κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

サマリー

この研究では、新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴を導入し、顕著な可逆的なジャミング-アンジャミング遷移特性を示します。これらの特性は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングにおける生体模倣組織や臓器の構築に貢献しています。心臓/食道様組織の高解像度と細胞増殖によるプリンティングの成功は、高品質のバイオプリンティングおよび組織工学の応用を示しています。

要約

粒状ヒドロゲル支持浴を利用した埋め込み型三次元(3D)バイオプリンティングは、生体模倣スキャフォールドを作成するための重要な技術として浮上しています。しかし、正確なバイオインクの沈着と細胞の生存率および機能のバランスをとる適切なゲル懸濁液培地を設計するには、特に望ましい粘弾性特性を達成する上で複数の課題があります。ここでは、新しい κ-カラギーナンゲル支持浴が、操作が容易な機械的粉砕プロセスを通じて製造され、均質なサブマイクロスケールの粒子を生成します。これらのサブマイクロゲルは、小さな降伏応力と急速なせん断減粘特性を備えた典型的なビンガム流動挙動を示し、バイオインクのスムーズな堆積を促進します。さらに、 κ-カラギーナンマイクロゲルネットワークの可逆的なゲルゾル転移と自己修復能力により、プリントされたコンストラクトの構造的完全性が確保され、明確な建築的特徴を持つ複雑な多層組織構造の作成が可能になります。プリント後、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルは、単純なリン酸緩衝生理食塩水洗浄で簡単に除去できます。さらに、細胞を多く含むバイオインクを用いたバイオプリンティングにより、バイオミメティックコンストラクト内の細胞は92%という高い生存率を持ち、偽足を急速に伸ばし、堅固な増殖を維持することが実証されており、このバイオプリンティング戦略が組織や臓器の作製に応用できる可能性が示されています。要約すると、この新しい κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地は、優れた品質の埋め込みバイオプリンティングの有望な手段として浮上しており、人工組織や臓器の in vitro 開発に深い意味を持っています。

概要

電気紡糸繊維、多孔質スポンジ、高分子ハイドロゲルなどの組織工学足場は、細胞増殖、組織再生、臓器機能の回復を支える構造的枠組みを提供することにより、損傷した組織や臓器の修復と再建において極めて重要な役割を果たします^1,2,3.しかし、従来のスキャフォールドでは、天然の組織構造を正確に再現するという課題に直面し、人工組織と天然組織との間にミスマッチが生じます。この制限は、欠陥のある組織の効率的な治癒を妨げ、より正確なバイオミミクリーを達成するための足場設計の進歩が緊急に必要であることを強調しています。3次元(3D)バイオプリンティングは、生体材料のインクと細胞⁴を使用して、複雑な生体組織構造を層ごとに正確に構築する革新的な製造技術です。さまざまな生体材料の中で、高分子ハイドロゲルは、細胞のin situカプセル化を促進し、細胞の成長を決定的にサポートする独特のネットワークを備えた理想的なバイオインクとして浮上しています^5,6。それにもかかわらず、多くの柔らかく高水和したハイドロゲルは、バイオインクとして使用すると、印刷プロセス中に印刷された足場構造のぼやけや急速な崩壊を誘発する傾向があります。この課題に対処するために、組み込み型3Dバイオプリンティング技術は、マイクロゲル浴を支持材料として採用し、正確なソフトバイオインクの堆積を可能にしました。ハイドロゲルバイオインクをゲル化すると、マイクロゲル浴を取り外すことにより、複雑な構造を持つ精製されたバイオニックスキャフォールドが得られます。ゼラチン^7,8、アガロース⁹、ジェランガム^10,11などの材料は、埋め込み型3Dバイオプリンティング用のマイクロゲルバスの作成に使用されており、組織工学におけるソフトハイドロゲルの応用を大幅に進めています。しかし、これらの粒子状ゲルのミクロンレベルで不均一な粒子サイズは、3Dプリンティング12,13,14の解像度と忠実度に悪影響を及ぼします。小さく均一に分散した粒子を持つゲル状の懸濁液フロートを作製することが急務であり、高忠実度のバイオプリンティングを実現する上での利点があります。

このプロトコルでは、均一なサブミクロンレベルの新しい犠牲顆粒 κ-カラギーナン懸濁槽が埋め込まれた3Dプリンティングのために提示されます。この革新的なサブマイクロゲル浴の急速なジャミング-アンジャミング遷移の挙動は、高い構造忠実度¹⁵の生体模倣ヒドロゲル足場の正確な製造を容易にする。この新しい懸濁液媒体を利用して、ゼラチンメタクリレートとシルクファイバーメタクリレートで構成される複合バイオインクを使用して、多層組織構造を特徴とする一連の生体模倣組織および臓器構築物が成功裏に印刷されます。この研究では、食道が多層組織構造を持っているだけでなく、その筋肉層も内部の円形および外部の縦方向の複雑な層構造を示すことを主な理由として、食道を3Dバイオプリンティングバイオミメティックオブジェクトとして選択しました。これらの層の適切な配置と組織化を確保することは、機能的な組織の再生に不可欠です。したがって、食道の多層構造を再現することを強く望んでいます。さらに重要なことに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲルを懸濁液浴として、GelMA/SFMAをバイオインクとして利用し、組織工学のための生体模倣足場を設計および構築しました。印刷された食道は、リン酸緩衝生理食塩水洗浄を繰り返すことで簡単に放出できます。さらに、 κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴は細胞毒性物質を含まないため、高い細胞適合性が保証されます¹⁵。異方性足場内にロードされた平滑筋細胞は、顕著な拡散活動を示します。この均一なサブマイクロゲル懸濁液は、埋め込まれた3Dバイオプリンティングを通じて複雑な組織や臓器を作製するための新しい道を提供します。

プロトコル

1. κ -カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製

1. 1,000 mLのガラス瓶内の500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)溶液に1.75 gのκ-カラギーナン粉末を加えて、500 mLのκ-カラギーナン懸濁液浴(0.35%重量/vol)を調製します。
2. 70 mmのマグネチックスターラーバーをガラス瓶に導入して、水性混合物を攪拌します。ガラス瓶のキャップを締めてから、半回転緩めます。
3. ガラス瓶を70°Cのウォーターバスに入れて加熱します。マグネチックスターラーを300rpmの速度でオンにし、ボトルを置き、ポリマーが完全に溶解するまで攪拌します。
4. 別のガラス瓶をオートクレーブに入れて滅菌し、121°Cで30分間運転します。
5. 高圧滅菌器が80°Cに冷却されたら、滅菌器からボトルを取り出し、超清潔な作業台に移してさらに取り扱います。
6. 完全に溶解した κ-カラギーナン溶液を0.22μmフィルターを使用して滅菌ガラス瓶にろ過します。
   注:溶液が熱いうちに迅速にろ過を行い、 κ-カラギーナンが冷却されてフィルターを塞ぐのを防ぎます。
7. κ-カラギーナン溶液を4°Cで保存し、カチオン架橋ゲル化を12時間誘導します。
8. κ-カラギーナンハイドロゲルを、攪拌速度1200rpm、25°Cで60mmマグネチックスターラーを使用して機械的に粉砕し、液体状態に正常に変化するまで約60分かかります。
   注: κ-カラギーナンハイドロゲルは、低温でのゲル化や高温での溶解を避けるために、25〜37°Cで保管してください。

2. ゼラチンメタクリレート/シルクフィブロインメタクリレート複合バイオインクの調製

1. 10%(wt/vol)ゼラチンメタクリレート(GelMA)と6%(wt/vol)シルクフィブロインメタクリレート(SFMA)をPBS溶液(pH 7.4)に組み合わせて、複合バイオインクを調製します。2.0 gのGelMAと1.2 gのSFMA粉末を別々に計量します。
2. 粉末を2本の50 mL遠心分離チューブにゆっくりと加えます。10 mLのPBS溶液を別々に50 mLの遠心分離チューブに加えます。
3. それぞれに10mmのマグネチックスターラーを追加し、45°Cのウォーターバスで常に攪拌し、加熱します。 GelMAおよびSFMA粉末を完全に溶解させ、約30分かかります。
4. GelMA溶液とSFMA溶液を等量で混合し、45°Cで連続撹拌します。 100 μmの細孔径フィルターを使用して複合バイオインクをろ過します。
5. 複合GelMA/SFMAバイオインクをバイオセーフティキャビネット内でUV照射により12時間滅菌します。
   注:自己組織化によるSFMAの早期ゲル化を防ぐために、バイオインクをすぐに準備して使用してください。

3. κ-carrageenanサブマイクロゲル懸濁液浴のレオロジー的特性評価

1. レオロジー関連機器の立ち上げと準備
   1. エアコンプレッサーを30分間オンにし、圧力が30psiに達することを確認します。ベアリングclを取り外しますamp ドローロッドを反時計回りに回して。下の黒いカバーを固定し、機器上部のノブ軸を時計回りに回転させます。
   2. レオメータの電源を入れ、初期化します。循環水スイッチをオンにし、温度が15°Cに達するのを待ちます。
   3. レオメータ制御ソフトウェアを開いて、オンライン接続を確立します。
2. レオメータを校正し、平行プレート形状を取り付けます。
   1. 制御ソフトウェアで機器のキャリブレーションを実行しますが、これには主にキャリブレーション機器の慣性経路の調整が含まれます。直径40mmの平行プレート形状をドローロッドの端に取り付けます。ロックボタンを3秒間押し続けると、モーターシャフトがホームポジションに移動し、ジオメトリの配置が一定になります。
   2. 制御ソフトウェアでCalibrate Managerを選択し、続いてInertia、Friction Calibration、およびRotational Mappingをクリックして、平行プレート形状をキャリブレーションします。
3. レオメータのギャップ高さをゼロにするには、標準的なギャップゼロ調整手順を実施して、正確な測定を確保します。
4. 0.01 から 1000 1/s のせん断速度の範囲のフローランプ、10 rad/s で 0.1% から 100% のひずみ範囲の振幅スイープ、10 rad/s で 1% と 100% の交互ひずみで 60 秒間持続するマルチステップ振動時間スイープ、0.1 1/s と 10 1/s の交互せん断速度で 120 秒間持続するマルチステップピークホールドスイープなどの実験ステップを設定します。
5. 0.35% κ-カラギーナン懸濁液 2 mL をレオメータのペルチェプレートに滴下します。
6. ジオメトリギャップを510μmに配置し、クランプデバイスの端にある余分なオーバーフローを取り除きます。サンプルギャップを500μmに設定して、サンプルがクランプエッジをわずかに超えて伸びるようにします。
7. 実験計画オプションから フローランプ を選択して、フロー実験を実施します。
   1. 実験計画で フローランプ 検定を選択します。せん断速度を 25 °C の温度で 0.001 から 10 1/s に設定します。
   2. ステップ3.5と、追加したサンプルに対してフローランプ実験を実行します。
8. サイクルピークホールドテストを実施して、材料の回復性能を評価します。
   1. 実験計画で ピークホールド スイープを選択し、25°Cで120秒の時間で5つの連続した実験を設定します。
   2. せん断速度を 1 番目、3 番目、5 番目のステップで 0.01 1/s に設定し、2 番目と 4 番目のステップで 10 1/s に設定します。
   3. 2 mLの新しいサンプルを追加します。手順 3.5 と周期的回復テストを実行します。
9. 粘弾性解析を実施して、 κ-カラギーナン懸濁槽の潜在的なゲルゾル転移を評価します。
   1. 実験計画で 振幅スイープ 検定を選択します。振動ひずみを25°Cの温度で0.1%から100%に設定します。 [開始 ] をクリックして、追加したサンプルに対して Amplitude Sweep 実験を実行します。
10. 代替ひずみ解析を実行して、材料の弾性回復性能を評価します。
    1. 実験計画で 「オシレーション・タイム・スイープ 」を選択し、25°Cで60秒の時間で5つの連続した実験を設定します。
    2. ひずみを 1 番目、3 番目、5 番目のステップで 1% に設定し、2 番目と 4 番目のステップで 100% に設定します。
    3. 2 mLの新しいサンプルを追加します。手順 3.5 と連続循環回復テストを実行します。
       注:各実験テストの後にジオメトリプレートとペルチェプレートを清掃し、2mLの新しいサンプルを追加します。

4. カスタム設計のマイクロ押出バイオプリンターを使用した生体模倣ハイドロゲル足場のプリンティング

1. 3Dグラフィックスソフトウェアを使用してSTL形式のキューブを設計し、3Dデータベースから組織状モデルをダウンロードします(www.thingiverse.com;https://3d.nih.gov/.)。
   1. STL形式のモデルをPANGOソフトウェアにインポートし、印刷パラメータを入力します。3D空間でモデルの特定のX、Y、Z座標を設定し、モデルの予想されるスケーリングサイズをミリメートル(mm)で入力し、X、Y、Z軸上のオブジェクトのサイズとスケーリング比を調整し、必要に応じて空間内のモデルの回転角度を調整します。
   2. 推定フィラメント径(ほとんどのバイオインクで通常約200〜500μm)を層の厚さフィールドに入力して、各層のZ軸の厚さを決定します。予想される線の太さ(約10〜90 mm / s)に従って印刷速度を設定し、塗りつぶし密度を30%〜80%に設定します。
   3. 最終パラメータをGコードとしてSDカードにエクスポートします。
2. バイオプリンターとマイクロ押出ポンプを運転します。
   1. マイクロ押出ポンプコントローラーのスイッチを入れ、対応する容量のシリンジ(5 mL)を選択し、押出速度を0.08 mL / minに設定し、ヒドロゲルの容量を押出速度で割った所望の印刷時間に合わせて押出し時間を設定します。
   2. 内径210μmの針でシリンジをバイオプリンターのシリンジスロットに取り付けます。
   3. シリンジコントローラーを調整して、シリンジのプランジャーがネジに密着していることを確認します。
   4. 35 mmの細胞培養皿に3 mLの懸濁液浴を入れます。コード設定に基づいてディッシュをプラットフォームに配置し、印刷ヘッドがディッシュの底から1mm上にあることを確認します。
      注意: 印刷中の印刷プラットフォーム上の皿の位置の精度を確認するために、事前テストを実施します。
   5. コードが入ったSDカードを3Dバイオプリンターに挿入し、コードをアクティブにします file バイオプリンターを起動し、コントローラーの [開始 ]ボタンをクリックします。
3. コンストラクトの処理
   1. プリントしたコンストラクトを405nmの青色光に1分間さらして、フォトクロスリンクを開始します。
   2. 1 mLピペットを使用して κ-カラギーナンゲルを取り出し、続いて3 mLのPBS(pH 7.4)を添加して洗浄し、その後除去します。このプロセスを繰り返して、徹底的に洗います。
      注意: 印刷されたコンストラクトの損傷を避けるために、洗浄プロセスを穏やかに行ってください。

5. 食道筋層アナログの組み込み3Dバイオプリンティング

1. ウサギ食道平滑筋細胞(eSMC)を培養します。
   1. 10% ウシ胎児血清と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した 15 mL の DMEM 培地を使用して、2 x 10⁶ 細胞を含む T75 フラスコで培養を開始します。
   2. 5% CO₂ と 95% の空気の加湿雰囲気で eSMC を 37 °C に維持し、80% のコンフルエント度に達するまで維持します。
2. 食道筋層バイオインクの調製
   1. コンフルエントに達したら培地を吸引し、5 mLの1x PBSでeSMCを洗浄します。
   2. 0.2% Trypsin-EDTAを2 mLフラスコに加え、2分間インキュベートして細胞を消化します。フラスコをタップして、セルを壁から取り外します。
   3. 2 mLのDMEMを添加して消化を終了し、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。細胞懸濁液10μLのセルカウンターを使用して細胞密度を測定します。
   4. 675 x g で3分間遠心分離し、上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを複合GelMA/SFMAバイオインクに再懸濁します(ステップ2.1で調製)。バイオインク中の密度が10 x 10⁶ cells/mLになるように最終細胞濃度を調整し、その後の3Dバイオプリンティングアプリケーションの条件を最適化します。
3. 3Dバイオプリンターおよび関連材料の準備
   1. シリンジ針、鉗子、マグネチックスターラー、1000mLケイ酸ガラス瓶などの重要な印刷器具を、標準的な滅菌条件(121°Cで30分間)でオートクレーブ処理し、印刷プロセスの無菌環境を確保します。
   2. バイオプリンターをバイオセーフティキャビネット内に置き、紫外線(UV)で30分間滅菌して無菌性を維持します。
   3. ステップ1とステップ2でそれぞれ説明したように、50 mLの滅菌 κ-カラギーナンと5 mLの滅菌GelMA/SFMA複合バイオインクを調製します。
   4. モデルを設計し、必要なパラメーターを設定し、ステップ 4.1 で概説したとおりにバイオプリンターを準備します。
4. バイオプリンティングプロセスの開始
   1. 手順4.2および4.3で説明されている手順を実行して、3D食道筋層をバイオプリントし、続いてPBS洗浄と交換を行います。
   2. 印刷プロセス全体を通じて滅菌技術で細胞印刷を行い、印刷構造内の細胞汚染のリスクを最小限に抑えます。
5. 印刷後の細胞培養培地の交換
   1. PBSを慎重に吸引し、10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを補給した3mLのDMEMと交換します。.最適な細胞増殖条件を提供するために、印刷されたコンストラクトが完全に水没していることを確認してください。
   2. プリントしたコンストラクトを含む細胞培養皿を、5% CO₂で37°Cに設定したインキュベーターでインキュベートします。細胞培養培地を毎日3 mLを使用して新鮮な培地と交換し、光学顕微鏡を使用してコンストラクト内の細胞の状態をモニターします。

6. Live/Deadアッセイ染色によるプリントコンストラクト内のeSMCの生存率の評価

1. インキュベーションの5時間後に細胞培養培地を取り出し、細胞を含んだコンストラクトをPBSで洗浄します。
2. 印刷した細胞含んだコンストラクトに、標準的なcalcein-AM/ヨウ化プロピジウム溶液(1:1000)2 mLを加えてインキュベートします。
3. 45分間のインキュベーション後、コンストラクトをPBSで3回洗浄し、新鮮な細胞培養培地を加えます。
4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用して、生細胞と死細胞を観察し、蛍光画像を撮影します。

7. FITC-Phalloidin/DAPI染色によるプリンテッドコンストラクト中のeSMCの観察

1. F-アクチンにはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識ファロイジン(緑)、核には4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、青)を使用して、インキュベーション5日後に印刷したコンストラクトを染色します。
2. 固定液の調製
   1. 4 mL の 1x PBS と 0.16 mL のパラホルムアルデヒド(PFA)を 5 mL のポリエチレン(PE)チューブに混合し、最終濃度 4% を達成します。
   2. バイオプリントされたコンストラクトを含む培養皿を清潔な表面に置きます。培地を取り出し、コンストラクトをPFA溶液で静かに覆い、完全に浸漬させます。溶液を廃棄する前に、室温で20分間固定を進めます。
      注:バイオプリントされたコンストラクトの構造的完全性を維持するために、追加および除去プロセス中は液体を慎重に取り扱ってください。
   3. 2.5 mLの1x PBSを培養皿に導入し、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。
3. 細胞膜の透過化
   1. 5 mL PEチューブに20 μLのTriton X-100を1x PBS4 mLを加えて、0.5% Triton X-100溶液を調製します。
   2. Triton X-100溶液をコンストラクトに室温で30分間投与して細胞膜を透過させた後、溶液を除去します。
   3. 2.5 mLの1x PBSを培養皿に導入し、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。
4. 非特異的結合のブロッキング
   1. 1x PBSの4 mLに0.12 mLのBSAを添加して、5 mLのPEチューブに3%ウシ血清アルブミン(BSA)ブロッキング溶液を作製します。
   2. BSA溶液を室温で30分間コンストラクトに導入して非特異的部位をブロックし、溶液を廃棄します。
5. FITC-ファロイジンによるアクチン染色
   1. 0.2% FITC-ファロイジン溶液を5 mLのPEチューブに調製し、4 mLの1x PBSと8 μLの染色試薬を添加します。
   2. この溶液に組成物を室温で60分間暗所に浸し、溶液を廃棄します。
   3. 2.5 mLの1x PBSを培養皿に加え、コンストラクトを完全に沈めて残留染色試薬を除去します。
6. DAPIによる核染色
   1. 4 mLのDAPI染色溶液をコンストラクトに塗布し、完全にカバーします。
   2. 暗所で室温で20分間インキュベートしてから、DAPI溶液を取り出します。
7. 最終洗浄とPBS浸漬:培養皿に2.5 mLの1x PBSを加え、コンストラクトを完全に浸して残留染色試薬を除去します。
   注:染色液はあらかじめ調製し、優しく取り扱ってください。細胞が培養容器内で乾燥してはいけません。
8. 共焦点顕微鏡による観察:共焦点顕微鏡を使用して染色されたコンストラクトを検査および画像化し、細胞増殖を評価し、結果を包括的に文書化します。

8. CCK-8アッセイを用いたプリントコンストラクト内のeSMCs増殖の評価

1. 7日目と14日目に培養液をコンストラクトから取り出します。コンストラクトをPBSで洗浄し、残留培地と剥離した細胞を取り除きます。
2. 製造元の指示に従って、各コンストラクトにCCK-8溶液を追加します。CCK-8溶液の容量が、各コンストラクトを完全に覆うのに十分であることを確認してください。
3. コンストラクトをCCK-8溶液と37°Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、上清を新しい96ウェルプレートに慎重に移します。
4. マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定します。

結果

粒状κ-カラギーナンゲル浴は、バルクハイドロゲルを機械的に分解して粒子状ゲルスラリーにすることによって生成されました。最新の研究では、κ-カラギーナン粒子は、機械的混合¹⁵の1000rpmで均一な形態を有する約642±65nmの平均直径を示し、これは以前に文献で報告されたマイクロゲルの寸法よりも有意に小さいことを実証した16,17,18.ブレークタイムが長く、速度が速いため、マイクロ粒子のサイズが小さくなり、1200 rpmで60分のブレンド時間で、この研究では平均直径565 ± 86 nmのサブマイクロ粒子が得られます(補足図1)。このような小さな粒子サイズは、印刷プロセスの解像度を向上させることが期待されています。これらの粒子は、水素結合と陽イオン相互作用の形成を介して粒状ゲルに集合します(図1A)。κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地は、応力を受けると、降伏、せん断減粘、可逆的なジャミング-アンジャミング遷移などの特徴的な挙動を示します。これらはすべて、埋め込み型3Dバイオプリンティングの成功に不可欠です。図1Bは、フローランプ試験における粒状κ-カラギーナンゲルの代表的な収率挙動とせん断減粘を示しています。せん断速度が 0.001 から 10 ^s-1 に増加すると、0.35% (wt/vol) 粒状 κ-カラギーナンゲルのせん断応力は、0.3 ^s-1 未満のせん断速度で比較的変化せず、3.5 Pa の低降伏応力を示します。その後、せん断応力はせん断速度とともに直線的に増加することが観察され、ビンガム流体の流れの挙動に類似していることが示唆されています。さらに、κ-カラギーナンサブマイクロゲルのひずみスイープレオロジー測定により、ゲルからゾルへの独特の遷移が明らかになりました。これらのゲルは、10%を超える株で収率し、35%株でゲルゾル転移を起こします(図1C)。亜微粒子ゲルの小さな降伏ひずみは、水素結合とカチオン性相互作用によって確立された物理ネットワークに起因します。このようなゲルゾル転移挙動は可逆的です。図1Dに示すように、ひずみが100%の場合、κ-カラギーナンサブマイクロゲルの貯蔵弾性率は38 Paから6 Paに急落し、損失弾性率よりも低く、ゾル状態を示しています。逆に、ひずみが1%に急激に減少すると、貯蔵弾性率は急速に約38Paに戻ります。これは、5秒以内に損失弾性率を上回っており、κ-カラギーナンサブマイクロゲルが粒子間の物理的架橋を迅速に再確立できることを示唆しています。

粒状のκ-カラギーナンゲルは、その小さく均質な形態を特徴とし、せん断減粘特性、迅速な自己回復、および降伏応力挙動を示し、組み込み型3Dバイオプリンティングアプリケーションでの使用に有利です。埋め込み印刷のためのサポートバスとしてのκ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液の有効性を評価するために、10%(wt/vol)ゼラチンメタクリレートと6%(wt/vol)シルクフィブロインメタクリレート複合材料(GelMA/SFMA)からなる広く使用されているバイオインクを、κ-カラギーナン媒体^19,20内の印刷試験に使用している。GelMAは、視覚化を強化するためにローダミンで標識されました²¹。図2Aに示すように、粒状のκ-カラギーナンゲルバスは非常に透明であるため、プリンティングプロセスのリアルタイムモニタリングが容易になります。ノズルによって生成されるせん断速度は、ノズル速度が10〜90 mm / sの範囲内で変化するとき、0.66〜6 ^s-1の範囲です。κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴は、6 ^s-1 と 0.01 ^s-1 の交互速度で連続的な周期的せん断を行うと、20 秒以内に自己修復挙動を示します(補足図2)。15 x 15 x 2 mm³、層厚150 μmのグリッド構造を、κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴内で維持しました。特に、グリッドは顕著な完全性と分解能を示し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)画像によって確認されたように、個々のフィラメントの幅は約200μm、フィラメント間の間隔は約350μmでした(図2B、C)。さらに、3Dグリッド構造は、相互接続された細孔を持つ多孔質ネットワークを特徴としていました。これらは、印刷適性に影響を与え、最終的には細胞の生存、増殖、分化能などの細胞の挙動に影響を与える重要な属性です。

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地の複雑な組織および臓器構造の生成への適合性をさらに確認するために、GelMA/SFMAインクを使用して、80%の高インフィル密度でヒト心臓モデルと三弁弁を作製しました。プリントされた心臓モデルは、主要な静脈や動脈を含む3Dの解剖学的形状を正確に再現し(図2D)、水分除去後の機械的安定性を示します(図2E)。三弁尖心臓弁は、明確な弁尖と支持構造を示しています(図2F)。さらに、コンストラクト内のフィラメントは簡単に剥がれます(図2G)。さらに、食道のような階層的な循環モデルが正確に再現されています。図2Hおよび図2Iに示すように、印刷された食道は、対応する食道組織層を複製するために個々の層間に明確な境界があり、明確な層別化を示しており、κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地が組織工学に必要な構造の複雑さをサポートしていることを示唆しています。現在のモデルでは、本物のヒト組織や臓器の全機能を再現するには不十分ですが、κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスは、複雑な組織や臓器のin vitro製造のための実行可能で有望な戦略を提供する可能性があり、研究、治療、診断への応用が期待できます。

縦方向と横方向の異方性を持つグリッドスキャフォールドは、食道の筋肉層を模倣しています(図3A、B)、明確な内側の円形の筋肉層と外側の縦方向の筋肉層で構成されています。この異方性構造を in vitroで再現するために、ウサギ食道平滑筋細胞(eSMC)をGelMA/SFMAバイオインク内に慎重に埋め込みました。 κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を利用することにより、食道の二層筋構造によく似たeSMCを用いた生体模倣足場が成功裏に達成されました。ハイドロゲル内にカプセル化された細胞の生存率は、培養の5時間後のLive/Dead染色で評価されました。その結果、ハイドロゲルネットワーク内には生細胞(緑色に染色)が優勢に存在し、死細胞(赤色に染色)の割合が最小限に抑えられており、高い細胞生存率が示されました(図3C)。定量分析では、最大92%という非常に高い生存率が示されました(図3D)。これらの結果は、ハイドロゲル材料の生体適合性、および細胞の完全性を維持するためのプリンティングおよび架橋法の有効性を示しています。GelMA/SFMAコンストラクト内の細胞形態をさらに調べるために、細胞培養の3日後にファロイジン(緑)/DAPI(青)の画像を撮影しました。 図3Eに示すように、生体模倣コンストラクト内のかなりの数のeSMCは、3日間の培養後に示されるように、豊富な偽足を投影し、マイクロファイバーに沿った整列を示しました。3D再構成により、食道筋層の正確な再現がさらに確認されます(補足図3)。さらに、eSMCの増殖は、1日目、7日目、および14日目にCCK-8アッセイを使用して評価されました。450 nmでの吸光度の値は、1日目から7日目および14日目にかけて著しく増加し、堅牢な増殖挙動を反映しています(補足図4)。これらの結果は、 κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地が高品質のバイオミメティックバイオプリンティングを促進する大きな可能性を示しています。

図1:自己組織化 κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地とそのレオロジー分析。 (A)水素結合と陽イオン相互作用によって形成される κ-カラギーナンサブマイクロゲルフロートの模式図、埋め込み型3Dバイオプリンティング用。(B) 25 °Cで0.35%(wt/vol)詰まった κ-カラギーナンサブマイクロゲル上のフローランプ (C) 25°Cで0.1%から100%の範囲の振幅スイープによる κ-カラギーナンサブマイクロゲルのゲルゾル転移の測定 (D) 25°Cで1%と100%のひずみを交互に繰り返す連続的なサイクリックせん断による0.35%(wt/vol) κ-カラギーナンサブマイクロゲルの自己修復の分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2: κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴を用いたローダミン標識GelMA/SFMAインクの高忠実度埋め込み3Dバイオプリンティング (A) κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液槽内の埋込3Dプリンティングのリアルタイム観察。(B、 C)(B)3D再構成と(C)プリントされたグリッドの内部構造を示す共焦点レーザー走査型顕微鏡画像。(D、 E)水溶液(D)とその自然な状態(E)で3Dプリントされた心臓のようなモデルの写真。(F)三弁尖心臓弁の写真と(G)フィラメントが構築物から剥がされている写真。(H)上面と(I)GelMA/SFMAインクで印刷された食道模型を捉えた正面写真で、階層的な4層構造を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3: κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴を用いた細胞含みバイオプリンティング (A、 B)(A)食道の内側の円形および外側の縦方向の筋肉構造と(B)埋め込まれた3Dバイオプリンティングによって生成された異方性食道筋層の生体模倣足場の模式図。(C)生/死染色画像、および(D)5時間後のGelMA/SFMA足場で増殖したeSMCの定量的生存率(E)3日目のGelMA/SFMA足場で増殖したeSMCの投影画像。左から右へ:原子核、F-アクチン、およびマージビュー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1: (A) κ-カラギーナンサブマイクロゲルの均質な形態を示す走査型電子顕微鏡画像。(B) κ-カラギーナン微粒子の直径分布をレーザーナノメートル粒度分析装置で測定した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:25 °Cで0.01 ^s-1および6 ^s-1の速度で連続的に繰返しせん断したときの0.35%(wt/vol)のκ-カラギーナンサブマイクロゲルの自己回復分析。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3: 印刷されたグリッドの3D再構築画像。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:1日後、7日後、および14日後にGelMA/SFMAハイドロゲルにカプセル化されたeSMCの増殖活性を、CCK-8アッセイ(n = 3)を使用して評価しました。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続く 3 つのグループ (**p<0.01、****p、0.0001) 間のテューキー事後分析によって分析<。データは平均±標準偏差として表示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

バイオプリンティングで使用する κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴の調製は、得られた培地がバイオインクを支えるための望ましい特性を示すことを保証するためのいくつかの重要なステップを含む、慎重に調整されたプロセスです。最初に、 κ-カラギーナン溶液は、 κ-カラギーナン粉末を高温で脱イオン水に溶解することにより調製され、均質な混合物が作成されます。溶液の濃度は重要であり、その後のゲル化のために最適化する必要があります。0.3-0.6%(wt/vol) κ-カラギーナンは、埋め込み型3Dバイオプリンティングで優れた性能を示しました¹⁵。冷却すると、この溶液はバルクゲルに移行します。

次に、バルクゲルを機械的粉砕戦略にかけ、サブマイクロゲル粒子を生成します。これには、ゲルを均一なサイズの粒子に分解する高せん断力の機械的力が含まれます。せん断強度、時間、温度などの研削プロセスパラメータは、目的の粒度分布を達成するために正確に制御されます。粉砕後、サブマイクロゲル粒子は凝集や溶解を防ぐために25〜37°Cで保存されますが、これは複雑なバイオプリンティングタスクをサポートする均一な懸濁液を維持するために不可欠です。ゲルはすぐに調製して使用することをお勧めします。

κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液バスの製造は操作が簡単で、産業用途や大規模な組織工学および再生医療の取り組みに対する需要の高まりとの整合性を確保します。さらに、κ-カラギーナンサブマイクロゲル懸濁液浴は、細胞適合性PBSまたは培地を溶媒として採用しているため、優れた生体適合性を確保し、バイオプリントされたコンストラクト内の細胞を支持するための理想的な培地となっています。粒状ゲルの貯蔵寿命は、無菌調製条件下で約1ヶ月です。

ビンガム塑性流動挙動(図1B)を特徴とする κ-カラギーナンサブマイクロゲル浴は、優れたせん断減粘特性と迅速な自己修復能力(図1C、D)を示し、印刷されたコンストラクトの精度を高める上で極めて重要です。このサブマイクロゲルバスの適用は、多層構造を特徴とする組織の作成に効果的であることが証明されており(図2)、高い忠実度と分解能で構造の生成を保証します。注目に値するのは、細胞を多く含むバイオインクに埋め込まれた細胞における偽足の急速な伸展能力(図3)であり、この浴と細胞プロセスとの適合性を強調しています。その結果、この κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスは、 in vitro 組織および臓器作製の分野で変革的な期待を秘めています。これは、より複雑で実行可能で機能的に統合的な組織構造の開発を可能にすることにより、組織工学と再生医療に大きな影響を与える立場にあります。

バイオプリンティングや組織工学のアプリケーションのための κ-カラギーナンサブマイクロゲルバスのかなりの可能性にもかかわらず、いくつかの課題と制限がまだ存在します。主な懸念事項は、その組成が細胞培養培地によく似ていることであり、これは大きな臓器の拡張印刷中に細胞の生存率を維持するために重要です。 κ-カラギーナンサブマイクロゲルは、主にPBSを溶媒として使用して製造されるため、材料を溶解するためにさまざまな細胞培養培地を組み込む必要があります。PBSに加えて、 κ-カラギーナンも塩化カルシウム溶液を使用して糊化されます。しかし、塩化カルシウム溶液は細胞に毒性を引き起こしたり、浸透圧の不均衡を引き起こしたりする可能性があります。したがって、細胞培養培地の使用は、 κ-カラギーナン溶媒および架橋剤にとって理想的です。さらに、マイクロゲルのハイスループット無菌生産を実現することは、大きな課題です。 κ-カラギーナン溶液の滅菌には、高温で0.22μmフィルターによるろ過が必要です。しかし、無菌 κ-カラギーナンの収率は、PBS溶液の品質やろ過プロセス中の κ-カラギーナンの冷却など、さまざまな要因によって妨げられることがよくあります。各ろ過バッチでは、通常、20〜50 mLの滅菌 κ-カラギーナンしか得られず、 これがκ-カラギーナンマイクロゲルのハイスループット生産に大きな障壁をもたらします。したがって、今後の研究では、バイオファブリケーションプロセスの最適化、長期的な細胞生存率と機能の評価、およびプリントされた組織の生体システムへの統合の探求に焦点を当てます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3Dバイオプリンター	カスタム設計
4',6-ジアミディノ-2-フェニルインド	ソーラーバイオ ライフサイエンス	C0065	すぐに使える
405nm UVライト	EFL	XY-WJ01
セルカウンター	コーニング	Cyto smart 6749
共焦点レーザー走査型顕微鏡	ライカ	STELLARIS 5
DMEM高グルコース	VivaCell	C3113-0500	高グルコース、ピルビン酸ナトリウムとL-グルタミン
ダイナミック回転レオメーター	TA機器	ディスカバリー HR-20
食道平滑筋細胞	寧波大学健康科学センター細胞生物学・再生医学科より提供	ウサギ食道初代細胞
		F9070L
フルオレセイン イソチオシアネート標識ファロイジン	Solarbio ライフサイエンス	CA1610	300T
ゼラチンメタクリレート	EFL	EFL-GM-60	60% 置換
k-カラギーナン	アラジン	C121013-100g	試薬グレード
リチウム フェニル (2,4,6-トリメチルベンゾイル) ホスフィン酸	アラジン	L157759-1g	365~405 nm
		C2015M
マイクロプレートリーダー	ポテノフ	PT-3502B
パラホルムアルデヒド	Solarbio Life Science	P1110	4%
ペニシリン/ストレプトマイシン	Solarbio Life Science	MA0110	100 ´
リン酸緩衝生理食塩水	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
絹フィブロインメタクリレート	EFL	EFL-SilMA-001	39% 置換
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
Trypsin-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%, フェノールレッドなし