方法論記事

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

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DOI：

10.3791/66795

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2024年10月4日

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1Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, Center for Research in Transplantation and Translational Immunology, UMR 1064, 2CHU Nantes, Nantes Université, Department of Pediatric and Congenital Cardiac Surgery, 3Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, CNRS, BioCore, SFR Bonamy

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、胸腺上皮細胞(TEC)の成熟と長期維持、およびin vitroでの胸腺形成をサポートすることを目的とした、3Dフィブリンハイドロゲルで増殖したヒトiPS細胞由来胸腺オルガノイドの形成に関するプロトコールについて説明します。

要約

機能的で自己耐性のあるT細胞レパトアの生成は、胸腺微小環境、そして主にその細胞外マトリックス(ECM)の特性に依存する複雑なプロセスです。胸腺形成において、胸腺形成細胞(TEC)は、自己反応性クローンをろ過することにより、発達中のT細胞を育成し、選択するために重要です。TECは、ECMによって提供される物理的および化学的手がかりに特に敏感であることが経験的に実証されており、古典的な単層細胞培養は、それらが死ぬまですぐに機能を失います。この繊細なメンテナンスと相対的な希少性が組み合わさり、in vitroでの胸腺生物学のモデル化には大きなリスクがかかっているにもかかわらず、TECのニッチを大規模かつ長期的に忠実に模倣できるモデルはまだ不足しています。ここでは、TECコンパートメントがヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来し、3次元(3D)フィブリンベースのハイドロゲル中で初代初期胸腺細胞前駆細胞と再凝集した、多細胞ヒト胸腺オルガノイドモデルの形成について説明します。このモデルは、胸腺微小環境を生体外で再現し、T細胞を産生し、数週間にわたって胸腺オルガノイドの成長をサポートする機能を示すスケーラブルな培養システムに対する現在のニーズに応えます。したがって、iPS細胞由来オルガノイドを介した胸腺機能の実用的なin vitroモデルを提案し、TEC生物学とex vivoでのT細胞生成の研究に役立ちます。

概要

胸腺は、有能で寛容な免疫系の生成に不可欠な役割を果たす主要なリンパ器官です1,2,3。初期の胸腺前駆細胞(ETP)は、骨髄から胸腺に移動し、そこで増殖して機能的なT細胞に分化します1,2,4,5。これらのプロセスは、特殊な集団である胸腺上皮細胞(TEC)2,6,7によって媒介されます。TECは胸腺上皮前駆細胞(TEPs)8,9に由来し、皮質TEC(cTEC)と髄質TEC(mTEC)から構成され、T細胞の遊走、増殖、成熟に必要な特殊な3D微小環境を作り出す上で特定の役割を果たします。TECは、主に増殖因子および分化因子1,10,11を提供することにより、また自己抗原5,7,12の提示を通じて非機能的で非耐性の胸腺細胞を否定的に選択することにより、T細胞の発生を媒介する。発生中のT細胞とTECとの間の複雑な相互作用は、胸腺クロストーク1,11として知られるプロセスにおけるTEC集団の成熟と3D組織化においても中心的な役割を果たします。胸腺の細胞集団間の相互作用は、細胞外マトリックス(ECM)によって形成される特定の微小環境に深く依存しています。胸腺ECMは、胸腺細胞集団と動的に相反する状態にあり、遺伝子調節に影響を与え、酵素またはマトリックスタンパク質の分泌によって絶えず再形成される13。ECMは、成長因子やサイトカインのバイオアベイラビリティの修飾、インテグリンなどの膜結合受容体を介した直接的なシグナル伝達、および物理的な力による細胞骨格の形成を通じて細胞に影響を与える14。コラーゲンやラミニンなどの胸腺ECM成分は、TECの維持や複合体の形成による固定に重要な成長因子TGFbおよびFGFに対して高い親和性を持つことが示されています。胸腺ECMの可塑性、弾性率、および密度も、TECの運命を指示し、その機能に不可欠な胸腺の区画化を形作る上で重要な役割を果たします。これらの手がかりは、ECMとその3D構造を考慮に入れて、生体外で胸腺を模倣することの重要性を強調しています。この点は、初代TECが古典的な細胞培養セットアップ15,16,17で培養すると、急速に脱分化し、その機能を失い、最終的には死滅するという事実によって裏付けられている。

培養モデルは、ECMの構造とそれがTECに提供する重要な手がかりを保存するために、ヒト胸腺外植片から機能的なTEC集団を拡大するために開発されました18,19,20。この培養システムは、in vitroで機能的なTECの集団を成功裏に拡大および維持することができたが、培養の7〜8日を超えて維持することができなかった18。したがって、胸腺微小環境とその機能をin vitroおよび長期的に再現できる、アクセス可能で実用的な3D培養システムの開発は、この分野で重要な課題です。近年、ハイドロゲルベースの3D培養システムの開発により、いくつかの人工胸腺オルガノイドシステムが登場し、in vitro胸腺モデリング15,16,21,22の大きな進歩を構成しています。私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するヒトTEPとヒト初代ETPをスフェロイドに再凝集させ、フィブリンハイドロゲル上に播種することにより、ヒト胸腺オルガノイド(hTO)共培養システムを開発しました。

この研究における材料とヒドロゲルのセットアップの選択は、実用性とプロセスをスケールアップして実験のための手頃な価格で豊富な材料源を得る能力を維持しながら、胸腺ECMのネイティブ構造を再現することを目的としていました15。このhTOシステムは、多系統分化の可能性を示し、ETP23からの生産的な胸腺造設をサポートすることができます。このオルガノイドシステムは、胸腺内細胞相互作用の研究や、正常および病理学的なヒトリンパ球形成のモデリングのための信頼性の高いツールを構成しています。また、iPS細胞を用いることで、遺伝子編集機能をモデルに導入しています。iPS細胞の機能性胸腺組織への効果的な分化は、過去15年間、この分野の長年の目標であり、TEC系統の運命シグナル伝達21,24,25,26,27の解読により大きな進歩が見られました。このようなin vitro 3D胸腺モデルの必要性に応えるために、このテクニカルノートでは、ヒドロゲル足場の形成、細胞の微量再凝集と播種、オルガノイドの培養と収穫に焦点を当てて、iPS細胞由来のヒト胸腺オルガノイドを段階的に作製する方法と技術的詳細について説明します。

プロトコル

hiPSC株hiN.Fm.m.Lon71.019は、成人の男性線維芽細胞から作製し、mRNAトランスフェクションによって再プログラムされました。hiPSC系統hiN.Fm.f.Lon80.002は、女性の成体線維芽細胞から作製し、mRNAトランスフェクションによって再プログラムされました。hiPSC系統hiN.Fs.f.MIPS203.003は、女性の成体線維芽細胞から作製され、組換え仙台ウイルスベクター感染によって再プログラムされました。すべての細胞株はNantes iPSCプラットフォームから提供されました。患者は、自分の細胞を研究目的で使用することについてインフォームドコンセントを与えました(匿名化コレクション、ロンザ、猫#CC-2511)。一次ETPは、同日にナント病院(CHU Nantes)で小児心臓手術を受けた患者から匿名化された廃棄廃棄物として得られた出生後のヒト胸腺サンプルを解離することにより、宣言DC-2017-2987に基づくフランスのCOCOH規制に準拠して分離されます。

1. iPS細胞のTEP同一性に向けた方向転換

注:LaiとJinが発表した最初の研究が、マウス胚性幹細胞(EScs)の胸腺上皮同一性28への分化を実証して以来、いくつかの研究が、ヒトiPS細胞のTEP同一性21,24,25,26,27,29への指向性分化を説明するプロトコルを開発し、最適化してきた.これらの研究は、FOXN1やPAX9などの胸腺上皮同一性マーカーを発現するTEPと、DLL4やAIREなどの機能性マーカーを発現するが、TEC成熟マーカー24,25を欠くTEPの分化につながる 24,25.分化したTEPの成熟したTEPの成熟性への成熟を支持する2つのアプローチが示されている:マウス29などのin vivoモデルへの移植と、気液界面セットアップ21で培われた3D胸腺オルガノイドシステムへの再凝集である。どちらのシステムも、in vivoまたはin vitroのTリンパポーシス15,24,25,31を支えることができる機能的なTEC集団の成熟を維持および支持する上で、3D構造が果たす重要な役割を実証しています。

  1. この研究で使用した胸腺オルガノイドシステムでは、Provin et al.23で開発および詳述されているプロトコルに従って、iPS細胞のTEP同一性に向けた分化を行います。

2. 小児胸腺サンプルからの一次ETPの単離

注:ETPは、T細胞系統と胸腺内の樹状細胞を生じさせ、次の表現型を示す骨髄由来の前駆細胞です:CD3-CD4-CD8-CD14-CD19-CD56-CD45+ CD34+ CD7+32,33。

  1. 枯渇ビーズの調製
    1. 前日、磁気細胞単離ビーズ(材料表)を15 mLチューブに移し、4 mLのアイソレーションバッファー(PBS + 0.1% BSA + 2 mM EDTA)で洗浄します。
    2. チューブを磁気スタンドに入れ、上清を取り除き、2 mLのアイソレーションバッファーを加えます。
    3. マウスの抗ヒトCD3、CD4、およびCD8抗体をビーズに添加し、撹拌下で4°Cで45分間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに置き、アイソレーションバッファーで数回洗浄し、20 mLのアイソレーションバッファーに再懸濁します。
  2. 胸腺サンプルの解離
    1. 新鮮な胸腺サンプルをRPMI1640で満たされたシャーレに移します(材料の表)。滅菌解剖ハサミとペンチで約1mm3 の大きさに切ります。
    2. 25 mLピペットで培地とフラグメントを数回洗い流し(培地が濁るはずです)、フラグメントを沈殿させて培地の半分を50 mLチューブに集めます。メディウムをさらに追加し、メディウムが透明になるまで繰り返します。
    3. 培地を必要な数の50 mLチューブに集め、チューブを200 x g で5分間回転させます。
    4. 上清を取り除き、ペレットを10 mLの赤血球溶解液に再懸濁します(材料の表)。室温(RT)で5分間インキュベートし、20 mLの洗浄バッファー(PBS + 0.5% BSA + 4 mM EDTA + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)を加えます。
    5. 200 x g で5分間遠心し、上清を取り除きます。ペレットを10 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、70 μmメッシュフィルターで濾過し、細胞をカウントします。
  3. ETPエンリッチメント
    1. 細胞をカウントした後、洗浄バッファーを使用してチューブあたり容量を10 mLに調整します。必要な量の細胞単離ビーズを添加し(2億個の細胞あたり、20mLの単離バッファーに500 μLのビーズを使用)、4°Cで30分間撹拌しながらインキュベートします。
    2. チューブを磁気スタンドに2分間置き、上清をきれいなチューブに慎重に集めます。チューブを取り外し、20 mLのアイソレーションバッファーでビーズを洗浄します。チューブをボルテックスし、磁気スタンドに戻し、上清を収集します。この手順を 2 回繰り返します。
    3. 上清を200 x g で5分間回転させます。ペレットを2mLの分離バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。
  4. ETPアイソレーション
    1. 濃度を2億細胞/mLに調整し、未染色コントロールとして少量を回収します。
    2. マウス抗ヒト系統(Lin)(CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56)、CD7、およびCD34抗体(すべてのLinマーカーに同じ蛍光色素を使用)で細胞を標識します。4°Cで45分間インキュベートします。
    3. 等量の洗浄バッファーで細胞を洗浄します。細胞を200 x g で5分間回転させ、ペレットを1 mLに再懸濁し、細胞をカウントします。
    4. 容量を5,000万細胞/mLの濃度に調整し、70μmメッシュフィルターで細胞を濾します。
    5. 選択した生存率マーカーを添加し、70 μmノズルを使用したフローサイトメトリーにより、生きたLin-CD34+ CD7+細胞を選別します。

3. 3D胸腺オルガノイド培養

  1. TEPの準備
    1. ETP単離の直後に、13〜15日目にTEP培養の品質を制御します。細胞がコンフルエンスに達し、膨らみのある密集した単層を形成することを確認します(図1)。
    2. 分化したTEPを回収するには、細胞をDPBS-/-で洗浄して除去し、ウェルごとに1 mLのTrypLE(Table of Materials)を加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。
    3. ウェルあたり1 mLのXVIVO10(Table of Materials)を添加し、複数回フラッシュして細胞を剥離し、15 mLチューブに移し、200 x g で5分間遠心します。
    4. 上清を取り除き、ペレットを1mLのXVIVO10に再懸濁し、細胞をカウントします。
      注:分化の有効性を事前に評価するには、培養ウェルを別々に使用し、RT-qPCRによる FOXN1 と PAX9 の発現、およびフローサイトメトリーによる分化収量(EPCAM+ CD205+細胞の画分として計算され、50%以上である必要があります)を確認します(図1)。分化のこの段階では、ほぼすべてのEPCAM+細胞もCD205に対して陽性であり、その前駆体の同一性が証明されています11。
  2. ETP準備
    1. ETP単離後すぐに、収集チューブを200 x g で5分間回転させます。ペレットを1mLのXVIVO10に再懸濁し、細胞をカウントします。
  3. 胸腺オルガノイドの凝集
    1. 適切な容量をピペットで掌握し、両方の細胞懸濁液を1mLあたり2,00,000 TEPと40,000 ETPの濃度でプールし、一度ピペットで静かに上下させて均質化します。
    2. 表1に従って適切なサプリメントを添加し、低結合Uボトム96ウェルプレートに1ウェルあたり100μLの混合細胞懸濁液をプレート化します。マルチチャンネルピペットを使用して出力を増やします。しかし、従来のシングルチップピペットは、貴重な細胞の量の損失を制限します。プレートを37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします。
  4. ハイドロゲルの調製
    注:ヒドロゲル形成、オルガノイド播種、および培地の分配に使用される実験セットアップを 図2に示します。
    1. 翌日(オルガノイド培養期の1日目)に、トロンビン(10 U/mL)、アプロチニン(26,000 U/mL)、フィブリノーゲン(8 mg/mL)のアリコートを解凍します(材料表)。トロンビンとアプロチニンを氷上で解凍し、フィブリノーゲンを37°Cの水浴で解凍します(沈殿するので氷の上に置いないでください)。ボルテックスではなく、アリコートをボンネットの下に置き、穏やかなピペッティングで均質化します。
    2. 表2に示す比率に従って、作製したオルガノイドの数に必要な数のハンギングインサートを準備します。滅菌ペンチを使用してインサートを培養ウェルにセットし、培養プレートに少なくとも1つの列または行を空にしておきます。
    3. キャストするゲルと同じ数の1.5mLチューブを準備します。各チューブで、 まず表2に詳述されているように、必要量のフィブリノーゲンとアプロチニンをピペットで移します。
    4. 2回目には、必要な量のトロンビンを1本のチューブに加え、気泡を作らずに2回すばやく洗い流して試薬を均質化した後、チューブの内容物全体を引き出し、混合物を吊り下げインサートにすばやく洗い流します。ピペットをインサートの中央より上に垂直に置き、気泡を発生させずに試薬混合物を静かに洗い流します。
      注:このステップでは、試薬は数秒で重合するため、実行速度が重要であり、ゲル内の塊や密度の不均一の形成を避けるために、試薬を正しく混合することが重要です。ウェルごとに異なる1.5 mLチューブを使用して、一度に1ウェルずつ進めます(チューブを複数のウェルで再利用する場合、残っている固体ゲルの塊がピペットの先端を塞ぐ可能性があります)。トロンビンの活性が高いために重合が速すぎる場合は、1:2の希釈を使用してください。キャスティング直後のゲルは透明からわずかに半透明でなければならず、プレートを垂直に傾けると数秒後もまだ流れます。
    5. 透明溶液が固化して不透明な白に変わり、プレートを垂直に傾けたときにゲルがしっかりと固定されるまで、37°Cで少なくとも1時間インキュベートします(図2A)。
  5. オルガノイド播種
    1. 集計ステップの品質を確認します。マイクロマスが球状の細胞塊を形成し、コンパクトなコアが低密度のETPハローに囲まれていることを確認します(図3)。
    2. P200コーンの先端を切り取り、付着防止液で洗います(材料表)。細胞塊を回収するには、プレートをほぼ垂直な位置に傾けます:マイクロ塊はウェルの下壁に沈み、吸引しながらピペットの先端をウェルの底に徐々に押すことで簡単に回復できます。
    3. 表1(図2B)に示されている比率に従って、ピペットチップでゲルに触れずにハイドロゲルを繊細に堆積することにより、ハイドロゲルの上部に塊を播種します。この段階ではオルガノイドが自由に浮いているように見えても、培地で膨潤させるとゲルが柔らかくなり、オルガノイドは上層に寄り添います。顕微鏡でP96ウェルにオルガノイドが残っていないことを確認します。
    4. 表1および表2に従って必要量の培地を調製し、各ウェルで、インサート壁に沿ってピペッティングすることにより、ハイドロゲルの上部に触れずに容量の4分の1をゆっくりと追加し、残りの4分の3をウェルの下部にピペットを吊り下げインサートのアームの間に配置して追加します(図2C)。
    5. 空の培養ウェルにPBS1 mLを入れて、プレート内の湿度を維持します。37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。
  6. 胸腺オルガノイド培養
    1. 2日目に、オルガノイドが十分に播種されているかどうかを確認します:ヒドロゲルが所定の位置に留まっていること、およびオルガノイドがインサートの底に沈殿していないこと。
    2. 表1および表2に従って、必要な量の培地を調製します。吸引コーンの先端を吊り下げインサートのアームの間に向け、ゲルに触れないようにして、培地を取り出します。同じ方法でピペットを配置して、新しい培地を追加します。
    3. 培地を2日ごとに交換し、2〜4日後(TEP分化開始後18日目)に第2相培地(表1)に切り替えます。
      注:オルガノイドバッチは、この方法で最大6週間培養に維持できます。
  7. オルガノイドの収穫
    1. ウェルごとに1 mLのTrypLEが入った15 mLのチューブを調製して収穫します。
    2. P1000コーンの先端をカットし、付着防止液でコーティングします。ピペットチップをインサートの中央に垂直に置いて(メンブレンに穴を開けないように注意して)、ゲルを優しくピペットで動かし、TrypLEチューブに移します。インサートのメンブレンをTrypLEで洗浄し、チューブにも移します。
    3. 37°Cで15分間インキュベートし、5分間隔で穏やかにボルテックスします。ゲルとオルガノイドが解離していることを確認します。
    4. 15分後、70 μmメッシュフィルターでひずみし、200 x g で5分間遠心します。ペレットを洗浄バッファーに再懸濁し、選択した分析法に進みます。

結果

このプロトコルのワークフローを 図 4 にまとめます。この3Dオルガノイド培養モデルでは、物理的および機械的な手がかりを提供したおかげで、私たちのチームが以前にマウスの一次mTECを数日間維持するために使用していたトロンビンとフィブリノーゲンのハイドロゲルを採用しました34。重合後、ゲルは緩いスポンジのようなメッシュ構造を示すはずです(図5)。

最初の播種および付着段階の後、オルガノイドはゲルの表面および最上層の両方で徐々に成長し、発達しました。ゲルの特性、播種条件、およびゲルに播種されるオルガノイドの数に応じて、オルガノイドは球状から長方形の構造(図6)を形成し、時には融合してより大きな構造を形成します。培養の最初の週の後、オルガノイド内で組織の2つの特定のサブレベルが観察されました:まず、オルガノイドから照射され、ハイドロゲルを全方向にコロニー形成する大きな細胞によって形成される長い細胞表面投影様構造を観察しました(図6 および 図7)。次に、その細胞突起の周りに小さな細胞が集中して形成されるクラスター状の構造を観察しました。研究仮説を確認するために両方の細胞タイプを分離することはできませんでしたが、この現象は、胸腺皮質内に見られる3D配列を彷彿とさせます。これは、個々のcTECと胸腺看護師細胞複合体として知られる多数のはるかに小さな発達中のT細胞との相互作用によって形成されます11 (図8)。

オルガノイド培養段階のいくつかの時点で、フローサイトメトリーにより胸腺オルガノイドの細胞組成を評価し、TEC(EPCAM+ CD45-として特徴付けられる)、胸腺細胞(EPCAM- CD45+ CD3+)(図9)、および胸腺造血非胸腺細胞サブセットを含むEPCAM-CD45+ CD3-コンパートメントなど、いくつかの主要なコンパートメントを特定しました。詳細については、Provin et al.23を参照してください。

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図1:iPSCからTEPへの分化特性 評価 (A)D13でのiPS細胞からTEPへの分化の例、逆位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μm.(B)ドットプロットの例、分化14日目のDAPI-細胞中のEPCAM+細胞の割合、FlowJo 10.0.7からの画像。(C)iPSCからTEPへの分化の16日目のDAPI(青)、PAX9(赤)、およびKRT8(緑)に対する免疫染色、免疫蛍光、および共焦点イメージング。白い矢印は抗PAX9染色の例を示しています。スケールバー:50 μm (D) iPSからTEPへの分化中のFOXN1(RQからGAPDH)の発現レベル。TEC:ポジティブコントロールリファレンス、小児胸腺サンプルから単離された一次ヒトTECs。Prism(GraphPadバージョン8.0.1)のグラフ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:ハイドロゲル形成、オルガノイド播種、および培地分配の実験セットアップ(A)ハイドロゲルを吊り下げインサートにキャストした培養プレートを上段と下段に配置した。(B)オルガノイド播種:オルガノイド1個が入ったカットピペットコーンをヒドロゲルに触れずに上に配置し、オルガノイドをゲルの表面に穏やかに播種します。(C)培地は、ピペットの先端を吊り下げインサートのアームの間に配置することにより、培養ウェルに堆積します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:播種前の胸腺オルガノイド培養のD0(全プロトコルの13〜15日目)。 (A)Lon71.019 iPS系統由来のTECで作製したオルガノイド。(B)MIPS203.003 iPS系統由来のTECで作製したオルガノイド。倒立位相差顕微鏡、1000倍。スケールバー:500μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:プロトコルのすべてのステップをまとめたものです。 小児胸腺サンプルを採取して解離し、一次Lin-CD34+ CD7+ ETPをフローサイトメトリーで選別しました。iPS細胞の分化は、TEP同一性を目指して行われました。ETPとiPS由来TEPをプールして低結合の96ウェルプレートに播種し、一晩で胸腺オルガノイドに凝集しました。フィブリンハイドロゲルは、アプロチニン、フィブリノーゲン、トロンビンから調製し、ハンギングインサートにキャストしました。重合後、オルガノイドをハイドロゲルの上に播種し、フェーズ1の培地をウェルに加えました。オルガノイドは、最大6週間培養されました。BioRenderで作成され、出版ライセンスAG26EFCZOM。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:ハイドロゲルの組織と構造。 倒立位相差顕微鏡、1000倍。スケールバー:500μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:成熟したオルガノイドと三次元構造 (A)3D培養24日目の胸腺オルガノイド、MIPS203.003 iPS株。(B)3D培養32日目の胸腺オルガノイド、Lon71.019 iPS系統の合成画像。倒立位相差顕微鏡。スケールバー:500μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図7:胸腺オルガノイドの構造詳細(A)3D培養32日目の胸腺オルガノイド、L71.019 iPS系統。(B)3D培養27日目の胸腺オルガノイド、L80.002 iPS株。倒立位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8
図8:3D培養32日目の胸腺オルガノイドの構造の詳細。 白い矢印は、TEC細胞のすぐ近くで増殖する小さな胸腺細胞のクラスターを示しています。倒立位相差顕微鏡、400倍。スケールバー:500μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:胸腺オルガノイド内のT細胞コンパートメントの割合。 (A)ドットプロットの例、3D培養の35日目の胸腺オルガノイドの生(DAPI-)細胞内のCD45+ CD3+細胞の割合、FlowJo 10.0.7からの画像。CD45+ CD3-画分は、造血非胸腺細胞を含む。(B)3D培養の17日目、24/25日目、32日目、および39/40日目の胸腺オルガノイドの生細胞内のCD45+ CD3+細胞の割合、技術的に重複または三重のn=2、Prism(GraphPadバージョン8.0.1)のグラフ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

単位フェーズ 1 中 14 日目から 18 日目までフェーズ2、中、19日目以降
基XVIVO10XVIVO10
BMP4のng/mL50
FGF8ng/mL10
FGF10ng/mL10
IGF1のng/mL10
EGFのng/mL10
Lランクng/mL5050
IL7ng/mL55
FLT3 Lng/mL55
SCFのng/mL1010
グルタマックスng/mL1%1%

表1:サプリメントとそれぞれの濃度。

アプロチニン(μL)トロンビン (μL)フィブリノーゲン (μL)フェーズ1ミディアムオルガノイド(ユニット)
24ウェルプレート5757513 から 5
12ウェルプレート9.2138.2138.21.85
6ウェルプレート16240.8240.83.28 から 9

表2:6ウェル、12ウェル、24ウェルプレートにハイドロゲルを調製し、オルガノイドを播種するために必要な成分の比率。

ディスカッション

2Dでの古典的な単層培養や、RTOC(Reaggregated thymus organ culture)などのさらに高度な最先端の3Dモデルと比較して、ここで説明するモデルは大幅な改善を示しています。技術的な観点からは、このモデルはTECが自己複製iPS細胞に由来するため、スケーラビリティと再現性が向上しています。また、iPS細胞の段階での遺伝子編集が可能で、TECでのノックインまたはノックアウト研究が容易になります。この研究で示された胸腺オルガノイドの生存率は注目に値し、2DまたはRTOC培養と比較して有意な改善をもたらし、最大6週間でT細胞の生成が実証されています(図9)。したがって、胸腺の3D構造およびECM特性の再構成は、我々の胸腺オルガノイドにおける持続的な胸腺機能、すなわち、最も成熟した胸腺細胞コンパートメント、すなわち最近の胸腺移動者からCD4+およびCD8+の両方のT細胞を産生し、CD4+およびCD8+の両方のT細胞を生成する能力をもたらす23。

胸腺微小環境は激しい拡大と分化活性をサポートするため、適切なガス交換は、どのin vitro胸腺モデルでも重要なパラメータです。実際、改善された結果は、濃縮された二酸素雰囲気または気液界面21,35のいずれかで維持されたモデルで観察されている。私たちの観察結果はこの点を支持しており、ハイドロゲルの上部、空気界面のすぐ下に正しいオルガノイドを播種することの重要性を強調しています。重合の欠陥により粘性から液体のハイドロゲルが発生すると、インサートの底部でオルガノイドが沈み込み、成長が妨げられます。オンチップの内皮細胞との共培養は、血管新生を追加することでこの障壁を打破できる有望な代替手段です。この研究で産生された胸腺オルガノイドのサイズは約5mmに制限されていますが、これはコア領域でのガスと栄養素の交換が不足しているためと言われています。したがって、血管新生は培養のスケールアップを可能にし、プロセスの最適化と組み合わせることで、数百万のTECとT細胞を含むオルガノイドの産生が可能になります。ハイドロゲルの密度も重要なパラメータであり、凍結融解サイクルに対する酵素の感受性を考えると、バッチ間での再現性はプロトコルの主な制限の1つです。ヒドロゲルキャスティングステップは、プロトコールの重要なステップです。計画された実験の1時間前に1つのハイドロゲルをキャストして試験を行い、試薬活性を確認することをお勧めします。酵素活性が不十分で重合が損なわれ、iPSC由来TEPのコストを考えると、新しい試薬アリコートでプロトコールを再開する以外のトラブルシューティングはお勧めしません。TECはECMの重要な生産者です。しかし、胸腺線維芽細胞の役割についての理解が近年進歩していることを考えると、放射線照射された線維芽細胞の集団をオルガノイドモデルに追加することは興味深いかもしれません。この集団は、TECおよびT細胞の分化と維持にプラスの効果をもたらす胸腺環境の再現に関与する成長因子とECMを分泌する可能性があります。この胸腺オルガノイドモデルのもう一つの重要な制限は、適切な皮質髄質の分離が欠如していることです。胸腺の被膜線維芽細胞は皮質の形成を形作ることが示されているため、それらを培養モデルに加えることで、この制限に対処するのに役立つ可能性があります。したがって、このプロトコルは、胸腺の複雑なin vitroモデルの基礎を導入します。これは、iPSC胸腺分化、3Dハイドロゲルベースの培養、およびin vitroリンパ腫の分野における最近の進歩を組み合わせたものです。このモデルは、スケーラビリティに対応し、たとえば間葉系コンパートメントと血管コンパートメントを追加することで複雑さを増すためにさらに洗練できます。したがって、免疫に関する貴重な研究プラットフォームや、個別化されたT細胞ベースの細胞治療への応用につながる可能性があります。

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

フランス・ナントにあるiPSCの中核施設であるLaurent David氏を筆頭に、メンバーに感謝いたします。この研究は、JP-Rare Disease のJTC2019プログラムTARIDプロジェクト（EJPRD19-208、ANR(ANR-19-RAR40011-5)からM.G.への資金提供、La Région Pays de la LoireからM.G.へのRFI Bioregate助成金（ThymIPS)、M.G.へのANR(ANR-22-CE15-0045)による、および「SATT Ouest Valorisation」プロジェクトOrgaTreg to M.G. N.P.の支援を受けて行われました。M.d.A.は「la Fondation pour la Recherche Médicale」の支援を受けました。IBiSAとBiogenouestの支援を受けたナントのiPSC中核施設のリソースと技術サポートの利用に感謝します。この研究は、国立研究開発法人の支援を受けたLabex IGOプログラムから、ANR-11-LABX-0016-01という未来プログラムへの投資を通じて一部資金提供を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アプロチニンSigma Aldrich616370
BMP4Miltenyi130-111-165
CCR7 (CD197)BD BiosciencesPEClone: 3D12;希釈率:1:200
CD14BD BiosciencesFITCクローン:M5E2;希釈率:1:200
CD19BD BiosciencesPEクローン:HIB19;希釈率:1:200
CD205BioLegendFITCクローン:MG38;希釈率:1:200
CD3BD BiosciencesPEクローン:HIT3a;希釈率:1:200
CD34BD BiosciencesFITCクローン:8G12;希釈率:1:100
CD4BD BiosciencesPEクローン:RPA-T4;希釈率:1:100
CD4BD BiosciencesBV711クローン:L200;希釈率:1:200
CD45BD BiosciencesPerCPクローン:HI30;希釈:1:200
CD56BD BiosciencesPEクローン:B159;希釈:1:200
CD62LBD BiosciencesBV605:DREG-56;希釈:1:200
CD69BD BiosciencesBV510クローン:FN50;希釈率:1:200
CD7BD BiosciencesAPCクローン:M-T701;希釈率:1:200
CD8BD BiosciencesPeCy7:RPA-T8;希釈率:1:200
CD8BD BiosciencesPEクローン:HIT8a;希釈率: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgGInvitrogen11041
EGFMiltenyi130-097-751
EPCAM (CD326)BD BiosciencesPEClone: HEA-125;希釈率:1:200
EPCAM(CD326)MiltenyiBV711クローン:EBA-1;希釈:1:200
FGF10Miltenyi130-127-858
FGF8Biotechne R&D423-F8
フィブリノーゲンΣ アルドリッチ341578
FLT3 LペプロテックAF-300-19
グルタマックスギブコ35050-61
IGF1ミルテニー130-093-886
IL7ペプロテックAF-200-07
RANK Lバイオテクネ R&D6449-TEC
赤血球溶解液Miltenyi130-094-183
RPMI1640Gibco11875093
SCFPeprotechAF-300-07
トロンビンSigma Aldrich605190
TrypLEGibco2605010
XVIVO10LonzaLONBE04-380Q
クローンクローン

参考文献

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三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成
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