マウスの嗅覚機能に及ぼす吸入環境汚染物質の影響の研究

サマリー

この論文では、マウスの吸入環境汚染物質曝露が嗅覚機能に及ぼす影響を評価するための、埋没食品試験と社会的臭識別実験について詳しく説明しています。

要約

嗅覚障害は重大な公衆衛生問題であり、神経変性疾患のリスクを独立して予測します。吸入された環境汚染物質への曝露は、嗅覚を損なう可能性があります。そのため、吸入された環境汚染物質への曝露が嗅覚に及ぼす影響を評価する方法が急務となっています。マウスは、高度に発達した嗅覚系と行動特性により、嗅覚実験に理想的なモデルです。マウスの吸入環境汚染物質曝露が嗅覚機能に及ぼす影響を評価するために、実験の準備、実験施設の選択と建設、試験プロセス、および時間の指標を含む詳細な埋設食品試験と社会的臭識別実験が提供されます。一方、アッセイの成功を確実にするために、計時装置、操作の詳細、および実験環境について説明します。硫酸亜鉛は、実験的アプローチの実現可能性を実証するための処理として使用されます。このプロトコルは、マウスの嗅覚機能に対する吸入環境汚染物質の影響を評価するためのシンプルで明確な運用プロセスを提供します。

概要

嗅覚障害は、注目すべき公衆衛生上の懸念事項として浮上しており、神経変性疾患のリスク増加と独立して関連しています。この状態は、全体的な健康に悪影響を及ぼし、抑うつ症状の発症に寄与し、生活の質の低下をもたらす可能性があります。その影響は、食べ物に対する認識の変化、社会的コミュニケーションの障害、および否定的な感情の高まりに顕著に見られます¹。副鼻腔疾患、上気道感染症、外傷性脳損傷など、さまざまな要因がヒトの嗅覚障害の一因と考えられています²。特に、PM2.5などの吸入可能な環境汚染物質は、2%から16%の範囲と推定され、吸気を介して体内に入り、鼻腔を横断し、特定の嗅覚専用領域に到達して沈着します3,4,5,6,7。最近の発見は、PM2.5やアンモニアを含む吸入可能な環境汚染物質が実際に嗅覚ニューロンに害を及ぼす可能性があることを示しています^8,9,10。しかし、その損傷が直接的に嗅覚障害につながるかどうかは、さらなる検証が必要です。したがって、吸入可能な環境汚染物質が嗅覚機能に及ぼす影響を綿密に評価することは特に重要です。

現在、多くの研究室で、嗅覚機能の変化を理解することを目的とした行動実験の代替脊椎動物モデルとしてマウスが採用されています11,12,13,14。マウスは、脊椎動物の化学的コミュニケーションを研究するための好ましいモデルシステムとして選択され、採餌および社会的コミュニケーションに不可欠な顕著な嗅覚感度を示す¹⁵。さらに、マウスの行動を観察し、影響を与えるためのツールが絶えず進化していることから、この種は嗅覚機能の研究にとって非常に魅力的なものとなっています¹⁶。

本研究では、吸入性環境汚染物質に曝露されたモデルマウスの嗅覚障害を評価するために、埋設食品試験と社会臭識別実験を用いた。評価の精度を高めるために、嗅覚機能の評価に最も代表的な方法を選択しました。私たちは、この方法を体系的に改良して、簡便性と明瞭さを確保し、吸入可能な環境汚染物質によって引き起こされる嗅覚機能障害の程度を効果的に測定できるようにしました。

プロトコル

すべての行動試験に雄のC57BL/6Jマウス(生後6-8週齢、体重20-22g)を用いた。マウスは、定常条件(すなわち、温度、23±1°C、湿度、55%±5%、および7:00にライトが点灯した12/12時間の明暗サイクル)にさらされました。すべての行動テストは10:00から17:00の間に行われました。すべての動物実験は、青島大学の動物実験専門委員会の倫理委員会によって承認されました。1週間の順応期間の後、すべてのマウスを吸入可能な環境汚染物質に曝露した。

1.汚染物質への曝露

1. 点眼による鼻腔内投与
   1. 吸入可能な環境汚染物質を0.9%生理食塩水に溶解します。5%硫酸亜鉛溶液を一度使用すると、嗅覚機能障害を引き起こすことが実証されています¹⁷。対照マウスには、0.9%生理食塩水を投与します。
   2. 1% ペントバルビタールナトリウム¹⁸ の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけ、つま先つま先つまみ反射を使用して麻酔の深さを評価します。マウスの目に獣医軟膏を塗布し、乾燥を防ぎます。マウスを背にして傾斜面に置き、頭を下に向けてください。
   3. ピペッティングガンを使用して、マウスの片方の鼻孔に10μLの溶液を投与し、溶液を自然に鼻腔に吸い込むことができます。
   4. マウスの健康を確保し、潜在的な不快感を防ぐために、10分間隔でもう一方の鼻孔の吸入を繰り返します。
   5. マウスに点鼻鼻投与後3日目に、埋没食試験を行います。

2.埋没食品試験

1. テストの18〜24時間前に、ホームケージのフードホッパーからすべてのチャウペレットを取り除いて、食物剥奪を実施します。マウスの寝具材料を交換します。ウォーターボトルを取り外さないでください。
2. 手術台を以下のように配置します。
   1. 試験開始の1時間前に、マウスの入ったケージを手術室に持って行き、休ませてください。
   2. この期間中は手術室を手配してください。透明なPVC標準マウスケージを使用してAとマークすると、身近な環境になります。テストケージを使用して、透明なPVC標準のリスケージであるBとしてマークします。実験後にマウスを配置するために使用した一般的なケージをケージCとしてマークします。
   3. ケージAとBを3cmの寝具で覆い、定規で測定します。ケージを並べて配置し、各ケージ間に0.5mの距離を空けます(図1)。
   4. 実験エリアを半径 2 m のエリアと定義し、中心をケージの中心とします。2 m の範囲外のエリアを観測エリアとして定義します。
   5. ケージCおよび未試験マウスを含むケージは、実験エリアからできるだけ離してください。
3. 以下で説明するように、食べ物を見つける時間を記録します。
   1. ケージBでランダムに位置を選択し、寝具の表面から1cm下に餌を埋め、寝具の表面を滑らかにします。
   2. マウスをケージAに4分間入れます。タイミング終了時にマウスをケージBに移し、ビデオデバイスの電源を入れて観察エリアに戻ります。
   3. マウスが前足でフードブロックを拾い上げたら、ビデオ録画を停止します。場合によっては、マウスが頭を食べ物に曲げて食べているのを見ることができます。この動作は、マウスが前足で食べ物を保持していない場合でも、試行の成功を示します。
   4. データを記録します。ケージBの底にあるマットに接触してから、各マウスの餌が見つかるまでの時間を記録します。マウスが4分経っても餌を見つけられない場合は、検索時間を240秒の遅延時間として記録します。
   5. テスト後、マウスをケージCに入れます。
   6. ケージBから飼料を取り出し、密封された袋に入れます。ケージBのフードを交換し、以下に説明するように、寝具の材料を交換した後、次のマウスをテストします。
      1. 同じケージに収容されたマウスの場合は、ケージBの同じ寝具材料セットで試験します。異なるケージのマウスの場合は、ケージをアルコールで洗浄し、寝具材料を交換してください。
   7. 実験後、マウスに飼料と水を加えます。1日後に社会臭識別実験を行う。
      注:プロセス全体を通してマスクを着用する必要があり、マウスが実験を終えるたびに透明な手袋を交換して、臭気の交差をできるだけ避ける必要があります。マウスのストレスを避けるために、動きの振幅をできるだけ小さく保ちます。

3. 社会臭識別実験

1. 尿コレクション
   1. 性的に成熟した雄マウスと雌マウスの尿を別々に収集し、等量のチューブにアリコートします¹⁹。2 mLの微量遠心チューブに詰め、各チューブに300 μLの尿を入れます。
   2. サンプルは使用するまで-80°Cで保管してください。解凍後、サンプルを均等に分散させるためにチューブを振ってください。サンプルを解凍して凍結することを繰り返しないでください。
2. 手術台を以下のように配置します。
   1. 試験開始の1時間前に、マウスの入ったケージを手術室に持って行き、休ませてください。
   2. この期間中に、手順2.2.2-2.2.5で説明されているように手術室を配置します。
3. 以下に説明するように、尿を見つける時間を記録します。
   1. ケージBの2つの広い側面のそれぞれの周りにテープで溝を作り、300μLの男性と女性の尿が入った微量遠心チューブを保持するのに十分な大きさにします。チューブを置き、今のところ2つのチューブカバーを閉じたままにします。
   2. マウスをケージAに入れ、4分間のカウントダウンを設定します。タイミングの終わりにケージBの2本のチューブを開きます。
   3. マウスをケージBの中央位置、2つのチューブから同じ距離に移してから、ビデオ録画装置の電源を入れ、静かにゆっくりと観察エリアに移動します。
   4. マウスがチューブの壁/口、またはチューブの内側を嗅ぐと、チューブの匂いがうまく嗅ぎつけられます。このとき、ストップウォッチを押して、チューブの匂いを嗅いだ時間(MS s)として時間を記録し、マウスがチューブから離れるまで滞留時間(XS)を記録し続けます。
   5. 他のチューブを嗅ぐ時間の計時を続けます。マウスがチューブの壁/口、またはチューブの内側を嗅ぐと、チューブの匂いがうまく嗅ぎつけられます。ストップウォッチを押して、他のチューブの匂いを嗅ぐのにかかった時間(NS)を記録し、マウスがチューブから離れるまで滞留時間(Y s)を記録し続けます。
   6. 実験の最後にマウスをケージCに移します。
   7. マウステストのたびに、ケージBの尿チューブと寝具材を交換してください。使用済みのネズミの尿は、性別に合わせてきれいな袋に入れてください。
   8. 手袋を交換し、上記のように次のマウスをテストします。
4. 実験室で実験を行い、明らかな臭いがしないようにしてください。強い臭いを発する個人用製品は避けてください。施術中は手袋とマスクを着用し、臭いができるだけ伝わらないようにしてください。マウスのストレスを避けるために、動きの振幅をできるだけ小さく保ちます。

結果

吸入可能な環境汚染物質は、マウスの嗅覚機能を損ないます。焼却炉や自動車から排出される大気中の亜鉛は、アレルギー性肺炎を引き起こす可能性のある吸入汚染物質であることが実証されています²⁰。硫酸亜鉛は、嗅覚機能障害を引き起こす典型的な化合物の1つと考えられています²¹。そこで、マウスを鼻腔内投与で曝露する治療薬として硫酸亜鉛を使用し、埋込食物試験や社会臭識別実験を用いた試験を行っています。食物埋葬試験では、硫酸亜鉛に曝露されたマウスが食物を見つけるのに、対照群と比較して240秒以上かかりました(図2)。正常な嗅覚を持つ食物を奪われたマウスは、通常、1分以内に埋もれた食物を見つけます。マウスが嗅覚機能障害を発症すると、餌を見つけるのに時間がかかり、餌を見つけることができなくなったりしました。対照群と比較して、ばく露群のマウスは餌を見つけるのに時間がかかり、240秒以内に餌を見つけられない例もあり、嗅覚機能の損傷を示しています。

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ディスカッション

この記事では、マウスの嗅覚障害を迅速に評価するために設計された2つの基本的なプロトコルを紹介します。さまざまな吸入可能な環境汚染物質は、マウスの異なるレベルの嗅覚機能障害をもたらします。埋没食品試験は揮発性の臭気を検出する能力を評価するために使用され、社会的臭識別実験は、動物がさまざまな社会的臭気を識別し区別する能力を評価します。ここでのプロトコルは、環境汚染物質が嗅覚機能に及ぼす毒性影響を評価するのに役立ちます。

オゾン、アンモニア、ディーゼル排気ガスなどの吸入された環境汚染物質は、サンプルスニッフィング^23,24中のマウスの嗅覚に影響を与える可能性のある臭気を持っています。曝露の終了直後にマウスで行動実験を行うと、偽陰性の結果が生じる可能性があることに注意することが重要です²²。この懸念に対して、実験の信頼性を高めるための対策を実施しました。具体的には、ケージの清掃を徹底し、曝露期間後に寝具材を交換しました。続いて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5-10 μ;L 調節可能なマイクロピペット	エッペンドルフ、ドイツ	3123000225	鼻腔内点滴
0.9% 生理食塩水	Solarbio	7647-14-5	汚染物質を溶解
無水硫酸亜鉛	マックリン	7733-02-0	マウスをさらす
遠心分離管 (2 mL)	バイオシャープ Incorporated	BS-20-M	Place urine
電子天秤	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	重量 麻酔薬と汚染物質
GraphPad プリズム	GraphPad ソフトウェア	8.0.1	統計分析
ハンドヘルド ダスト検出器	TSI 組み込まれ	DuatTrak 8532	吸入ばく露マウス
ビデオ録画機器	アップル社	iPhone 6s Plus	マウスの活動時間が記録された
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	ボルテックス-5	ミックスソリューション

た