このプロトコルは、妊娠前の雌マウスにおける葉酸またはコリンの食事摂取量を減らす方法を説明しています 母親の食事療法が子孫の健康転帰に与える影響を調査することを目的としています。
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この記事について
サマリー
要約
妊娠中および授乳中の母親の栄養は、子孫の神経発達に重要な役割を果たします。葉酸とコリン、およびその他のビタミンB群を中心とする一炭素(1C)代謝は、発育中の胎児の神経管の閉鎖中に重要な役割を果たします。しかし、妊娠中のこれらの母親の栄養不足が出生後の子孫の健康転帰に及ぼす影響は、比較的未定のままです。さらに、葉酸やコリンの母親の食事不足は、子孫の他の健康上の結果に影響を与える可能性があり、これは貴重なモデルとなっています。このプロトコルは、食事の変更を通じて雌マウスの1C代謝の欠損を誘発する手順を概説することを目的としています。女性は、交配前の4〜6週間、生後2か月までの離乳時に食事療法を受け、妊娠中および授乳中を通じて食事療法を続けます。これらの雌の子孫は、健康状態について評価することができます。雌を複数回使用して子孫を作製し、雌の組織を採取して1C代謝物の測定に役立てることができます。このプロトコルは、子孫の健康転帰を研究するために、葉酸またはコリンの母親の食事不足を誘発する方法の概要を提供します。
概要
妊娠中および授乳中の母親の栄養は、子孫の発達において重要な役割を果たします。一炭素(1C)代謝は、栄養シグナルを生合成、酸化還元恒常性、およびエピジェネティクスと統合する重要な代謝ネットワークです。葉酸とコリンは、神経管の閉鎖に重要な役割を果たす1Cの中心的な成分です。女性が出産期間中に葉酸とコリンを補給することは広く推奨されています1。胎児の発育における葉酸の重要な役割は明確に確立されていますが、その根底にあるメカニズムは不明のままです。出産の女性は、神経管の閉鎖が妊娠初期に起こるため、妊娠する前に葉酸を摂取することをお勧めします2.葉酸やコリンなどの1Cの他の成分が不足している妊娠中の母親は、妊娠初期に必要なヌクレオチド合成やその他のプロセスに対する需要が高いため、神経管欠損症の子孫を出産する可能性が高くなります3。
1C代謝摂取が不足している母親の食事が子孫の健康転帰に及ぼす長期的な影響は、よくわかっていません。私たちの研究室や他の研究室の研究は、葉酸またはコリンのいずれかが不足している母親の食事が、前臨床モデルを使用して虚血性脳卒中後の子孫の健康転帰に実際に影響を与えることを示しています4,5,6。母親の食事の影響は、脳の体積が小さく、メチル化レベルが変化したことが報告されている臨床研究でも示されています7。健康と疾患の発達的起源(DOHaD)理論は、将来の慢性疾患が子宮内でプログラムされていることを示唆しています8,9、そして母親の食事療法は重要な役割を果たしています。
このプロトコルは、妊娠前の雌マウスの1C食事摂取量を変更する方法を概説するように設計されており、母親の栄養が子孫の健康転帰に及ぼす影響を調べることを目的としています。
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プロトコル
このプロトコルは承認され、すべての動物被験者は、ミッドウェスタン大学の施設動物管理および使用委員会(プロトコル2983)のガイドラインに従って使用されました。この研究では、生後2ヶ月(体重、~20g)の雌C57BL/6Jマウスを使用しました。一般に、生殖年齢の雌マウスを用いることができる10。同腹児の影響を確実に回避するためには、各ダイエットに複数の女性を使用する必要があります11。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. 実験の準備
- 市販のげっ歯類食品メーカーから葉酸またはコリン欠乏症の食事を入手してください。不足している食事に必要な葉酸またはコリンの正確な量を含む、微量栄養素と多量栄養素の詳細なリストについては、 表1 を参照してください。
注:対応するコントロールダイエットも注文する必要があります。詳細については 、表 1 に示します。これらの食事はAIN93Gに基づいており、げっ歯類10に推奨される栄養素が含まれていました。 - メーカーと協力して、実験的研究中に正しい食事を配布するのに役立つため、食事の着色を決定します。この研究では、葉酸欠乏食には緑、コリンには黄色、対照食には白を使用しました。それらはすべて簡単に区別できます。
注:水の消費量に制限はありません。この水には、葉酸、コリン、またはその他の1C代謝物は含まれていません。
2.葉酸またはコリン食の欠乏症を誘発する
- 女性を食事にする前に、すべての動物の体重を量ってください。これは、ベースラインウェイトと呼ばれます。
- 個々のラボ用ケージのセットアップ(換気ありまたは換気されていない、 材料の表を参照)に応じて、週に数回、各ケージの特別な食事用ペレットを交換または補充します。ケージフードフーパーに特別な食事を与えすぎると、ペレットが動物の唾液と相互作用して劣化し、時間の経過とともに腐敗する可能性があるため、特別な食事を詰め込まないでください。
注:ダイエットストックがメーカーのガイドラインに従って保管され、有効期限前に使用されていることを確認してください。 - 交配の4〜6週間前に、雌マウスを食事に維持します。
- 雄のマウスを交配のために雌のケージに導入します。女性が最低4〜6週間特別な食事をとった後、男性が女性のケージに導入されることを確認してください。1つのメスケージに1〜数日間、1匹のオスを導入します。
注:本研究では、マウスでの交配は出生後に発生する可能性があるため、生成される子犬の数を増やすために、実験の全期間(~4か月)にわたって雄を雌と一緒に飼いました12。生後6ヶ月以降の女性は、どの研究にも使用されなかった。 - 雌マウスを毎日チェックして、交尾プラグがないか確認してください。これは、繁殖が行われたことを示しています。
- 雌マウスの体重測定値を毎週収集して、健康状態と妊娠状況を追跡します。
注:女性が妊娠(~21日)と授乳(~21日)の食事療法を維持することは安全です。 - 子孫が母親から離乳したとき(生後~21日)、葉酸とコリン欠乏の食事、および対照食を与えます。詳細については、結果のセクションを参照してください。
注:母親の食事が子孫の健康転帰に与える影響を研究する場合、離乳後に子孫を対照食にすることをお勧めします。対照食には、生存のために十分な量のビタミンと栄養素が含まれている必要があります。 - 研究の終わりに(葉酸またはコリン欠乏症の食事で維持されている女性の全体的な健康状態を監視するための毎週の体重を決定する)、CO2 の過剰摂取を使用して母親を安楽死させます(投与量、毎分10%〜30%の体積変位、施設で承認されたプロトコルに従って)、組織を採取します(ステップ3)食事不足を確認します。
3. 1Cおよび関連代謝物の測定のための組織採取
注:動物を安楽死させるときは、動物がつま先のつま先に反応しないことを確認することが重要です。動物が反応しなくなったら、組織の解剖を開始できます。解剖される組織は、事前に決定する必要があり13、14、材料を準備する必要がある。これらの材料には、保管用のチューブ、適切な解剖ツール、ドライアイスまたは液体窒素が含まれます。
- 以前に公開されたプロトコル15,16に従って血液と肝臓組織を収集します。
- 以下の手順に従って、心臓穿刺を使用して~500-1000μLの血液を採取します。詳細については、Parasuraman et al.17を参照してください。
- 皮膚と腹壁にV字型の切り込みを入れます。腹部の臓器を脇に動かし、横隔膜から心臓に針を挿入して血液サンプルを採取します。
- 血液サンプルをEDTAコーティングチューブに入れます。チューブは、すべてのサンプルが収集されるまで室温で放置できます。
- 血液サンプルを遠心分離機で1000〜2000 x g で4°Cで7分間スピンダウンし、血漿を分離します。血漿を1.5 mLのマイクロチューブに集め、分析まで-80°Cで保存します。
- 肝臓を切除するには、腹部を開き、以前に公開されたプロトコル15に従って肝臓全体を解剖します。
- 肝臓を体腔から取り出した後、小さなハサミで組織を細かく切り、ドライアイスまたは液体窒素を使用してスナップフリーズします。
注:凍結した組織片は、1.5 mLの極低温微量遠心チューブに入れ、分析まで-80°Cに保つことができます。
- 肝臓を体腔から取り出した後、小さなハサミで組織を細かく切り、ドライアイスまたは液体窒素を使用してスナップフリーズします。
- 以下の手順に従って、心臓穿刺を使用して~500-1000μLの血液を採取します。詳細については、Parasuraman et al.17を参照してください。
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結果
この研究の焦点は、母親の食事不足が葉酸またはコリンに及ぼす影響が子孫の健康転帰に及ぼす影響を調査することでした。毎週の体重は、葉酸またはコリン欠乏食で維持されている女性の全体的な健康状態を監視するために決定されました。私たちの以前の研究では、母親の食事グループ間で体重の変化は観察されませんでした4。 図1 は、交配前の4週間に対照食、コリン欠乏食、または葉酸欠乏食で維持された雌のベースライン体重と週体重を示しています(F(1.144,4.577)= 11.96、 p = 0.196)。一般的な観察では、これらの特別な食事の子孫の数は、標準的なマウスチャウと比較して子孫の数が減少しています。これは統計的に有意であるとは判断されていません。
雌マウスに1Cが不足している食事(葉酸またはコリン)を与えると、1Cを処理する体組織内の代謝産物に変化が生じます。1Cおよび関連代謝物の測定は、さまざまな手法を用いて行うことができます。本研究では、前述...
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ディスカッション
このプロトコルを研究室で実施するにあたり、研究者が実験を開始する前に考慮すべき重要な点がいくつかあります。まず、ダイエット製造では、実験的研究を開始する前に、ダイエットを製造するのに十分なリードタイムを与える必要があります。リードタイムは会社によって異なる場合があり、ダイエットの出荷も考慮に入れる必要があります。生殖年齢(生後2~2.5ヶ月)の雌マウスは、交配の4-6週間前に食事を与えることができる4,6,14。これまでの研究では、C57Bl/6Jマウスのみを使用していました4,5,6,18が、他のグループでも同様の研究でBALB/cマウスを使用していました19,20,21。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5mLチューブ | Eppendorf | ||
| C57BL/6 雌マウス | Charles River | 27 | マウスは、家でも飼育できます。 |
| コリン欠乏ダイエット | Envigo | TD.06119 | |
| ダイエット | Envigo | TD.190790 | |
| EDTAチューブ葉 | |||
| 酸欠乏ダイエット | Envigo | TD.01546 | |
| GraphPadプリズム | https://www.graphpad.com/features | ||
| げっ歯類用ハウジングラボ | プロダクツ、LLC | Oneケージベンチレーテッドラック &ケージ | |
| 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC-MS/MS) | SCIEX, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| 超高速液体クロマトグラフィー (UPLC) | 島津製作所, Columbia, MD, USA | Nexera |
参考文献
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