マウスの嗅覚機能に及ぼす吸入環境汚染物質の影響の研究

サマリー

この論文では、マウスの吸入環境汚染物質曝露が嗅覚機能に及ぼす影響を評価するための、埋没食品試験と社会的臭識別実験について詳しく説明しています。

要約

嗅覚障害は重大な公衆衛生問題であり、神経変性疾患のリスクを独立して予測します。吸入された環境汚染物質への曝露は、嗅覚を損なう可能性があります。そのため、吸入された環境汚染物質への曝露が嗅覚に及ぼす影響を評価する方法が急務となっています。マウスは、高度に発達した嗅覚系と行動特性により、嗅覚実験に理想的なモデルです。マウスの吸入環境汚染物質曝露が嗅覚機能に及ぼす影響を評価するために、実験の準備、実験施設の選択と建設、試験プロセス、および時間の指標を含む詳細な埋設食品試験と社会的臭識別実験が提供されます。一方、アッセイの成功を確実にするために、計時装置、操作の詳細、および実験環境について説明します。硫酸亜鉛は、実験的アプローチの実現可能性を実証するための処理として使用されます。このプロトコルは、マウスの嗅覚機能に対する吸入環境汚染物質の影響を評価するためのシンプルで明確な運用プロセスを提供します。

概要

嗅覚障害は、注目すべき公衆衛生上の懸念事項として浮上しており、神経変性疾患のリスク増加と独立して関連しています。この状態は、全体的な健康に悪影響を及ぼし、抑うつ症状の発症に寄与し、生活の質の低下をもたらす可能性があります。その影響は、食べ物に対する認識の変化、社会的コミュニケーションの障害、および否定的な感情の高まりに顕著に見られます¹。副鼻腔疾患、上気道感染症、外傷性脳損傷など、さまざまな要因がヒトの嗅覚障害の一因と考えられています²。特に、PM2.5などの吸入可能な環境汚染物質は、2%から16%の範囲と推定され、吸気を介して体内に入り、鼻腔を横断し、特定の嗅覚専用領域に到達して沈着します3,4,5,6,7。最近の発見は、PM2.5やアンモニアを含む吸入可能な環境汚染物質が実際に嗅覚ニューロンに害を及ぼす可能性があることを示しています^8,9,10。しかし、その損傷が直接的に嗅覚障害につながるかどうかは、さらなる検証が必要です。したがって、吸入可能な環境汚染物質が嗅覚機能に及ぼす影響を綿密に評価することは特に重要です。

現在、多くの研究室で、嗅覚機能の変化を理解することを目的とした行動実験の代替脊椎動物モデルとしてマウスが採用されています11,12,13,14。マウスは、脊椎動物の化学的コミュニケーションを研究するための好ましいモデルシステムとして選択され、採餌および社会的コミュニケーションに不可欠な顕著な嗅覚感度を示す¹⁵。さらに、マウスの行動を観察し、影響を与えるためのツールが絶えず進化していることから、この種は嗅覚機能の研究にとって非常に魅力的なものとなっています¹⁶。

本研究では、吸入性環境汚染物質に曝露されたモデルマウスの嗅覚障害を評価するために、埋設食品試験と社会臭識別実験を用いた。評価の精度を高めるために、嗅覚機能の評価に最も代表的な方法を選択しました。私たちは、この方法を体系的に改良して、簡便性と明瞭さを確保し、吸入可能な環境汚染物質によって引き起こされる嗅覚機能障害の程度を効果的に測定できるようにしました。

プロトコル

すべての行動試験に雄のC57BL/6Jマウス(生後6-8週齢、体重20-22g)を用いた。マウスは、定常条件(すなわち、温度、23±1°C、湿度、55%±5%、および7:00にライトが点灯した12/12時間の明暗サイクル)にさらされました。すべての行動テストは10:00から17:00の間に行われました。すべての動物実験は、青島大学の動物実験専門委員会の倫理委員会によって承認されました。1週間の順応期間の後、すべてのマウスを吸入可能な環境汚染物質に曝露した。

1.汚染物質への曝露

1. 点眼による鼻腔内投与
   1. 吸入可能な環境汚染物質を0.9%生理食塩水に溶解します。5%硫酸亜鉛溶液を一度使用すると、嗅覚機能障害を引き起こすことが実証されています¹⁷。対照マウスには、0.9%生理食塩水を投与します。
   2. 1% ペントバルビタールナトリウム¹⁸ の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけ、つま先つま先つまみ反射を使用して麻酔の深さを評価します。マウスの目に獣医軟膏を塗布し、乾燥を防ぎます。マウスを背にして傾斜面に置き、頭を下に向けてください。
   3. ピペッティングガンを使用して、マウスの片方の鼻孔に10μLの溶液を投与し、溶液を自然に鼻腔に吸い込むことができます。
   4. マウスの健康を確保し、潜在的な不快感を防ぐために、10分間隔でもう一方の鼻孔の吸入を繰り返します。
   5. マウスに点鼻鼻投与後3日目に、埋没食試験を行います。

2.埋没食品試験

1. テストの18〜24時間前に、ホームケージのフードホッパーからすべてのチャウペレットを取り除いて、食物剥奪を実施します。マウスの寝具材料を交換します。ウォーターボトルを取り外さないでください。
2. 手術台を以下のように配置します。
   1. 試験開始の1時間前に、マウスの入ったケージを手術室に持って行き、休ませてください。
   2. この期間中は手術室を手配してください。透明なPVC標準マウスケージを使用してAとマークすると、身近な環境になります。テストケージを使用して、透明なPVC標準のリスケージであるBとしてマークします。実験後にマウスを配置するために使用した一般的なケージをケージCとしてマークします。
   3. ケージAとBを3cmの寝具で覆い、定規で測定します。ケージを並べて配置し、各ケージ間に0.5mの距離を空けます(図1)。
   4. 実験エリアを半径 2 m のエリアと定義し、中心をケージの中心とします。2 m の範囲外のエリアを観測エリアとして定義します。
   5. ケージCおよび未試験マウスを含むケージは、実験エリアからできるだけ離してください。
3. 以下で説明するように、食べ物を見つける時間を記録します。
   1. ケージBでランダムに位置を選択し、寝具の表面から1cm下に餌を埋め、寝具の表面を滑らかにします。
   2. マウスをケージAに4分間入れます。タイミング終了時にマウスをケージBに移し、ビデオデバイスの電源を入れて観察エリアに戻ります。
   3. マウスが前足でフードブロックを拾い上げたら、ビデオ録画を停止します。場合によっては、マウスが頭を食べ物に曲げて食べているのを見ることができます。この動作は、マウスが前足で食べ物を保持していない場合でも、試行の成功を示します。
   4. データを記録します。ケージBの底にあるマットに接触してから、各マウスの餌が見つかるまでの時間を記録します。マウスが4分経っても餌を見つけられない場合は、検索時間を240秒の遅延時間として記録します。
   5. テスト後、マウスをケージCに入れます。
   6. ケージBから飼料を取り出し、密封された袋に入れます。ケージBのフードを交換し、以下に説明するように、寝具の材料を交換した後、次のマウスをテストします。
      1. 同じケージに収容されたマウスの場合は、ケージBの同じ寝具材料セットで試験します。異なるケージのマウスの場合は、ケージをアルコールで洗浄し、寝具材料を交換してください。
   7. 実験後、マウスに飼料と水を加えます。1日後に社会臭識別実験を行う。
      注:プロセス全体を通してマスクを着用する必要があり、マウスが実験を終えるたびに透明な手袋を交換して、臭気の交差をできるだけ避ける必要があります。マウスのストレスを避けるために、動きの振幅をできるだけ小さく保ちます。

3. 社会臭識別実験

1. 尿コレクション
   1. 性的に成熟した雄マウスと雌マウスの尿を別々に収集し、等量のチューブにアリコートします¹⁹。2 mLの微量遠心チューブに詰め、各チューブに300 μLの尿を入れます。
   2. サンプルは使用するまで-80°Cで保管してください。解凍後、サンプルを均等に分散させるためにチューブを振ってください。サンプルを解凍して凍結することを繰り返しないでください。
2. 手術台を以下のように配置します。
   1. 試験開始の1時間前に、マウスの入ったケージを手術室に持って行き、休ませてください。
   2. この期間中に、手順2.2.2-2.2.5で説明されているように手術室を配置します。
3. 以下に説明するように、尿を見つける時間を記録します。
   1. ケージBの2つの広い側面のそれぞれの周りにテープで溝を作り、300μLの男性と女性の尿が入った微量遠心チューブを保持するのに十分な大きさにします。チューブを置き、今のところ2つのチューブカバーを閉じたままにします。
   2. マウスをケージAに入れ、4分間のカウントダウンを設定します。タイミングの終わりにケージBの2本のチューブを開きます。
   3. マウスをケージBの中央位置、2つのチューブから同じ距離に移してから、ビデオ録画装置の電源を入れ、静かにゆっくりと観察エリアに移動します。
   4. マウスがチューブの壁/口、またはチューブの内側を嗅ぐと、チューブの匂いがうまく嗅ぎつけられます。このとき、ストップウォッチを押して、チューブの匂いを嗅いだ時間(MS s)として時間を記録し、マウスがチューブから離れるまで滞留時間(XS)を記録し続けます。
   5. 他のチューブを嗅ぐ時間の計時を続けます。マウスがチューブの壁/口、またはチューブの内側を嗅ぐと、チューブの匂いがうまく嗅ぎつけられます。ストップウォッチを押して、他のチューブの匂いを嗅ぐのにかかった時間(NS)を記録し、マウスがチューブから離れるまで滞留時間(Y s)を記録し続けます。
   6. 実験の最後にマウスをケージCに移します。
   7. マウステストのたびに、ケージBの尿チューブと寝具材を交換してください。使用済みのネズミの尿は、性別に合わせてきれいな袋に入れてください。
   8. 手袋を交換し、上記のように次のマウスをテストします。
4. 実験室で実験を行い、明らかな臭いがしないようにしてください。強い臭いを発する個人用製品は避けてください。施術中は手袋とマスクを着用し、臭いができるだけ伝わらないようにしてください。マウスのストレスを避けるために、動きの振幅をできるだけ小さく保ちます。

結果

吸入可能な環境汚染物質は、マウスの嗅覚機能を損ないます。焼却炉や自動車から排出される大気中の亜鉛は、アレルギー性肺炎を引き起こす可能性のある吸入汚染物質であることが実証されています²⁰。硫酸亜鉛は、嗅覚機能障害を引き起こす典型的な化合物の1つと考えられています²¹。そこで、マウスを鼻腔内投与で曝露する治療薬として硫酸亜鉛を使用し、埋込食物試験や社会臭識別実験を用いた試験を行っています。食物埋葬試験では、硫酸亜鉛に曝露されたマウスが食物を見つけるのに、対照群と比較して240秒以上かかりました(図2)。正常な嗅覚を持つ食物を奪われたマウスは、通常、1分以内に埋もれた食物を見つけます。マウスが嗅覚機能障害を発症すると、餌を見つけるのに時間がかかり、餌を見つけることができなくなったりしました。対照群と比較して、ばく露群のマウスは餌を見つけるのに時間がかかり、240秒以内に餌を見つけられない例もあり、嗅覚機能の損傷を示しています。

同様の結果は、社会的臭気識別実験でも観察されました。硫酸亜鉛にばく露されたマウスでは、設定された観察時間中に雄も雌の尿も嗅ぐことができませんでした(図3A)。設定時間を超えて、硫酸亜鉛ばく露マウスは短時間、雌と雄の尿を嗅ぎましたが、嗅ぎ時間は対照マウスよりも有意に短かった(図3B)。雌と雄の尿が同量同時に提示される場合、雄マウスは通常、雌の尿を好む²²。ばく露群のマウスは、雌と雄の尿を区別するのに長い時間が必要だったか、またはそれらを区別することさえできなかった。具体的には、対照群と比較して、ばく露群のマウスは尿の匂いを嗅ぐ時間が長く、尿の近くで過ごす時間が短かった。

図1:手術テーブルのレイアウト。 ケージAとケージBは0.5mの距離に保たれました。ビデオ録画機器は、携帯電話ホルダーによってケージBの上で制御され、ビデオフィールドはケージの内部環境を記録するように調整されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:埋もれた食品検査結果。 対照マウスと食物探索で硫酸亜鉛に曝露したマウスの統計解析対照群のマウスは30秒以内に食物を見つけ、硫酸亜鉛に曝露されたマウスは240秒以上食物を見つけました(これは240秒と計算されました)。独立サンプルのt検定を使用して、2つのグループ間の差を比較しました。データは平均±SDとして表されます(n = グループあたり3匹のマウス)。** p < 0.01.240秒後に餌を見つけられなかった動物がいた場合、処理されたすべての動物の場合と同様に、餌を見つける時間は240秒と記録されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:社会臭識別実験 (A)尿を求めて硫酸亜鉛に曝露した対照マウスとマウスの統計解析。対照群のマウスは30秒以内に尿を発見し、硫酸亜鉛に曝露されたマウスは、雌または雄の尿を探すのに240秒以上を費やし、これは240秒とカウントされました。240秒後に尿バイアルを見つけられなかった動物がいた場合、バイアルを見つけるまでの時間は、処理されたすべての動物の場合と同様に240秒と記録されました。(B)対照マウスおよび硫酸亜鉛ばく露マウスについて、尿と接触する滞留時間を統計的に解析した。独立サンプルのt検定を使用して、2つのグループ間の差を比較しました。データは平均±SDを示しています(n = グループあたり3匹)。** p < 0.01, * p < 0.5. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、マウスの嗅覚障害を迅速に評価するために設計された2つの基本的なプロトコルを紹介します。さまざまな吸入可能な環境汚染物質は、マウスの異なるレベルの嗅覚機能障害をもたらします。埋没食品試験は揮発性の臭気を検出する能力を評価するために使用され、社会的臭識別実験は、動物がさまざまな社会的臭気を識別し区別する能力を評価します。ここでのプロトコルは、環境汚染物質が嗅覚機能に及ぼす毒性影響を評価するのに役立ちます。

オゾン、アンモニア、ディーゼル排気ガスなどの吸入された環境汚染物質は、サンプルスニッフィング^23,24中のマウスの嗅覚に影響を与える可能性のある臭気を持っています。曝露の終了直後にマウスで行動実験を行うと、偽陰性の結果が生じる可能性があることに注意することが重要です²²。この懸念に対して、実験の信頼性を高めるための対策を実施しました。具体的には、ケージの清掃を徹底し、曝露期間後に寝具材を交換しました。続いて、ばく露後24時間間隔で行動実験を行った²²。この手続き上の調整は、正確で意味のある結果を確保することを目的としています。

食物埋葬実験では、マウスが隠された食物を見つけるのにかかった時間が重要なパラメータでした。ストレスを受けたマウスは、試験中に活動性が亢進し、集中力が低下する傾向があり、これが偽陽性の結果^25,26,27,28につながる可能性があることは注目に値する。したがって、マウスが落ち着いていて、試験段階で過度のストレスを受けないようにすることが不可欠です。潜在的な干渉を避けるために、マウスは実験の1時間前にハウジングから試験エリアに移されました。このステップは、マウスが順応し、ストレスを軽減するために行われました。正確な時間記録を容易にするために、マウスを実験ケージBに導入したときにビデオレコーダーを作動させ、その後、観察者はすぐに観察エリアに後退しました。オブザーバーはケージから最適な距離2mに配置され、邪魔をすることなく明確な観察を確保しました。食品の発見が成功したと特定するための基準には、マウスが前足を使ったり、食べ物の上で頭を曲げたりした例が含まれていました。どちらの行動も、広く受け入れられている基準¹⁹と一致して、食べ物を見つけることを示していると考えられていました。また、同じ投与群の複数のマウスについて試験が必要な場合には、元の飼育ケージに戻さず、通常のケージCに一時的に入れることが確認されました。同じケージ内のすべてのマウスをテストした後でのみ、彼らは集合的に元のハウジングに戻りました。試験した食品には臭いが潜むため、あらかじめ密閉袋に入れて保管し、使用後は密閉し直すか密閉容器に入れるなどの注意を払っていました。これらの措置は、実験条件の完全性を維持し、信頼性の高い結果を確保するために実施されました。

社会臭識別実験では、性成熟マウス由来の尿サンプルを利用することが不可欠^である19。性成熟度の決定はマウスの年齢に基づいており、このパラメータはマウスの系統によって異なります。採取後は、男性と女性の尿を別々に-80°Cの冷蔵庫に保管することをお勧めします。 以前の研究では、計時目的でストップウォッチが採用されていました。しかし、この方法には、観測者が実験ケージからかなり離れた場所に配置されるなどの制限があり、観測が不明確になったり、タイミングが不正確になるなどの潜在的な問題を引き起こしました19,22,29。これらの課題に対処するため、ストップウォッチの代わりにビデオ機器を組み込むことで、計時手順を強化しました。この変更により、より精度の高いデータの取得が容易になるだけでなく、複数の実験グループからのデータ収集も可能になります。

これらの実験では、ビデオデバイスを用いてマウスの行動を記録したが、これによりビデオのフレームレートが小さくなり、観察者がマウスの様々な行動活動の時間をより正確に記録できるという利点があり、観察者が観察エリア内でマウスの行動を観察できなかったという欠点を補うことができた。しかし、動画撮影機器を利用するメリットは、解析時間が長くなることです。実験の最後に、各マウスのさまざまな行動活動の時間を記録するために、ビデオをもう一度見る必要がありました。マウスの数が多いと、各マウスの映像を解析する必要があり、研究室の労働負担が増大します。

研究結果は、さまざまな吸入可能な環境汚染物質が嗅覚機能に悪影響を与える可能性があることを示しています。この論文では、吸入可能な環境汚染物質に関連する嗅覚毒性を評価するための、迅速で複雑でない、合理的に正確なアプローチを紹介します。この方法は、ヒト被験者の環境汚染物質に起因する嗅覚機能障害のリスク評価を行う上で非常に重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5-10 μ;L 調節可能なマイクロピペット	エッペンドルフ、ドイツ	3123000225	鼻腔内点滴
0.9% 生理食塩水	Solarbio	7647-14-5	汚染物質を溶解
無水硫酸亜鉛	マックリン	7733-02-0	マウスをさらす
遠心分離管 (2 mL)	バイオシャープ Incorporated	BS-20-M	Place urine
電子天秤	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	重量 麻酔薬と汚染物質
GraphPad プリズム	GraphPad ソフトウェア	8.0.1	統計分析
ハンドヘルド ダスト検出器	TSI 組み込まれ	DuatTrak 8532	吸入ばく露マウス
ビデオ録画機器	アップル社	iPhone 6s Plus	マウスの活動時間が記録された
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	ボルテックス-5	ミックスソリューション