を解明します。

概要

前臨床マウスモデルは、肝臓微小血管疾患の発症と進行の研究に広く使用されています^1,2。炎症や線維症が現れる前の病気の初期段階で毛細血管の変化が起こり、時間の経過とともに肝硬変を引き起こす可能性があるため、縦断的フォローアップが有利です¹。疾患の進行を調べるためには、in vivoで血管の機能を可視化・測定するための強力なイメージングツールが不可欠です。超高速ドップラー超音波(UFUS)は、低コスト、携帯性、シンプルさ、リアルタイム性だけでなく、非侵襲的で時間を節約する手順^{であること}から、適切なモダリティを表しています3。従来のドップラー超音波と比較して、同様の空間分解能に達する可能性がありますが、大きな血流に制限されていますが、UFUSは1cm / sから2mm / sまでの遅い血流の検出を可能にし、はるかに小さな血管の寄与を調べることができます⁴。UFUSは感度を向上させ、これは単一の超音波処理で広い視野を持つ平面波伝送によって達成され、フレームレートを増加させ、したがって利用可能な超音波画像の数を増加させます⁵。時間的サンプルの数が多いと、組織から来る信号のキャンセルが改善され、散血器から反射されたエコーの検出が強化され、造影剤を必要とせずに感度が向上します⁶。パワードップラー推定により散血エコーのエネルギーを推定することにより、画像⁷では血管が小さすぎて分解できない場合でも、各ピクセルの血液量に比例する量が得られる。

UFUSは、空間分解能と時間分解能の良好な組み合わせを提供し、肝臓の血管構造の定性的評価に適したツールとなっています。超音波スキャナーの操作は比較的簡単ですが、マウスのさまざまな肝葉の肝血管系をナビゲートするには、肝臓の解剖学的構造を包括的に理解する必要があります。最近の研究では、3Dマイクロコンピュータ断層撮影法(μ-CT)^8,9を用いて、マウスの肝臓の解剖学的構造と肝血管樹の記述に焦点を当てている。ヒトとマウスの肝臓の形態学的な違いの一部は十分に文書化されています^が10、げっ歯類で行われた研究では、人間に関連する解剖学的な用語が採用されることが多く、四足動物の文脈では混乱を招きます。Nomina Anatomica Veterinaria(NVA)のような認識された標準化された命名法でさえ、げっ歯類の肝血管構造の一貫した用語に関する十分な情報が不足している¹¹。げっ歯類の解剖学的構造の文書化が不十分であるという課題を超えて、特に再現性のあるアプローチが予想される場合、超音波の読み出しを解釈する際にはさらに大きな困難が生じます。

生体臓器の非侵襲的な機能情報をさまざまな空間スケールで取得することは、in vivoイメージング³の課題です。CT、磁気共鳴画像法および血管造影法(MRI / MRA)、または焦点波を使用した従来のドップラーイメージングなどのハイエンドの肝臓イメージングモダリティは、疾患の進行を評価するために不可欠ですが、光音響イメージング12,13,14を除いて、ほとんどの血流ダイナミクスを捉えることができません。UFUSは感度が高く、毎秒1センチメートルを超える流れに限定されない小さな血管の遅い血流を検出できます^4,15。最近、UFUSを用いた解剖学的考察に基づくカスタマイズされたイメージング法を開発し、血管拡張¹⁶のマウスモデルにおける肝臓の血液量の信頼性の高い測定を可能にしました。

このプロトコルでは、もともと機能的な脳イメージング用に開発された市販の超音波プラットフォームを使用した肝臓の非侵襲的UFUSイメージングの手順を概説します。プロセスを合理化し、情報検索を強化するために、解剖学的な命名法と完全な分析方法を備えたマウス肝臓の包括的な図を提供します。さらに、取得した画像読み出しの詳細な表現を参照として提供し、オペレーターに依存する平面選択を支援するための一般的な解剖学的構造とランドマークを示します。さらに、肝血管系の定性的分析と定量的分析の両方に関連する図を含めます。

プロトコル

すべての動物実験は、欧州の法律(指令2010/63/EU)およびオランダ政府のガイドラインに基づいて実施され、ライデン大学医療センターの動物倫理委員会によって承認されました。

1. UFUSイメージングのためのマウス調製(タイミング~10分)

1. イメージングセットアップの準備
   1. 50 mLチューブ内の超音波透過ゲルを100 x g で3〜5分間遠心分離し、気泡の形成を防ぎます。
   2. 加熱パッドをオンにし、35°Cまで温めます。 3Dプリントされた水タンクに脱イオン水を入れます。
      注意: 水中に存在する水の泡や小さな粒子は、ドップラー測定を妨げる可能性があります。
2. 動物の麻酔
   1. 動物の体重を量ります。体重19〜32 gの生後8〜16週のオスとメスの同腹仔を使用しました。0.9%NaClに100 mg / kgの投与用量のケタミンとキシラジン10 mg / kgの麻酔ミックスを準備します。.混合物は安定しておらず、効力を失う可能性があるため、毎日無菌で新鮮な状態で混合物を準備してください。
      注:好ましい動物の体重は23〜30gです。
   2. 注射部位、すなわち腹部の右下または左の象限をガーゼと70%エタノールを使用して消毒します。27Gの針と1mLの使い捨て注射器または30Gのインスリン注射器を使用して、10μL / gの体重腹腔内(ip)を注入します。.
   3. ケージの蓋を閉めずに、動物を加熱パッドのケージに戻します。開始タイマー。
      注:深い麻酔は約40分間続くはずです。より長いイメージングセッションが必要な場合は、ケタミン60 mg / kgとメデトミジン0.4 mg / kgを0.9%NaClに混合するなどの可逆麻酔を使用し、その後、アチパメゾール1 mg / kgの皮下注射による逆転を検討してください。.イメージングのセットアップのため、注射麻酔は吸入麻酔よりも好まれます。
   4. 麻酔の効果を確認してください。麻酔が効いているかどうか、約5分後に後足を優しくつまんで確認します。それでも動物が反応する場合は、完全な麻酔を達成するためにさらに2〜3分待ちます。
   5. 動物が深く眠っているときの角膜の乾燥や目の外傷を防ぐために、眼科用軟膏を塗布します。反射神経を再度確認し、動物がつまむことに反応を示さない場合にのみ手順を開始します。
3. 撮像領域の準備(図1)
   1. 動物の腹を温熱パッドの上に置いた状態で、獣医師のトリマーでやさしくトリミングします。トリミングは、胸部や腹部に圧迫を加えずに非常に穏やかに行ってください。
   2. 脱毛クリームを2分以内で塗布します。
      注意:脱毛クリームの潜伏時間を延長しないでください、皮膚の炎症を引き起こす可能性があるためです。.これは画像の品質に影響を与えるだけでなく、動物に不快感を与える可能性もあります。
   3. 脱毛クリームをペーパーティッシュで取り除き、ぬるま湯でやさしく洗います。
4. ドップラー測定のために動物とイメージングのセットアップを配置します(図2A)。
   1. 動物を背側に温熱パッドの上に置き、テープで足をそっと固定します。少量のぬるま湯で肌に潤いを与えます。
   2. 遠心分離した超音波透過ゲルを、20mLの注射器を使用して、剃った皮膚に直接塗布します。
      注意: 気泡はドップラーイメージングに影響を与え、アーティファクトを引き起こす可能性があります。
   3. 水で満たされた3Dプリントされた水タンクを動物の上に置きます。水タンクの高さが動物に適しており、その約1mm上にあり、動物を圧迫しないようにしてください。
   4. 超音波透過ゲルと水タンクのポリメチルペンテン熱可塑性プラスチック(PMP)との間に空気がないか確認してください。

2. プローブ操作と平面選択(タイミング~10分)

1. ソフトウェアを起動し、システム上に実験的なセッションを作成します。スキャンソフトウェアを起動します。
   注意: スキャンソフトウェアはシステムに統合されています。
2. ポップアップウィンドウで[ はい ]をクリックして、モーターを中央に配置します。電動システムを使用して、スキャンソフトウェアによってプローブをリモート制御します。モーターを中央に配置することにより、プローブは自動的に垂直、横、回転の3方向に移動します。機器の損傷を避けるために、プローブの軌道を妨げる物体がないことを確認してください。
   注意: モーターを中央に配置することが重要です。そうしないと、ソフトウェアが機能不全に陥る可能性があります。
3. 新しい実験セッションを作成するには、メニューから [セッション ] を選択します。セッションパネルに、プロジェクト、件名、セッション、ユーザー名、コメント、タグなどの必要な情報を入力します。 「検証」をクリックします。
   メモ: セッションは、イメージングデータを取得または保存する前に作成する必要があります。セッション情報は実験中に変更できますが、データの保存先も変更されることに注意してください。
4. プローブを配置します。128個の素子を備えたリニア15MHz超音波プローブは、4軸モーターモジュール、つまり3つの並進移動方向と1つの回転移動方向で構成される電動システムを介してシステムに接続されています。
   1. [プローブの移動]メニューに移動し、コンピューター制御の位置決めシステムを使用して、プローブを3Dプリントされた水タンク内の水に移動します。プローブの位置に示されている制御ボタンを使用してモーターを動かし、並進運動(X、Y、Z)のステップをmmで定義し、回転運動(R)の°でステップを定義します。Z 方向の事故を防ぐには、[安全] で Z 制限を定義します。
      注意: プローブの要素が水と接触していることが重要です。ただし、プローブを完全に水中に移動させると、機器に害を及ぼす可能性があるため、避けてください。モーターが位置に到達できない場合は、ワークスペースから外れた警告が表示されます。
   2. [ ホームの設定]をクリックして、座標を参照位置として保存します。R は X、Y、Z を基準にしているため、並進と回転を同時に修正しないでください。R を修正する前に必ず [ホームを設定](Set Home )をクリックしてください。
   3. イメージングと視覚化のパラメータを定義します。ライブビューメニューに移動し、[ プレイ ]をクリックして目的の平面を選択します。
      注意: ライブ view 超音波プローブの要素が音響インピーダンスに一致する媒体に囲まれている場合にのみ、機器の寿命を確保し、過熱を防ぎます。
5. プリセットでイメージングパラメータを選択しました。
   1. Load Sequenceボタンを使用して、10 msのドップラー超高感度超音波シーケンスをロードします。たとえば、イメージング電圧が25 Vでドップラーフレームレートが10 msの11の複合平面波(-10°から10°の角度)をロードします。
      注:分析中に臓器の呼吸運動を画像化し、フィルタリングするために、高速ドップラーシーケンス(10ミリ秒など)を使用する必要はありません。
   2. イメージングの深さは 1 mm から 50 mm の範囲で定義し、イメージング可能な最大深度は 50 mm にします。デフォルト設定は、1 mm から 10 mm までの深さは 9 mm で、推奨される深さは 2 mm から 12 mm です。
      注:動物と水タンクのサイズに応じて、イメージングの深さを特定のニーズに合わせて調整できます。
6. 視覚化パラメーターを選択します。
   1. ドップラーを選択して血管系を画像化します。
      注:A.U.のピクセル強度は血液量を表し、同じプローブとシーケンスを使用する場合にのみ比較する必要があります。
   2. 時間平均化を適用して信号対雑音比を最適化するには、[ 平均化 ] を選択します。
      注:画像を一時的に平均化すると、画質は向上しますが、フレームレートは低下します。目的に応じて、適切なトレードオフを行う必要があります。
   3. 画像圧縮を選択します: 対数 (高)、平方根 (中)、または線形 (低)。または、コントラスト範囲を自動またはスライダーを使用して手動で調整し、コントラストの高いオプションと低いコントラストオプションを使用します。
      注: データは、画像圧縮の選択の影響を受けません。リアルタイムイメージングの表示にのみ影響します。
   4. [グレー] オプションをオンにして [カラー マップ] スケールを黒から白に選択するか、[ホット] をオンにして赤みがかった黒から黄色にスケールを選択します。
7. 平面の選択 (図 2B)
   1. 解剖学的ランドマーク上のイメージング平面を選択します。ドップラーとBモードの視覚化を切り替えて、肝臓葉と血管系の解剖学的構造に精通します。
   2. ライブビューを停止するには、 停止 アイコンをクリックします。
   3. [プローブの移動]メニューに移動してプローブをナビゲートし、[ ホームの設定 ]をクリックして平面を選択し、座標を参照位置として保存します。血管ツリーが明確に定義され、面外信号ができるだけ少なく見えていることを確認します。
   4. メニューに戻り、ライブビューをクリックし、 停止 アイコンをクリックします。

3. ドップラースキャン取得 (タイミング ~ 20分)

1. ドップラー集録を 10 ミリ秒のフレームレートで開始します。
   1. fUS 2Dメニューに移動して、特定の位置での経時的な血行動態の変化を画像化します(図3)。コントラストを上げるには、50μLのボーラスを静脈内(iv)に注入したマイクロバブルを2 x 10 8マイクロバブル/mLの濃度で尾静脈に投与します。.
   2. プリセットタップで、合計録音時間を秒単位(30秒)で定義します。画像間の一時停止がない連続モードを選択するには、画像間の時間 を 0 秒に設定します。
   3. 録画ボタンを押して、2D集録を開始します。録音は、停止ボタンを押すことでキャンセルできます。取得が完了する前に中断されると、データが失われる可能性があります。
2. 集録した録音を視覚化して適応させます。
   1. 必要に応じて、タップ ビジュアライゼーションでコントラストとカラーマップを変更します。必要に応じて、機能時間に含まれているスライダーでフレームをスクロールして、録画を再生します。
3. データを保存します。
   1. 取得した録音の名前を指定して、ファイルをセッションフォルダに.scan形式で保存します。データを保存するためのポップアップウィンドウは、各録音の最後に自動的に提案されます。データは自動的に保存されます。
4. [プリセット]タブをクリックして別のアクイジションを開始し、ステップ3.1.1以降を繰り返します。
5. イメージングセットアップを取り外し、動物の世話をします。
   1. [プローブの移動]メニューに移動して、プローブを3Dプリントされた水タンクの外側に垂直に移動します。セットアップと超音波ジェルを取り外し、動物を固定解除します。
   2. 実験計画が終点に達したときに動物を安楽死させます。それ以外の場合は、次の手順に進みます。
   3. 縦方向の測定が意図されている場合は、動物の剃った皮膚領域に保湿クリームを塗ります。
   4. 動物をケージに戻し、低体温症を防ぐためにヒートランプの下で麻酔から目覚めさせます。回復中は動物を監視します。
   5. 動物が再び普通に歩くようになったら、動物を個別に換気されたケージラックに戻します。データセットを分析する前に、実験室の動物実験を完了してください。

4. 定量分析(タイミング~1時間)

1. 補足ファイル1にある解析スクリプトgui_analysis.mを開きます。
2. スキャンを選択し、設定で定量的パラメータを設定します:ボクセルサイズが2 x 2の10の関心領域(ROI)。各フレームに 40 ミリ秒を選択して、ドップラー積分を実行します。
3. 臓器の血管周辺を描きます。10個のROIは、はっきりと見える動脈の間に自動的に事前に配置され、必要に応じて手動で調整できます(図4A)。配置に問題がなければ、フローティングダイアログボックスを閉じます。安定した取得(図4B)により、堅牢な血液量計算を実現し、強い運動アーチファクト(図4C)の影響を受けない取得を回避します。
4. 30秒の記録内の静かなフレーム値の平均と標準偏差を自動的に推定することにより、合計10のROIのA.U.での平均肝臓の血液量を定量化します(図4D)。
   注:ROIの強度のデータテーブルは、スプレッドシートファイルに直接コピー/貼り付けることができます。
5. 尾側方向に少なくとも 2 つの追加平面 -0.3 mm と -0.6 mm について解析を繰り返します。統計解析を実行する前に、すべての集録データを定量化します。
6. 画像全体の強度の標準偏差を確認し、モーションアーチファクトの影響を受けやすい測定値を客観的に除外するために、2つの標準偏差(2σ)を持つ全体平均(μ)としてカットオフを決定します(図4E)。
   注:画像全体で推定されたクワイエットフレーム値の平均と標準偏差は、データテーブルの最初の行に記載されています。
   注意:モーションアーティファクトは堅牢な定量化を妨げるため、時間画像全体の分析に基づいて客観的に特定する必要があります。
7. ステップ 4.3 で、動物あたり 30 ROI で 3 つの異なる平面で定量化されたすべての平均肝臓血液量の平均を取ります (図 4F)。統計解析ソフトウェアでROUTテスト1%を適用して、外れ値のROIを特定し、動物あたり平均30のROIを算出します。血液量の推定を改善するには、動物ごとに追加の平面を記録します。
8. ビヒクル治療を投与するには、注射部位、すなわち腹部の右下または左象限をガーゼと70%エタノールを使用して消毒します。.27Gの針と1mLの使い捨て注射器または30Gのインスリン注射器で20μLの生理食塩水またはDMSO IPを注入するか、先端が丸い再利用可能な栄養針30Gを使用して強制経口投与により100μLの(ヒドロキシプロピル)メチルセルロースを投与します。生理食塩水またはDMSOを投与された3つのコホートのデータを、セルロースのIPまたは経口投与(po)でプロットします(図4G)。状態や治療を受けたことを明らかにせずに、ブラインドな方法で分析を行います。
   注:車両管理は血液量の測定に影響を与えません。

結果

プロトコルに従って、解剖学的構造の標準化と対応する用語に基づいて、肝臓血管系のイメージングが容易になります(図1)。前臨床肝臓モデルを使用する研究者向けの標準化された命名法を提案するために、マウスの腹腔内の一般的な肝臓の位置を概略的に表示し(図1A)、さまざまな肝葉の構造配置を提供し(図1B)、動脈血管網を特定しました(図1C)。解剖学の専門知識を備えた in vivo UFUSイメージングは、3Dプリントされた水タンクを利用して、動きのアーチファクトを減らして行われました(図2A)。音響インピーダンスは、プローブを水に導入し、超音波透過ゲルを動物の削った皮膚に直接適用することによって補正されました。この設定を採用することにより、プローブが動物の動いている胸部や腹部に直接接触しないため、呼吸やその他の動きのアーチファクトが減少します。このようにして、表在する位置からUFUSから容易にアクセスできる左右の葉の血管構造を可視化しました(図2B)。尾状葉や方形葉などの他の肝葉は体のより深い位置にあるため、UFUSによって肝臓の血管系を適切に解剖学的に特定することはより困難になります。

標準化され、一般的に受け入れられている解剖学的適応症と血管構造の解釈の重要性を実証したため、マウスの造影UFUSによって画像化された肝臓血管系の包括的な概要を提供するために、さまざまな平面で複数のドップラースキャンを実施しました(図3)。個々の肝葉、すなわち左外側葉(LL)、左内側葉(LM)、右外側葉(RL)、および右内側葉(RM)の肝動脈網を描写した。さらに、腹部大動脈(AA)、肝動脈(HA)、左外側肝動脈(LLHA)、右内側肝動脈(RMHA)などの主要な動脈がラベル付けされています。肝葉は、小腸(SM)の配置と蠕動運動、および胃(S)の充填状態によってわずかに異なる位置にある可能性があることに注意することが重要です。このマウス肝臓血管系全体のコントラスト増強された概要は、UFUSによる in vivo 肝臓イメージングのための包括的な血管アトラスを提供します。

解剖学的平面の正確な選択は、1つの肝葉から得られる定量的な読み出しを得るために重要です。平面ごとに10の関心領域(ROI)を手動で選択することにより、堅牢な血液量測定を実現できます(図4A)。微小循環の血液量を確実に定量化するには、平均画像強度の変動が少ない安定した取得が必要です。これは、経時的な画像全体の平均画像値(MIV)に基づいて決定され(図4B)、大きなモーションアーチファクトの影響を受けやすい記録(図4C)とは対照的です。モーションアーチファクトを処理するために、低MIVの自動選択を使用して、画像全体のすべての時間的低MIVの標準偏差をプロットすることにより、肝臓の血液量測定値(図4D)を確実に定量化しました(図4E)。動物あたり複数の平面のドップラースキャンは、ROUTテストが1%の動物あたり30ROIで外れ値処理後の3つの異なるコホートのマウス内およびマウス間で許容可能な内変動および相互変動を示しています(図4F)。動物あたりの血液量の推定値を改善するには、追加の平面を記録するか、平面ごとに選択されるROIの数を増やすことをお勧めします。さらに、血液量の測定値は、特に微小血管系を対象とした薬物治療のモニタリングに使用できます。2 つの投与ルートを通じて車両を投与することにより、肝臓の血液量の測定値に影響を与えないことを実証しました (図 4G)。これらの結果は、遺伝子の欠失または治療の送達がビヒクル投与の影響を受けないことを示しており、堅牢な実験デザインを保証します。全体として、客観的で再現性のある定量的プロトコルが、さまざまなマウスモデルの肝血管欠損を調査するための将来の研究に提供されます。

図1:マウス肝臓の解剖学。 (A)マウスの横隔膜の下の腹腔内の肝臓の位置の概略図の概要。(B)左葉、方形葉、尾状葉、右葉の4つの肝葉を持つマウス肝臓と、門脈、肝動脈、胆管からなる門脈トライアドの概略的説明。(C)触覚血管系の動脈ネットワークの概略図。ラテン語の命名法による肝動脈 (HA) と枝 (ラムス) の同定。略語:HA =肝動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マウスの肝臓血管系の超高速ドップラー超音波(UFUS)イメージング (A)非侵襲 的in vivo イメージングの実験セットアップの概略図概要。(B)UFUSによって画像化された、左右の内側葉、および左外側葉のイメージング方向と関連する代表者の概略図。略語:AA =腹部大動脈、LLL =左外側葉、LML =左内側葉、RML =右内側葉。スケールバー = 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マウス肝血管系の代表的な造影超高速ドップラー超音波(UFUS)。 成体マウスの肝血管系全体を、頭蓋から尾側までの4つの平面で、右側、内側、左側左の3つの位置で画像化した。基準は、左右の内側と外側 1 cm で画像化された横隔膜の真下にあり、尾側方向に同じ平面があります。略語:AA =腹部大動脈、HA =肝動脈、LLL =左外側葉、LLHA =左外側肝動脈、LML =左内側葉、RLL =右外側葉、RMHA =右内側肝動脈、RML =右内側葉、SI =小腸、S =胃。スケールバー 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:超高速ドップラー超音波(UFUS)による肝臓の血液量の定量的測定(A)ダイアフラムの下で選択した平面1(0 mmに相当)、平面2が-0.3 mm、および平面3が-0.6 mmに相当し、10の関心領域(ROI)を選択した成体C57BL/6野生型対照マウスの内側葉(ML)の代表。スケールバー1mm。(B)安定取得(灰色)と(C)組織運動(赤)の組織運動(赤)を、全体像の任意の単位(AU)の平均画像値に基づいて定量的評価するための30代のパワードップラーのイラスト。(D)経時的な定量的な血液量測定のための低強度(AU)の自動認識。(E)運動アーチファクトによって引き起こされる不安定な取得(赤)を特定するためにプロットされた低強度の標準偏差(St.偏差)は、3つのコホートからの動物の数(N)からの全体的な平均(μ)のカットオフによって示され、2つのSD(2σ)の低強度の標準偏差(SD)の生理学的条件(灰色)の評価により示されます成体のC57BL / 6野生型対照マウス。(F)in vivoで測定された血液量の経時変化の定量化は、3つの平面で平均され、すなわち、動物あたり合計30ROIであり、ピクセル強度(A.U.)で表されます。ROUTテストによる外れ値検出 1%。(G)配送車両の種類と管理ルートに違いはありません。コホート 1 (n=6) は生理食塩水の腹腔内 (ip) 注射を受け、コホート 2 (n=3) は DMSO の ip 注射を受け、コホート 3 (n=6) はセルロースの経口投与 (po) を受けました。ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析 ns P > 0.05。略語:AU =任意の単位、DMSO =ジメチルスルホキシド、ip =腹腔内、po =経口投与、ROI =関心領域、St.偏差=標準偏差、UFUS =超高速ドップラー超音波。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:肝臓の血液量測定の超高速ドップラー超音波(UFUS)定量的スクリプト。 Script gui_analysis.mは、血液量測定のための関心領域(ROI)の自動位置決めのためのグラフィカルインターフェースを提供します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルでは、マウスの肝臓血管系の非侵襲的なUFUSイメージングを実行する方法を示します。動物の取り扱い、超音波スキャナーの操作、 および生体内での血液量の変化を計算するためのデータ分析を含むイメージング手順の詳細な説明を示します。超音波データの解釈を容易にするために、UFUSで明確に視覚化できる解剖学的構造の包括的な概要を提供します。さらに、血管パラメータのロバストな測定のための標準化された定量化手順について説明します。造影剤を使用せずに適切な分解能を達成することができ、微小循環の肝臓の血液量を安全かつ簡単に定量的に評価することができます。私たちは、特に微小血管系の定量的測定を評価する際に、混乱や誤解を防ぐために、標準化された解剖学的命名法の使用を強調しています。

マウス血管系のUFUSイメージングは、主に神経科学の分野で以前に報告されています⁷。脳のイメージングは、呼吸の動きに非常に敏感な肝臓とは異なり、運動アーチファクトによって悪影響を受けません。横隔膜の下の解剖学的位置にあるため、腹部の脱毛は、胸部と腹部への物理的な力を最小限に抑えて不規則な呼吸を導入しないように、非常に穏やかに行う必要があります。さらに、適切な程度の麻酔を行うことは、後処理ステップで比較的簡単に修正できる要因である定期的な振動呼吸を確保するために不可欠です。ここでは、特異値分解(SVD)フィルタを適用してモーションアーチファクト⁶ を除去し、さらに高モーションフレームを打ち切ることにより、UFUSの感度が向上しています。ここでは、高フレームレートのパワードップラームービーを10msで取得し、モーションアーチファクトにより高値のピークを生成したフレームに対する呼吸の動きの影響をさらに視覚化して測定することができます。次に、平均画像信号の高速フーリエ変換のピークから呼吸数を特定でき、臓器の高運動に対応する対応するピークフレームを破棄できます。

再現性のある超音波ドップラーイメージングは、1匹の動物内および体重の異なる動物間での経時的な観察と同様に、依然としていくつかの制限に直面する可能性があります。まず、肝臓の位置は、胃の満腹感や腸の蠕動運動などの要因によって影響を受ける可能性があります。この影響は、左外側肝葉を基準として選択する場合に特に顕著です。したがって、大きな動物では左外側葉のみを選択し、小さな動物では右または左内側葉を選択することをお勧めします。第二に、苦痛に苦しんでいる動物では、激しい非振動呼吸運動が発生する可能性があり、その結果、修正が困難な運動アーチファクトが発生し、その結果、血液量の計算に使用できなくなります。したがって、麻酔の適切な選択と、体重に合わせた投与量が重要です。最後に、分解能の限界は、肝臓の微小血管系の視覚化を制限する、すなわち、血管は100mm3までの範囲の直径で視覚化することができる。

造影剤の使用は、マイクロバブルを追跡することによりマウスの血管系の詳細な画像を取得するために最近提案されました。このようなアプローチは、高い空間分解能を達成し、定量的な血流速度測定¹⁷を提供することができる。しかし、マイクロバブルの追跡は、特に2Dで取得した場合、内臓を動かすために非常に困難です。

本研究では、超高速ドップラーによる安定した肝臓の血液量の測定値が、ip注射または経口強制経口投与を受けた3つのコホートの対照マウスで取得できることを示しました。最近、このような血液量の測定が肝臓病モデルマウス¹⁶で成功裏に使用されました。具体的には、血管の膨張を電子顕微鏡レベルで検出し、UFUSを用いた定量的測定によって確認しました。この研究では、肝血管構造が保持されている場合でも、機能的および定量的レベルで血管欠損を調査する ためのin vivo 評価の感度が強調されており、これは臨床診断とモニタリングに有望です。

要約すると、このプロトコルは、マウスの肝血管系の非侵襲的定性的および定量的研究のガイドとして機能します。また、非侵襲的で簡単な手順により、縦方向のフォローアップにも使用できます。さらに、血管の機能評価を提供する可能性を秘めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(ヒドロキシプロピル)メチルセルロース HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0.5% HPMC
遠心分離機 ZentriMix 380 R	Hettich	3200
遠心分離チューブ 50 mL 円錐形 滅菌ポリプロピレン	CELLSTAR チューブ	227 261
コットンチップ	Meditip Clean	G80215
社内			脱イオン水
毛クリーム	近くのドラッグストア
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ	D2650-5X5ML	滅菌
エタノール絶対	フレゼニウスKABI	010-0622-1
給餌針、再利用可能な	FSTファインサイエンスツール	18064-20
細い先端の鉗子 デュモン#5鉗子	FSTファインサイエンスツール	11252-00
ガーゼパッド 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Version 9
GUI 分析スクリプト	Inserm	gui_analysis.m	は 10 ms ドップラースキャンが必要
加熱パッド 17 x 17 cm、6 W	ThermoLux Acculux	461265
インスリン注射器 30G 0.30 x 8 mm、0.3 mL および 0.5 mL	BD Microfine + Demi	25636
ケタミン Anesketin	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
キムワイプ KIMTECH 低糸くずのワイパー	ULINE	S-8115
ラボテープ 19 mm x 50 m x 0.125 mm	Stokvis	M451
MATLAB ソフトウェア	MathWorks	Version R2022b
ストア			保湿クリーム
ニードルイエロー 30G 0.3 x 13 mm	BD Microlance	304000
眼科用軟膏 Oculentum Simplex	追加 医薬品	220201
社内			のペーパーティッシュ
永久実験マーカー	VWR	52877-310
生理的塩溶液 (NaCl 0.9%)	FRESENIUS KABI		B102986 滅菌
シャープス 使い捨て容器 Medical Dispo 2.5 L	APmedical	UN3291
滅菌セーフロック 1.5 mL チューブ	Eppendorf	0030 120.086
シリンジ 1 mL	BD Plastipak	303172
シリンジ 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
タイマー	ウェストベン	40053
トリマー	Exacta Aesculap	GT416
超高速超音波プラットホーム	Iconeus & INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus	10msシーケンスの
超音波透過ゲル Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
水タンク 3D プリント 10 x 10 x 1.5 cm ポリメチルペンテン (PMP) 0.125 mm	GoodFellow ケンブリッジ限定	ME311100/2	CAD ファイル ご要望に応じて
キシラジン セダムン	Dechra	REG NL 10084	20 mg/mL