Method Article

縦断的MicroPET/MicroCT画像を用いた心血管石灰化進行のための新規定量化プロトコル

DOI:

10.3791/66805

⸱

November 15th, 2024

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1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 4Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Department of Orthopaedic Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 6Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 7Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この新しいプロトコルは、小さな研究動物の連続微小陽電子放出断層撮影法(PET)/マイクロコンピュータ断層撮影法(CT)画像からの心血管石灰化の進行の定量化を伴います。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ陽電子放出断層撮影法(PET)およびマイクロコンピューター断層撮影法(CT)イメージングは、心血管石灰化の進行を追跡するための強力で理想的な研究ツールです。その非侵襲的な性質により、小さな研究動物は複数の時点で画像化できます。課題は、心血管系石灰化の正確な定量化にあります。ここでは、後期の疾患段階の画像をテンプレートとして使用して、縦断的研究における心血管石灰化の進行を正確に定量化するためのプロトコルを提供します。このプロトコルには、1) 最初のステップとして、同じ動物からの複数の画像における胸部領域の位置合わせ、2) 心臓と大動脈内にある関心領域 (ROI) の定義が含まれます 後の画像で明らかになる大きなカルシウム沈着物の部位、および 3) 縦断的研究中に取得されたすべての画像にわたるカルシウム沈着物の同時セグメンテーションと定量化。この合理化された方法は、ROI定義の精度を向上させ、個々のスキャンを独立して分析する以前の技術に関連するばらつきを減らすことにより、心血管石灰化の進行を追跡する際の画像分析の精度を向上させます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管疾患は、罹患率と死亡率の世界的な主要な原因であり、そのメカニズムを明らかにし、効果的な予防および治療戦略を考案するためには、厳密な調査が必要です。冠動脈石灰化(CAC)は、心血管疾患の予測因子としてこの分野の専門家に広く認められており、心血管系死亡のリスクを大幅に高めます1,2,3,4,5。顕微鏡的石灰化は、石灰化性アテローム性動脈硬化症の最も初期の段階と考えられており、「微小石灰化」という用語は、直径が0.5〜50μm6,7,8,9のカルシウム沈着物を指すために使用されてきました。これらの小さな石灰化は、合体してより大きなカルシウム沈着物を形成し、石灰化プラークの進行を促進すると考えられています6,7。

陽電子放出断層撮影法(PET)およびコンピューター断層撮影法(CT)は、貴重な研究ツールとして機能し、生体内での心血管石灰化の非侵襲的評価に頻繁に使用されます5,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .これらのイメージングモダリティは、小研究動物11,12,13,19を含む縦断的研究において、血管石灰化の進行を追跡するために特に有利であることが証明されている。MicroCTイメージングは、比較的大きなカルシウム沈着物11,12,13,19,20の解剖学的画像を提供するのに有効性が実証されています。しかし、生きた動物の小さなカルシウム沈着物をイメージングするためのその有用性は、その空間分解能が~100 μm 8,14であることによって制約されており、初期段階での石灰化の調査は困難です。

注目すべき進歩は、ミネラル表面積への結合に基づく石灰化の検出の標準的な方法として、PETトレーサーであるフッ化物-18標識フッ化ナトリウム(18F-NaF)と組み合わせたマイクロPET / microCTイメージングの採用です。このアプローチでは、放射性標識18F-NaFを使用し、フッ化物イオンがカルシウムヒドロキシアパタイトに共有結合し、ヒドロキシル基を置き換えてフルオロアパタイト21を形成するため、カルシウム鉱物表面10,13を特定することが示されています。18Fの放射性崩壊(半減期~110分)および腎臓22を通るトレーサーのクリアランスに比べて交換率が遅いことと一致して、Irkleら13は、石灰化した頸動脈標本への18F-NaFの結合が検出時の表面に限定されていることを発見した。したがって、トレーサーの取り込みは鉱物表面積と直接関係しているはずであり、これは、一定量の鉱物が複数の小さな病巣または多孔質の形で発生する場合、少数の大きな固体堆積物に存在する場合よりも大きくなります。18F-NaF PETイメージングは、石灰化の最も初期の段階を高感度で強調することにより、疾患の初期段階に関する貴重な洞察を提供する可能性があり、予防戦略および治療戦略の研究に特に有用である13,14,15。

血管石灰化のマイクロPETとマイクロCTを組み合わせたイメージングの最近の進歩にもかかわらず、縦断的な心血管石灰化研究における画像分析の精度を向上させる機会があります。従来のアプローチでは、縦断的研究を通じて、個々の時点で、すべてのマウスの目に見える石灰化領域の周りの関心領域 (ROI) の手作業による描写を使用します。この方法では、特にカルシウム沈着物のサイズがスキャナーの検出限界に近づく初期の疾患段階で精度が低下し、低密度で配置された極小の沈着物がある一部の領域が見えなくなる可能性があります。

イメージングの領域では、アライメントとは一般に、一連の画像の空間的なアライメントを指します。既存の課題に対する新しいソリューションとしてアライメントを導入することで、私たちの提案方法により、研究者は、縦断的研究を通じて個々の被験者からの連続画像で石灰化の進行を追跡するための一貫した位置を使用できます。組織石灰化がナノサイズのマトリックス小胞(50-150nm)から生じることが知られていることを考えると、それが合体して微視的な、次に巨視的なヒドロキシアパタイト鉱物を形成する23ことを考えると、微小石灰化が初期の画像で認識される前にどこに位置していたかを遡及的に特定することができる。

画像の整列によって可能になる、時間の経過と共に同じ場所を追跡することが、この方法の基本です。ROIは、鉱化が容易に特定される最新の段階に基づいて割り当てられるため、最も初期の石灰化段階を直接特定する必要がなくなります。このプロトコルでは、画像の時系列のアライメントを重要なステップとして組み込んだ改良された合理化されたデータ解析方法を提示し、縦断的な組み合わせのmicroPET/microCTイメージング研究におけるカルシウム沈着の正確な定量を強化します(図1)。PET/CTデータ解析を例に挙げるが、この手法は、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、磁気共鳴画像法(MRI)、光学イメージング24など、他の縦方向イメージングデータの解析にも適用できる。

figure-introduction-1
図1:プロトコルの概要フローチャート。 心血管石灰化を定量化するための新しいプロトコルをまとめたフローチャート。一般的なステップには、縦方向のイメージング、異なる時点で取得した画像のアライメント、石灰化領域のセグメンテーションと定量化が含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

代表的な画像は、雌のアポリポタンパク質-E欠損(Apoe-/-)マウスを示しています。実験プロトコルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の施設動物管理および使用委員会によってレビューされ、承認されました。

1.動物のスキャン

  1. 2つの画像取得の間に、マウスに標準的な食事を介入せずに与えます。ただし、生後 15 か月で最初の画像を作成する前に、生後 12 か月から 14 か月まで西洋型食事 (脂肪 21%、コレステロール 0.2%) に切り替えて、ベースラインの大動脈石灰化を誘発します。
  2. microPET/CTスキャナーが定期的に校正され、最適なPETデータ取得とCT同時登録が行われていることを確認してください。製造元の指示に従ってキャリブレーションを実行します。
  3. イメージングする前に、チャンバー内で2%イソフルランガスを使用してマウスに麻酔をかけます。動物のつま先をつまんで麻酔を確認しますが、反応はありません。
  4. 3.7 MBq の 18F-NaF の静脈内注射の 60 分後に、組み合わせた microPET/CT スキャナーで microPET (350-650 keV、スキャン時間 10 分) および 100 μm microCT (80 kVp、150 μA、720 投影、スキャン時間 1 分) の画像を取得します。microPETスキャンの直後にmicroCTスキャンを取得します。
    注:スキャナーベッドは、動物をPETモーダルからCTモーダルに移動し、動物は麻酔下にあり、同じ位置に留まりました。
  5. 3D順序のサブセット期待値最大化アルゴリズム(24のサブセットと3回の反復)を使用して、ランダム、減衰、および減衰の補正を行いながら、microPET画像を再構築します。修正フェルドカンプアルゴリズムを使用してCT画像を再構成します。
    注:イメージング後、マウスが胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを監視しました。縦断的研究の終わりに、すべてのマウスを安楽死させました。

2. DICOMビューアソフトウェアでDICOMファイルをインポートします

注:この代表的なプロトコルは、非商用ライセンスの下でORS Dragonflyソフトウェアを使用していますが、その柔軟性は他のDICOMビューアソフトウェアオプションにも及びます。

  1. アプリケーションをダブルクリックして、DICOMビューアソフトウェアを起動します。
  2. 左上隅の [ファイル ]に移動します。ドロップダウンメニューで[ DICOMイメージのインポート... ]を選択して、[ DICOMイメージの管理 ]ウィンドウ(補足ファイル1-補足図S1A)の表示を求めます。
  3. [ DICOMイメージの管理 ]ウィンドウで、[ フォルダコンテンツ ]タブをクリックします。右側で[ フォルダを開く] を選択して、縦断的研究で目的のDICOMファイルを含むフォルダを選択します(補足ファイル1-補足図S1B)。
  4. DICOM ファイルを含むフォルダを特定します。 [フォルダの選択 ]をクリックして、最初のフォルダを [DICOMイメージの管理 ]ウィンドウにインポートします(補足ファイル1-補足図S1C)。
  5. [DICOM イメージの管理] ウィンドウで、PET ("PT") と CT ("CT") DICOM ファイルの両方を選択します。続いて、右側の[スタディの表示]をクリックして、インポートされたすべてのDICOM画像(補足ファイル1-補足図S1D)を開きます。
  6. 縦断的研究の同じ単一の被験者に関連するDICOM画像を含む各フォルダについて、手順2.4と2.5を繰り返します。

3. DICOMビューアの設定を調整して、画像の視覚化を最適化します

  1. Supplemental File 1 - Supplemental Figure S2に示すように、4つのビュー(3D、横、冠状、矢状)を表示するようにレイアウトを変更します。左側の[レイアウト]ドロップダウンで、選択したシーンの[ビュー]を見つけ、4つのビューを表示するレイアウトを選択します。
  2. 画像の名前を変更して、時点と、それらがPET画像かCT画像かを示します。画像名を選択し、 ダブルクリック して各画像の名前を変更します。
  3. 右側の [データプロパティ]と[設定 ]ドロップダウンにアクセスして、画像をオンにします。各画像名の左側にある 目のアイコンをクリックして 、表示を切り替えます(補足ファイル1-補足図S2)
  4. 各CT画像の明るさとコントラストを個別に調整します。
    注:最適なCTの明るさとコントラストの範囲は、被写体、イメージングプロトコル、スキャナー、および再構成パラメータ25,26によって異なる場合があります。ただし、縦断的研究では、すべての調整が 1 人の被験者に対して一貫している必要があります。
    1. [データのプロパティと設定]の下にある画像名をクリックして、1つのCT画像を選択してオンにします(補足ファイル1-補足図S2)。
    2. ヒストグラムは、ディスプレイ画面の左側にある[メイン]タブにある[ウィンドウレベリング]ドロップダウンで見つけます。ヒストグラムの上でLogYをアクティブにします。次に、黄色の範囲インジケーターをクリックしてスライドさせ、ヒストグラムの2番目のピークを完全に囲みます(補足ファイル1-補足図S3A)。最適な明るさ/コントラストに達するまで、わずかな調整を行います。輝度/コントラストを調整したCT画像の例については、図2Bを参照してください。
    3. ウィンドウレベリングヒストグラム(補足ファイル1-補足図S3B)の下にある[選択した範囲]ボックスを見つけます。後続の手順で使用する [選択した範囲] の値をメモしておきます。
    4. 2枚目のCT画像(補足ファイル1-補足図S3C)を選択してオンにします。最初のCT画像から選択した範囲の値を、2番目のCT画像(補足ファイル1-補足図S3B-S3D)の[選択した範囲]ボックスに入力します。すべての連続する画像に対して繰り返します。
  5. ルックアップテーブルフィルターを個別に調整して、各PET画像を絞り込みます。
    注:最適なPETカラースケールの範囲は、被験者、イメージングプロトコル、スキャナー、および再構成パラメータ27によって異なる場合があります。ただし、縦断的研究では、すべての調整が 1 人の被験者に対して一貫している必要があります。
    1. [データのプロパティと設定]の下の画像名をクリックして、1つのPET画像を選択してオンにします(補足ファイル1-補足図S2)。
    2. [メイン]タブの[ウィンドウレベリング]ドロップダウンで、[ルックアップテーブル(LUT)]を見つけ、スクロールして[LUT]ドロップダウンで[PET]を見つけ、[PET]フィルタ(補足ファイル1-補足図S4A)を選択します。
    3. [ウィンドウ レベリング] ドロップダウンの下のヒストグラムを使用して選択した範囲を微調整し、最適な視覚化を実現します。ヒストグラムの上でLogYをアクティブにします。次に、黄色の範囲インジケーターをクリックして、補足図S4B(補足ファイル1)に示されている位置に向かってスライドさせます。PET画像の視覚化に最適な選択範囲が達成されるまで、わずかな調整を行います。最適な選択範囲に調整されたPET/CT画像の例については、図2Dを参照してください。
    4. [ウィンドウ レベリング] ヒストグラム (補足ファイル 1 - 補足図 S4B) の下にある [選択した範囲] ドロップダウンを見つけます。選択した範囲の値をメモして、後続の手順で使用します。
    5. 2 枚目の PET 画像 (補足ファイル 1 - 図 S4C) を選択してオンにします。2 番目の画像に対して手順 3.5.2 を繰り返します。
    6. 最初のPET画像から選択した範囲値を、2番目のPET画像(補足ファイル1-図S4B-S4D)の[選択した範囲]ボックスに入力します。すべての連続する画像に対して繰り返します。

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図2:画像の視覚化を最適化するためのDICOMビューア設定の調整。 (A,B)コントラスト/明るさ調整前(A)と(B)CT画像のコロナビュー。(C,D)PET/CT画像の冠状図(C)ルックアップテーブル調整前と(D)調整後。略語:CT =コンピューター断層撮影;PET=陽電子放出断層撮影法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. CT画像で胸部を合わせる

注:簡単にするために、1つのCT画像は「ベース」画像として機能し、平行移動や回転は行われません。2 番目の CT 画像 (および最終的には後続のシリアル画像) は、ベース画像に合わせて平行移動および/または回転されます。これは、デモンストレーションの目的上、「オーバーレイ」画像と呼ばれます。整列全体を通して、基本画像と他のすべてのオーバーレイ画像を区別することが重要です。

  1. [データ プロパティと設定] ドロップダウンで各画像名の左側にある目のアイコンをクリックして、すべての PET 画像をオフにし、ベース CT 画像をオンにします。
  2. CT画像の不透明度を~50%に変更します。2Dビューの1つをクリックします。 [ウィンドウレベリング ]ボックスで、[ 不透明度マッピング ]ドロップダウンを見つけ、 不透明度 スケールを中央にスライドします(補足ファイル1-図S5)。
  3. オーバーレイCT画像をオンにして、手順4.2を繰り返します。
  4. オーバーレイCT画像のフィルターを変更して、ベースCT画像とオーバーレイCT画像を区別します。[メイン] タブの [ウィンドウ レベリング] ドロップダウンで、ルックアップ テーブル (LUT) を見つけます。[LUT] ドロップダウンで、スクロールして赤いフィルターをクリックします。
    注: これで、補足図S5 (補足ファイル1)に示すように、各ビューに2つのCT画像が表示されます。
  5. 2D ビューの 移動/回転 ツールを使用して、オーバーレイ イメージの胸部をベース イメージの胸部にできるだけ近づけます。胸郭、脊椎上部、胸骨をCT画像の胸部アライメント指標として参照します。
    注:次のアクションは、2Dビュー(横方向、冠状、または矢状)でのみ実行できます(補足ファイル1-補足図S1)。最良の結果を得るには、3 つの 2D ビューすべてを切り替え、移動/回転ツールを使用して各ビューの胸部を位置合わせします。
    1. [データ プロパティと設定] ドロップダウンでオーバーレイ画像を選択し、一度クリックして 2D ビューの 1 つを選択します。
    2. [メイン]タブの下にある[移動/回転]ドロップダウンを見つけて、[ディスプレイス]アイコンをクリックします(補足ファイル1-図S6A)。
    3. 左下隅の 移動ボックス をクリックしてドラッグし、選択した 2D ビューの中央にある ピボット ポイント を回転させて、オーバーレイ イメージをベース イメージとほぼ一致させます (補足ファイル 1 - 補足図 S6B)。アライメントの参考として、ボーン構造を参照してください。
    4. [操作]ドロップダウンの下にある[トラック]ツールを見つけ、軸の中心をクリックしてドラッグして、軸を胸の領域に移動します。コンピュータマウスの中央スクロールボタンをクリックし、マウスを画面から離してドラッグして、胸部を拡大します(補足ファイル1 - 補足図S6C)。
  6. 胸郭、脊椎上部、胸骨などの胸部構造に合わせて、さらに並進と回転の調整を行い、正確な位置決めを行うためにアライメントを微調整します。2D ビューを切り替え、2 つの画像が 図 3 のようになるまで手順 4.5.3 から 4.5.4 を繰り返します。
  7. ベースCT画像と最初のオーバーレイCT画像の位置合わせが完了したら、LUTドロップダウンでオーバーレイCT画像のフィルターを グレースケール に戻します。同じ動物からのすべてのオーバーレイCT画像について、一定のベース画像を使用してセクション4を繰り返します。

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図3:すべてのCT画像のアライメント。 (A,B)ベース(灰色)とオーバーレイ(赤)のCT画像(A)とアライメント後(B)のコロナビュー。(C,D)アライメント前とアライメント後(D)のCT画像の矢状図。青い矢印はマウス、(1)胸郭、(2)脊椎、(3)胸骨。略語:CT =コンピューター断層撮影。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. PET画像と対応するCT画像の同時登録

注:オーバーレイCT画像とベースCT画像の位置合わせは、最初にオーバーレイCT画像と 図4に示すそれぞれのPET画像の位置ずれを引き起こします。PET画像は、対応するCT画像と再度同時登録する必要があります。

  1. オーバーレイCT画像とそれに対応するPET画像をオンにするには、各画像名の左にある 目のアイコンをクリックします 。
  2. PETおよびCT画像の不透明度を~50%に変更します。 [Window Leveling ] ドロップダウンで [Opacity Mapping ] ドロップダウンを見つけ、 不透明度 スケールを中央にスライドします (補足ファイル 1 - 補足図 S5)。
  3. 2D ビューで 移動/回転 ツールを使用して、CT イメージのボーン構造と PET イメージの 18F-NaF ボーン サーフェスに基づいて、PET イメージを対応する CT イメージに位置合わせします。
    1. [データ プロパティと設定] ドロップダウンでオーバーレイ CT 画像に対応する PET 画像を選択し、一度クリックして 2D ビューの 1 つを選択します。
    2. [メイン]タブの下にある[移動/回転]ドロップダウンを見つけて、[ディスプレイス]アイコンをクリックします(補足ファイル1 - 補足図S6A)。
    3. 左下隅の移動ボックスをクリックしてドラッグし、選択した2Dビュー(補足ファイル1 - 補足図S6B)の中央にあるピボットポイントを回転させて、PET画像をCT画像と同時登録するように移動します。
  4. CT画像と同時登録されていないすべてのオーバーレイPETおよびCT画像について、セクション5を繰り返します。
    注:共レジストレーションが完了した場合、 図4に示すように、対応するPET/CT画像を体の全長に沿って位置合わせする必要があります。

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図4:PET画像と対応するCT画像のアライメント。 代表PET画像とそれに対応するCT画像(A、C)、同時登録前および同時登録後(B、D)。同時登録の完了後、パネル Bに示されているように、PET画像とCT画像を位置合わせする必要があります。略語:CT =コンピューター断層撮影;PET=陽電子放出断層撮影法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6.心血管石灰化を特定します

  1. 縦断的研究で予測された石灰化領域が最も大きい時点を特定します (つまり、後期の石灰化の時点または前治療を受けた被験者)。この時点に対応する画像を選択して「参照」画像として、最もはっきりと見える石灰化を強調します。この選択された画像は、異なる時点での小さな石灰化領域を含む他のすべての画像と比較するためのテンプレートとして機能します。
  2. 画像の左側にある目のアイコンをクリックして、参照CT画像をオンにします。[操作] ドロップダウンの下にある [追跡] ツールを選択し、軸の中心を心臓領域の周りに移動します。
  3. ズームインして、胸郭、胸骨、脊椎の間の心臓のシルエットに重ね合わされた石灰化領域(小さく明るく密集した部位)を見つけます(図5)。石灰化した領域がすぐに表示されない場合は、2D ビューを選択し、マウスでスクロールして、各画像のレイヤーをスクロールします。
  4. トラック軸を移動して石灰化した領域にカーソルを合わせ、すべての 2D ビューでその可視性を確保します。マウスCT画像の石灰化領域の視覚的な参照については、図5を参照してください。
  5. 対応するPET画像をオンにして、石灰化の存在を検証します。
    注:PET画像の設定と共レジストレーションが適切に調整されている場合、 図5Dに示すように、PET画像には石灰化領域の周囲の活動が表示されます。

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図5:心臓の石灰化領域の特定。 代表的な(A)矢状、(B)横方向、(C)冠状CT画像、および(D)冠状PET/CT画像に描かれた石灰化領域。黄色の矢印はカルシウム沈着物を示します。青い矢印は、石灰化の位置を決定するために使用される参照構造を示しています。略語:CT =コンピューター断層撮影;PET=陽電子放出断層撮影法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

7. 石灰化した領域の周囲にROIを描画します

  1. PET参照画像をオフにします。CT参照画像のみをオンにするには、画像の左側にある 目のアイコンをクリックします 。
  2. [形状] ドロップダウンを見つけて、[球体] 形状 (補足ファイル 1 - 補足図 S7) を選択します。球の寸法を調整するには、球のエッジをクリックしてドラッグし、サイズを変更します。球体の位置を変更するには、中央の正方形をクリックしてドラッグします。
    1. 2D ビュー内をナビゲートして、球体を慎重に配置します。球体は、識別された石灰化領域全体と一部の周辺領域をカプセル化する必要がありますが、周囲の骨は避けてください。最適な球体の描画に関する視覚的なガイドについては、球体の適切な配置に関する 補足図S7 (補足ファイル1)を参照してください。
  3. [データ プロパティと設定] ドロップダウンで、球名を右クリックし、[ROI に追加] を選択します。 (補足ファイル 1 - 補足図 S8A) を選択し、続いて [新しい ROI] (補足ファイル 1 - 補足図 S8B) を選択します。
    1. 新しく作成した ROI に適切な名前を割り当てます。 [ジオメトリ]で、ROIを生成するCT画像を選択します(補足ファイル1 - 補足図S8C)。
    2. ROI 名の左側にある 目のアイコンをクリックして ROI をオンにし、 補足図 S8D (補足ファイル 1) に示すように、前に描画した球のサイズに対応する色付きの ROI を観察します。
  4. ディスプレイ画面の左側、メインタブの隣にある [セグメント] タブを見つけます(図6A)。 「セグメント」 タブでは、ROIを作成および編集できます。
    注:次の3つの手順は、指定された球内の石灰化領域のみを強調表示する精度でROIを作成することを目的としています。
    1. [データ プロパティと設定] で参照 ROI を選択し、[セグメント] タブの下にある [範囲] ドロップダウンを見つけます。[Define range]をクリックしてオンにします(図6A)。
    2. [選択した範囲] ボックス (図 6A) を使用して、定義した範囲を変更します。定義された範囲が、カルシウムしきい値を下回るハウンズフィールド単位 (HU) 値を持つすべての非石灰化ピクセルをカプセル化していることを確認します。このデモでは、カルシウムの閾値 300 HU を使用し、この画像の最低密度ピクセルは -2,626 です。したがって、選択した範囲は -2,626-300 HU です。
    3. 選択した範囲を設定したら、[ 削除 ]をクリックして(図6A)、指定したしきい値を下回るすべてのピクセルを球のROIから削除します。
      注:このアクションにより、球体内の石灰化領域のみを強調表示する新しいROIが得られ、さらなる分析のための焦点が合理化されます。完成したROIは、 図6Bに示されているROIのようになるはずです。
  5. すべての連続するCT画像に対して手順7.3〜7.4を繰り返し、共通の参照球を使用して一意の新しいROIを作成します。各ROIには、特定のCT画像の識別に対応する名前を付け、簡潔で整理された分析を保証します。
    注:アライメントが正確であると仮定すると、参照球はすべての画像の最大の石灰化領域をカプセル化する必要があるため、各画像のROI分析用に新しい球を作成する必要はありません。

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図6:セグメンテーションを使用してROIを石灰化領域に制限する(A)矢印は、ROIから望ましくない密度データを排除するために必要な手順を示しています。青い矢印は [セグメント] タブを指しています。黄色の矢印は [Define Range] 機能をハイライト表示しています。緑色の矢印は、選択した範囲入力を示します。赤い矢印は [削除] ボタンを指しています。(B)プロトコルステップ7.4-7.4.3の完了後、ROIは、このパネルに示されているように、石灰化領域を具体的に描写する必要があります。略語: ROI = 関心領域。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

8. 各画像のROIを定量化する

  1. [データ プロパティと設定] ドロップダウンで定量化する ROI を選択します。
  2. 右側の [Basic Properties] ドロップダウンの下にある [Statistical properties] ドロップダウンを見つけます (図 7)。
  3. [Statistical Properties] の下にある [Dataset] テーブルを見つけます。右側のドロップダウンメニューを使用して、定量化するROIと相関する適切なイメージングデータセットを選択します(図7)。
    1. ROI内のCTデータを定量化する場合は、ROIと相関するCT画像名を選択します。
    2. ROI 内の PET データを定量化する場合は、ROI に対応する PET イメージ名を選択します。
  4. 「リフレッシュ」をクリックして、選択した石灰化領域の定量化された値を取得します。データセット テーブルに基づく Min、Max、および Mean の値に注意してください。定量化には平均値を使用します(図7)。
  5. [統計プロパティ]ボックスの上部で体積計算を見つけます。この容量を定量に使用します(図7)。
  6. CT データセットの場合、値は HU で報告されます。 平均 ROI値(HU)とROIの 体積 (mm3)の積を使用して、体積カルシウム含有量(vHU)を計算します12。
  7. PETデータセットの場合、値はベクレル(Bq)で報告され、これは減衰/秒に対応します。トレーサーの取り込み濃度について、平均ROI値(Bq)をROIの体積(mm3)で割ってBq/ mm 3に変換します。

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図7:ROIの定量化。 選択した ROI の [統計プロパティ ] タブ。赤い矢印は、ROI に基づいてデータセットの統計情報を取得するために必要な手順を示しています。赤いボックスは、体積とハウンズフィールドの平均単位値を示しており、さらなる解析計算に不可欠です。略語: ROI = 関心領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分析手法
このセクションでは、代表的な結果を通じて成功した活用について説明します。ここでは、生後12ヶ月から14ヶ月齢までの西洋型食生活(脂肪分21%、コレステロール0.2%)を摂取した後、生後15ヶ月と18ヶ月齢でスキャンした1匹のマウスのmicroPET/microCTを組み合わせた画像を紹介します。石灰化定量化のためのプロトコルセクション2〜8に続いて、4人の独立した研究者が、15か月および18か月の時点で取得した同じ代表的なmicroPET / microCT画像を使用して、体積カルシウム含有量と18F-NaF PET活性を個別に測定しました。平均、標準偏差、クラス内相関係数(ICC)28,29などの統計分析を計算して、プロトコルの評価者間の信頼性と再現性を決定しました。ICC推定値とその95%信頼区間は、平均評価(k = 4)、一貫性、2元配置ランダム効果モデル(ICC(C,1))(補足ファイル1-補足表S1)に基づくIBM SPSS統計パッケージを使用して計算されました。

業績
石灰化した領域の体積と密度に由来するカルシウムの体積含有量は、15か月(平均 = 876.08 vHU、標準偏差 = 27.18 vHU)から 18 か月(平均 = 1253.13 vHU、標準偏差 = 7.61 vHU)の画像時点(図 8)の間に 1 匹のマウスで増加しました。一方、石灰化した領域の表面積を測定する 18F-NaF PET活性は、15ヶ月(平均=24173.90 Bq/mm3、標準偏差=1426.60 Bq/mm3)と18ヶ月(平均=13849.94 Bq/mm3、標準偏差=1524.67 Bq/mm3)の画像時点(図8)の間に、同じマウスで減少しました。

これらの結果は、18F-NaF PETおよびCTイメージングが、アテローム性動脈硬化性プラーク12,13,14に関する異なる情報と思われるものを提供するという以前の知見と一致している。石灰化に関する縦断的研究でも同様の傾向が示され、18F-NaFシグナルの減少は小さなカルシウム沈着物の合体によるものであり、含有量の増加にもかかわらず最終的に表面積が減少する可能性があることが示唆されています12。

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図8:代表的なmicroPET/CT画像。 横方向(左)、冠状(中央)、矢状(右)の図は、15か月と18か月の代表的なmicroPET画像でのフッ化物-18(F-18)の取り込みを示しています。白い矢印は石灰化の領域を示しています。略語:CT =コンピューター断層撮影;PET=陽電子放出断層撮影法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

私たちの結果で観察された小さな標準偏差は、異なる研究者によって得られた測定値の間に高度な一致と一貫性があることを示唆しています。さらに、私たちの研究で得られた ICC(C,1) 値 0.997 (95% 信頼区間 = 0.983-1.000) (補足ファイル 1-補足表 S1) は、異なる研究者によって行われた測定間の優れた一致を示しています。このレベルの一致は、測定値が研究者間で信頼性と一貫性があることを示唆しており、この新しい定量プロトコルの高い再現性を示しています。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この新しいプロトコルは、心血管石灰化の定量化に対する改良されたアプローチです。イメージングの非侵襲的な性質により、小動物の心血管石灰化の進行を追跡するために縦方向のマイクロCT画像を取得することができます。マイクロCT画像だけでもカルシウム含有量の進行を示すことができますが、マイクロPET画像が利用可能な場合、特にトレーサーが表面積に結合することによる小さなカルシウム沈着物の検出が強化され、追加の情報を提供できます。この方法で精度と再現性をさらに向上させるには、造影心筋同期CTイメージングを組み込むことをお勧めします。造影CTイメージングは、18F-NaF PETイメージングによる低分解能の造影CTが心血管石灰化の定量化の標準である、より大きな動物および臨床研究におけるこのプロトコルの適用を合理化する30,31。さらに、心電図(ECG)データを用いた運動アーチファクトの低減により、心電図32,33の画像がより鮮明で高品質な画像が得られる。当社の画像解析手法は、縦断的研究における心電図PETデータや心電光石火CTデータに適用することができます。

DICOMビューアは、このプロトコルに不可欠な機能を普遍的に提供します。2Dおよび3D画像表示、ヒストグラム、ウィンドウ制御、ルックアップテーブル、転座、回転、オーバーレイ、ナビゲーションツールなどの基本機能は、ほとんどのDICOM表示ソフトウェア34,35に標準装備されており、画像の正確な位置合わせと石灰化のピンポイントを可能にします。セグメンテーションなどのより高度な機能は、ほとんどのDICOM表示ソフトウェア34,35,36にも共通しており、選択したROIの正確なROIの描写と正確な定量化を可能にします。全体として、この適応可能なプロトコルは、DICOM表示プラットフォーム間の互換性を確保し、研究者が方法論を損なうことなく好みのソフトウェアを使用できるようにします。

このプロトコルは一般的に簡単ですが、利用を成功させ、信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な考慮事項にかかっています。画像の再構成と解析に先立ち、減衰補正された注入線量とその 単位である18F-NaF PETトレーサーをDICOMファイルに含めることが不可欠であり、定量の精度を確保する必要があります。さらに、スキャナーボウ内のマウスの一貫した安定した位置を維持することで、画像のデジタルアライメントが大幅に容易になります。これは、縦断的研究においてシリアル画像間で分析の一貫性を維持するための基本的なプロセスです。

その他の重要なステップは、プロトコルに組み込まれています。ROIは、骨格骨や胸部上部の他の石灰化構造(甲状軟骨など)を除外するために慎重に選択する必要があります。ROIの描画を開始する前に、重要なステップは、目に見える最大の石灰化を特徴とする時点を「参照」画像として慎重に選択することです(プロトコルステップ6.1を参照)。ROIの精度をさらに高めるには、 補足図S7(補足ファイル1)で例示されているように、隣接する骨を除外しながら、球体の寸法を目に見える石灰化境界を超えて拡張するのが最善です。これらの戦略的な選択により、ROIの境界が、その後のすべてのスキャンで石灰化領域を包括的に包含することが保証されます。同様に重要なステップは、カルシウムミネラルを識別するボクセル密度のしきい値を選択することです(プロトコルステップ7.4を参照)。これは、使用するイメージング機器やDICOMビューアソフトウェアなど、特定の研究の仕様によって異なる場合があります。この例では、ROIの最小microCT密度閾値は、microPET/microCTの経験に基づいて300HUと定義されました。

このプロトコルのトラブルシューティングには、主に、正しい画像、オブジェクト、ROIが選択されていること、または各ステップで適切にオン/オフが切り替えられていることの確認が含まれます。ROIの定量化における一般的なエラーには、ユーザーがROIの代わりに画像を誤って選択したり、選択したROIと一致しない統計プロパティドロップダウンメニューでデータセットを選択したりすることが含まれます。画像の視覚化には、別の課題があります。たとえば、適切なカラースケールを使用しないと、画像が過度に暗くなったり明るくなったりして、カルシウムの沈着物が不明瞭になる可能性があります。最適な構成は、このプロトコルで採用されているものとは異なる可能性があるため、視覚化設定を微調整することが重要です。有益であることが証明される可能性のある追加のプロトコルの変更には、石灰化した領域を最適に囲むためにROI描画ステップ中にさまざまな形状を探索することが含まれます。研究の要件によっては、円筒形やカプセルなどの代替形状が、例のプロトコルで使用されている標準的な球体よりも効果的であることが証明される場合があります。DICOMに固有のエラーのトラブルシューティングの詳細については、 viewソフトウェアは、ソフトウェアのテクニカルサポートに相談することをお勧めします。

このプロトコルは、げっ歯類の心血管石灰化の分析を簡素化しますが、特定の制限があります。心血管石灰化を検出するための優れた方法であるにもかかわらず、18F-NaF PETイメージングは、解像度の制限と部分体積効果のために最小のカルシウム沈着物を捕捉する上で課題に直面する可能性があり、PETシグナル8,27の過小評価につながる可能性があります。CT画像では、ノイズの存在が検出37に影響を与える可能性がある。ノイズは HU しきい値を高く設定することで軽減できますが、トレードオフは最小の低密度堆積物が除外されることです。通常の密度のカルシウム鉱物堆積物がボクセル寸法よりも小さい場合、部分体積効果により、実際の38,39よりも密度が低く、サイズが大きく見えます。その結果、スタディの最小密度閾値の設定には微妙なバランスがあり、ノイズによる過大評価の可能性と、小さな堆積物の除外による過小評価の可能性との間にトレードオフがあります。

多くの確立された方法は、CTイメージング11,12,20,40,41,42を通じて石灰化を定量化しています。これには通常、Agatston スコアプロトコル 43 に従って、研究対象と患者の CAC スコアを特定することが含まれます。しかし、Agatstonスコアの重大な制限は、データ39の取得後の切り捨て、再割り当て、および閾値化のために、非常に信頼性の低いものとなっている。さらに、Agatston スコア プロトコルは、スキャナーの検出限界である 100-200 μm8 を超える領域のみを識別できます。心血管疾患の危険因子として石灰化の重要性が高まっていることを認識しているため、石灰化を正確に定量化する方法を開発することが不可欠です。18F-NaF PET/CT イメージングの進歩により、心血管石灰化の視覚化が改善されました。しかし、縦断的研究のための正確なデータ解析手法の開発には、依然として課題があります。石灰化を定量化するための現在の方法は、縦断的研究11,12,15のすべての個々の時点で、すべての被験者の目に見える各石灰化領域の周囲にROIを手動で描画することを含む。これらの現在の方法は、特にデポジットがスキャナーの検出限界に近い場合に、精度を妨げる可能性があります。最大の石灰化を示す時点にアライメントしないと、石灰化が小さい画像でROIを定義することは困難になります。私たちの新しいプロトコルでは、画像のアライメントとROIの一貫性を統合した洗練されたデータ分析アプローチを提示します シーケンシャル画像のデータ分析の一貫性を高め、それによって縦断的なPET/CT研究における石灰化評価の有効性を向上させます。この方法は、データ分析の課題に対処するだけでなく、心血管石灰化の進行プロセスに関する洞察も提供する可能性があります。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UCLA Crump Preclinical Imaging Technology Centerのすべてのメンバーに対し、データ取得と処理、機器とインフラストラクチャのメンテナンスにご協力いただき、感謝いたします。サイクロトロンの運転と 18F-NaF合成にご協力いただいたJeffrey Collins氏に感謝いたします。統計分析にご協力いただいたUCLA統計コンサルティンググループに感謝いたします。この研究は、NIH Cancer Center Support Grant (2 P30 CA016042-44 to MT) と National Institutes of Health, Heart, Lung, and Blood Institute (HL137647 and HL151391 to YT and LLD) によってサポートされています。GNEXT PET/CTスキャナーは、NIH S10 Shared Instrumentation for Animal Research Grant (1S10OD026917-01A1 to Arion Chatziioannou) から資金提供を受けました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 ccの滅菌インスリン注射器Exel International#2602818F-NaF PETトレーサー
18F-NaF PETトレーサーCNSIサイクロトロン
BiorenderのIV使用 図1
女性Apoe-/-マウスジャクソン研究所#002052B6.129P2-APoEtm1Unc/J
GNEXT PET/CTSofie Biosciences, Dulles, Virginia
IsofluranePiramal Critical Careマウスイメージングの麻酔として使用
ORS DragonflyComet Technologies Canada Inc.
SPSS統計IBM
マウス用西洋型ダイエットEnvigo#TD88139脂肪21%、コレステロール0.2%
注入にの

References

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