遺伝子および組織特異的エンハンサーを選択するためのWebベースのワークフロー

サマリー

生物学者がブラウザベースのツールのみを使用して組織特異的な遺伝子エンハンサーを特定するためのコーディングフリーのワークフローを紹介します。当社のプロトコルは、公開されているH3K4me1/H3K27acヒストンマークとHi-Cデータを活用し、プログラミングの専門知識を持たない研究者が、関心のある遺伝子に関連する潜在的な調節要素にアクセスし、分析し、特定することを可能にします。

要約

エンハンサーは、遺伝子発現を調節するDNA領域です。エンハンサー内の突然変異は、異常な遺伝子調節を引き起こし、病気につながる可能性があります。したがって、特定の組織における遺伝子活性を調節するエンハンサーを同定することは、疾患の遺伝的基盤を理解するために非常に重要です。しかし、エンハンサーはタンパク質をコードしないため、同定が困難です。数多くのエンハンサーリポジトリと同定ツールが利用可能ですが、これらのツールの複雑さは生物学者にとって課題となる可能性があります。生物学者がこれらのリソースを簡単に使用できるように、H3K4me1やH3K27acヒストンマークなどの既存のWebベースのゲノミクスデータとクロマチンコンフォメーション解析(Hi-C)データを活用して、エンハンサーが活性している標的組織内の目的遺伝子(GoI)に関連するエンハンサーを発見する、生物学者に優しいプロトコル(https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow)を紹介します。このプロトコルは完全にWebベースであり、エンドユーザーのプログラミングスキルは必要ありません。私たちは、心臓の発達に重要な遺伝子であるTBX5を調節する候補エンハンサーを特徴づけることにより、このアプローチの有用性を実証しました。このプロトコルは、左心室におけるこの遺伝子に関連するエンハンサーの同定を容易にする。

概要

エンハンサーは、遺伝子の転写、発生、および細胞分化を調節するノンコーディングDNA領域です^1,2。エンハンサーの突然変異は、発達障害、癌、およびその他の遺伝的状態を含むさまざまな疾患を引き起こす可能性があります3,4,5,6。したがって、エンハンサーを理解することは、遺伝子発現、突然変異、および疾患を理解するために最も重要です。

エンハンサーが標的遺伝子とどのように相互作用するかを理解するためには、ゲノム内の位置を特定することが重要です。しかし、エンハンサーの位置を特定することは必ずしも容易ではなく、エンハンサーは転写開始部位(TSS)の近くとはるかに離れた場所の両方に位置し、数十から数百キロベース^{に及ぶ可能性があります}2,7,8,9。

エンハンサーは、ゲノム上の位置が予測不可能であるにもかかわらず、明確な生化学的および構造的特徴を示し、全身的に追跡することができます。一般に、エンハンサーは遺伝子間領域とイントロン領域に濃縮される傾向があり、エクソン^2,8内には少数の領域が見られます。それらはしばしば、特定のヒストン修飾および転写因子結合によって特徴づけられ、それらがそれらの調節的役割を定義し、異なる発生段階および組織にわたるそれらの時空間活性を決定する^10,11。

ChIP-seqは、転写因子結合部位(TFBS)や、プロモーター領域^1、12、¹³、^14、15に濃縮されるエンハンサーの特徴、H3K4me1、活性エンハンサーマーク、H3K27ac、H3K4me3マークなどのヒストン修飾マークの同定に用いられます。クロマチンコンフォメーションキャプチャー(3C)技術とその誘導体(4C、5C、Hi-C、ChIA-PETなど)は、離れたゲノム領域間の物理的相互作用をマッピングするために使用されます。3Cが特定の組織における特定の相互作用を標的としているのに対し、Hi-Cは細胞タイプ全体でゲノムワイドなアーキテクチャを提供する^16,17。

現在の方法に加えて、EnhancerAtlasやEnhancerFinder^18,19などのプールされたエンハンサーデータベースを含む、エンハンサーの特性評価に特化したアプローチが開発されています。しかし、これらのツールでは、研究者が多くの組織にわたる複数のエンハンサーを調査するために複数のデータセットを統合する必要があることが多く、バイオインフォマティクスやデータマイニングの経験がない生物学者にとっては大変な作業となります。

ここでは、既存のWebツールに完全に基づいた、エンハンサーを選択するためのユーザーフレンドリーなプロトコルについて説明します。これにより、研究者は目的の遺伝子(GoI)を照会し、対応するエンハンサーを取得できます。ここでのプロトコルは、ヒストン修飾、クロマチン相互作用、および組織特異性1,12,13,14,15,16,17,20,21の特定の基準セットに基づいてエンハンサーを選択します。イントロン内に見出されるエンハンサーは、遺伝子間のゲノム領域に位置する遺伝子間エンハンサーと比較して、組織特異的な活性を示す可能性が高い²²。潜在的な活性エンハンサーを包括的にカバーするために、遺伝子本体の外側に位置する調節要素を捕捉する可能性を高めるために、隣接する2つのGoI間の検索範囲を定義しました。エンハンサー特異的なエピジェネティックな特徴であるH3K4me1と活性エンハンサーマークであるH3K27acを用いて、エンハンサー候補をリストアップしました。次に、これらの候補をHi-Cデータに基づいて精製し、対応するプロモーターとの物理的相互作用を持つエンハンサーを保持しました。このプロトコルは、公開されているWebベースのツールのみを使用して、生物学者がエンハンサーの同定プロセスを通じてガイドするように設計されています。エピジェネティックな相互作用データとクロマチン相互作用のデータを統合することにより、ここで説明するアプローチは、さらなる実験的検証のための潜在的なエンハンサーに関する仮説を生成するための実用的なフレームワークを提供します。

プロトコル

注: ステップバイステップのチュートリアルは、https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow で入手できます。プロトコルで使用されるデータは、 表 1 と表 2 にまとめられています。トラブルシューティングは 、補足ファイル 1 にあります。

1. GoIの位置を特定する(図1)

1. EnsEMBL ゲノムブラウザ (https://www.EnsEMBL.org) を開きます。
2. 種とバージョンに一致する適切なゲノムアセンブリを選択します。
3. 検索フィールドにGoIを入力し、[ Go]をクリックします。
4. 適切なEnsEMBL遺伝子IDへのリンクを選択します。
5. サマリーセクションの下にある 「詳細の地域 」タブビューアへのリンクをクリックして、GoIの周辺地域をナビゲートします。

2. エンハンサー検出領域の定義(図2)

3. ヒストンマーク解析(図3)

1. [Region in detail] タブビューアのサイドバーで、[Configure this page] を選択します。
2. 「Configure Region Image」タブのサイドバーディスプレイで、「Regulation」ドロップダウンで「Activity by Cell/ Tissue」を選択します。
3. Cell/Tissue検索バーを使用して、目的の組織を検索して選択します。または、検索バーの下にあるアルファベット順のナビゲーションバーを使用して、目的の組織を検索します。
4. Cells/Tissueの横にあるExperimentsタブを選択します。
5. エンハンサーのマーカーとして H3K4me1 と H3K27ac を、プロモーターのマーカーとして H3K4me3 を選択します。
6. [トラック表示の構成] を選択します。
7. [ トラックの表示 ] を選択して、エンハンサー検出領域の H3K4me1 マーク領域と GoI の上流の H3K4me3 マーク領域を視覚化します。
8. エンハンサー候補については、新しく追加されたH3K4me1トラックの色付きのビジュアル/ボックス要素をクリックして、定義された検出領域内のH3K4me1でマークされたゲノム領域の座標を取得します。これにより、塩基対(bp)の元素のゲノム位置に関する情報を含む「Hists & Pols」ポップアップが表示されます。
   1. H3K4me1 と H3K27ac の両方の色付きのビジュアル/ボックス要素が重なる H3K4me1 領域を選択して、アクティブなエンハンサー候補を取得します。ズーム レベルの粒度は、このトラックに表示されるエンハンサー候補の数に影響を与える可能性があります。
   2. または、トラックをクリックしてドラッグし、H3K4me1/H3K27acトラックの下にグラフのピークをカプセル化することにより、各ゲノム特徴の関心領域を手動で定義します。ゲノム位置の座標をテキストファイルにコピーし、 .bed 形式で保存します。
9. 同様に、プロモーター領域については、H3K4me3 トラックを使用してステップ 3.8 を複製し、GoI の上流の領域に焦点を当てます。

4. クロマチンコンフォメーションキャプチャー(Hi-C)解析(図4)

1. 4DNデータポータル(https://data.4dnucleome.org/)にアクセスします。4DNのホームページのメイン積み上げ棒グラフ(図5)で、Y軸として [Experiment Sets ]が選択され、X軸として [Experiment Type ]が選択され、プロットが [Organism]でグループ化されていることを確認します。
2. メイン棒グラフのX軸に沿って、 in situ のHi-C バーを見つけます。 Human Experiment Sets (ヒト実験セット ) でグループ化されているバーの部分をクリックし、ポップアップの [Browse ] (参照) ボタンをクリックします。左側のパネルを使用して、関連するデータセットをフィルタリングします。
3. 目的の組織の関連するBiosampleの Title 列のリンクをクリックします。
4. [処理済みファイル] タブの [データの探索] をクリックして、Hi-C データセットをさらに詳しく探索します。
5. 目的の組織で同定されたプロモーターの座標を入力し(ステップ3.9から)、ヒートマップを右クリックして領域を水平にマークします(図4)。追加された線により、プロモーター領域がヒートマップ全体で視覚的に追跡されます。偶発的な線を削除するには、線を右クリックして horizontal/vertical rule と Close Series を選択します。
6. 実験的に検証されたすべてのコントロールエンハン^サー23 の座標を入力して、それらの最小値に基づいて相互作用閾値を計算する。これらの制御エンハンサーは、プロモーター領域と相互作用することが以前に確認されており、最小の有意な相互作用を定義するためのベンチマークとして機能します。
7. 制御エンハンサーを使用して、マトリックスの右側にあるカラーキーに従って最も低いゼロ以外の相互作用スコアに基づいて、プロモーター-エンハンサーのしきい値を定義します。
8. すべてのH3K4me1関連領域のゲノム座標を入力し(ステップ3.8から)、Hi-Cヒートマップ上に垂直にマークします。これにより、H3K4me1でマークされたエンハンサー(垂直)とプロモーター領域(水平)の交差部分を調べることができるクロスチェックパターンが可能になり、有意な相互作用が認められます。
   1. 次に、H3K4me3とマークされた領域の相互作用スコアを交互作用の閾値と比較することにより、相互作用の弱い領域を除外します(ステップ4.6)。
   2. 4DNポータルヒートマップで定義されたしきい値よりも高い相互作用頻度を示すゲノム座標を選択します。これらの領域は、ヒートマップでより集中した (暗い) 信号として表示され、BED 形式で保存されます。

結果

提示されたプロトコルの使用を説明するために、ヒトの心臓における TBX5 遺伝子を調査し、H3K4me1、H3K27ac、およびHi-Cデータを含む包括的なワークフローを使用して TBX5関連エンハンサーを探索しました。 TBX5 は、四肢および心臓の発達に寄与する遺伝子であり、これには4つの心室の形成および中隔^分離24が含まれる。この遺伝子の変異は、四肢の異常や中隔欠損症を含む先天性心疾患(CHD)を引き起こすホルト・オラム症候群(HOS)の主な原因である²⁴。 TBX5関連心臓エンハンサーの変異は、CHD²⁴に重大な影響を与える可能性があります。以前の研究では、ヒト心臓特異的組織において3つの既知の TBX5 エンハンサー、すなわち「エンハンサー2」、「エンハンサー9」、および「エンハンサー16」(補足ファイル2)が発見され、これらはトランスジェニックマウス²³において比較表現型を有することが実証された。

ヒトでは、TBX5の下流と上流に隣接する2つの遺伝子であるRBM19とTBX3の間のH3K4me1およびH3K27acに富む領域を調査し、TBX5遺伝子座の推定エンハンサーを取り出しました(図1、図2)。心臓特異的エンハンサーを同定するために、心筋細胞が選択されました。推定されるTBX5心臓エンハンサー領域を座標として取得し(chr12:開始-終了)、H3K4me1およびH3K27acの両方の22の関連領域を同定しました(図3および補足ファイル3)。推定されるTBX5心臓エンハンサーをEnsEMBLゲノムデータベースから取得し、4DNucleomeデータベースに保持されているHi-Cデータを相互参照しました(図4)。これは、潜在的なエンハンサーとTBX5心臓プロモーターとの間の可能な相互作用を測定するために行われました。ここで述べるプロトコールに従って、22のゲノム領域のうち21が心筋細胞のTBX5プロモーター(chr12: 114400143-114410103)と相互作用することが確認されました(補足ファイル4)。プロモーターとの物理的相互作用がなかった領域が1つありました(図4、ステップ4.8)。最後に、我々は、このプロトコルを、これらの生物学的に検証されたエンハンサーおよび心臓エンハンサーの現在のゴールドスタンダードデータベースであるVISTA Cardiac Enhancers Browserと比較し、データベース²⁵によって現在捕捉されていない追加のエンハンサーを明らかにした。

ここで紹介したプロトコルで取得した21種類のTBX5エンハンサーと既存のデータベースとの比較を行いました。VISTA Cardiac Enhancer Browser (Supplementary File 5)²⁵から4つのTBX5エンハンサーを回収した。VISTAで同定された4種類の心臓エンハンサーのうち、3種類のエンハンサー、hs2329、mm1282、およびm370は、このウェブベースのエンハンサー検出プロトコルで同定された領域と重複していました(図5)。また、予測された各エンハンサーは、Smemo et ^al.23、Enhancer 2(chr12:114025907-114026275、GRCh38)、およびEnhancer 16(chr12:114415466-114420433、GRCh38)の以前に実験的に検証されたエンハンサーとゲノム領域を共有していましたが、Enhancer 9(chr12:114263402-114266886、GRCh38)との重複は見られませんでした。VISTAで同定されたエンハンサーの1つであるhs498は、このプロトコルまたはSmemoらの実験的に検証されたエンハン^サー23(図5)によって予測されたエンハンサーと重複しませんでした。ただし、その領域はH34Kme1マーク(図5)と部分的に重複していました(図5)。同様に、Enhancer 9は、このパイプラインによって予測されたエンハンサーと重複しませんでしたが、H3K4me1マークに関連付けられていました(図5)。

図1:EnsEMBL Genome BrowserでGoIを見つけるためのステップバイステップガイド。 ユーザーはまずEnsEMBLホームページ(1.1)を開き、種(Human)を選択し、検索バー(1.2-1.3)に遺伝子を入力します。結果のリストから適切な遺伝子IDが選択され(1.4)、遺伝子サマリーページが開きます。次に、 ユーザーは Region in Detail ハイパーリンク (1.5) をクリックして、隣接する要素や調節機能など、GoI を取り巻くゲノム領域を視覚化します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:EnsEMBL Genome Browserを使用したGoI周辺のエンハンサー検出領域の定義。 エンハンサー検出領域を定義するには、 GENcodeトラックのBasic Gene Annotations を使用して、GoIに隣接する2つの隣接する遺伝子を特定します。ここで、遺伝子は、統合されたEnsEMBL/Havanaアノテーションでラベル付けされた濃い黄色のブロックとして表示されます。各遺伝子の転写方向は、遺伝子名(2.1)の隣に矢印(< または >)で示されます。隣接する遺伝子間の遺伝子間領域を選択するには、関心のある領域をクリックしてドラッグし、ポップアップボックスで [領域にジャンプ ]を選択してズームインします(2.2)。規制またはエンハンサー関連の注釈を追加するには、[ トラックの追加/削除 ](2.3)をクリックします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:EnsEMBL Genome Browserを使用したエンハンサー検出領域のヒストン修飾トラックの構成。 左のツールバーで、 Configure this page (3.1)をクリックしてトラック設定パネルにアクセスし、Regulationセクション(3.2)の「Activity by Cell/Tissue」に移動します。開いたタブで、[Experiments]セクション(3.3)を選択し、[Cell/Tissue]検索バーを使用して目的の組織(心筋細胞)を見つけて選択します(3.4)。ヒストンマークパネル(3.5)で、H3K4me1とH3K27acをアクティブエンハンサーマークとして、H3K4me3をプロモーターマークとして有効にし、「トラック表示の設定」(3.6)をクリックします。トラックの選択を確認したら、「View tracks」(3.7)をクリックしてゲノムビューアに戻ります。ヒストンマークのピークは、検出領域(3.8)の対応する組織ラベル(黄色:H3K4me1、青:H3K27ac、オレンジ:H3K4me3)の下に色付きのブロックとして表示されるようになりました。"Hists & Pols" ポップアップには、塩基対 (chr:start-end) で領域のゲノム座標が含まれており、これをコピーしてダウンストリーム解析のために保存できます。トラック内の色付きの要素をクリックすると、「Hists & Pols」のポップアップが表示されます。ポップアップには、領域のゲノム座標が塩基対で含まれており(例:プロモーター領域の場合はchr12:11443450-114451611)、これをコピーして保存してダウンストリーム解析に役立てることができます(3.8)。同様に、候補エンハンサーを抽出するには、トラック間のピークとボックスの垂直方向の配置で示されるように、H3K4me1 と H3K27ac のピークが重なる領域に優先順位を付けます (3.9)。重なり合う領域は、ボックスをクリックするか、整列したピークを手動でクリックしてドラッグし、領域を定義することで直接選択できます(例:アクティブな候補領域の場合はchr12:114400143-114410103)。ポップアップに表示される座標は、ダウンストリームの検証または視覚化のために BED 形式で保存する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:4D Nucleome Data PortalのHi-Cヒートマップを使用したプロモーター-エンハンサークロマチン相互作用の可視化。 4D Nucleome Data Portalのホームページには、生物別の利用可能な実験タイプをまとめた積み上げ棒グラフが表示されます。ヒトサンプルの「in situ Hi-C」データセットは、バーの対応するセクション(4.1)をクリックして選択します。関連するデータセットのフィルタリングされたリストが表示されます。心筋芽細胞に分化したH9細胞に由来するHi-Cデータセットが選択されます(4.2)。選択したデータセット(4.3)は、 HiGlassブラウザの[データの探索 ]ボタン(4.4)で開きます。関心のあるゲノム領域が座標ボックス(4.5)に入力され、接触マトリックスが色でスケーリングされたヒートマップとしてレンダリングされます。暗い色(濃い赤から黒)はクロマチン接触周波数が強いことを示し、明るい色(白からオレンジ)は相互作用が弱いことを表します。水平方向のルールはプロモーター座標に配置され、垂直方向のルールは実験的に検証された3つのコントロールエンハンサーの位置に描画されます(4.6)。これらの交差は、プロモーターとエンハンサーの接触(4.7)の中で最も強い可視信号(最も暗い色)によって設定される厳密な相互作用閾値を定義するために使用されます。H3K27acおよびH3K4me1とマークされたエンハンサーの候補の位置に追加の垂直ルールが描かれます(ステップ3.8から)。プロモーターとエンハンサーの交差がしきい値以上である候補は保持され、信号が弱い (明るい色の四角形) 候補は除外されます (4.8)。保持された座標は手動で抽出され、下流解析のためにBED形式で保存されます。(a. エンハンサー 2、b. エンハンサー 9、c. エンハンサー 16) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:予測された TBX5 エンハンサーとVISTA検証済みの心臓エンハンサーおよびコントロールエンハンサーを比較したゲノムブラウザビュー。 ゲノムブラウザのスナップショットは、ウェブベースのプロトコルで取得された予測エンハンサー(下)とVISTA検証済みのエンハンサー(上)および実験的に検証されたコントロールエンハンサー(中央)を比較したエンハンサー検索範囲(STEP 2)を表示します。メインパネルには、心筋細胞特異的なH3K4me1(黄色)、H3K27ac(青)、H3K4me3ピーク(オレンジ)などの注釈付き制御要素を含む全ゲノム遺伝子座が示されています。3つの拡大図は、プロトコル、VISTA、および制御エンハンサーによって取得されたものとの間のアライメントを捉えています。コントロールエンハンサーとのオーバーラップは、赤いボックスで囲まれています。各サブ領域の座標は、下部のブラウザパネルに表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:調査で使用されたデータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:調査で使用したWebベースのツール。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:EnsEMBL Genome Browserのトラブルシューティング手順。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:GRCh38形式のBEDファイル、実験的に検証された TBX5 心臓制御エンハン^サー23。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:GRCh38形式のBEDファイル、 EnsEMBLからSTEP3で取得したTBX5心臓エンハンサー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル4:GRCh38形式のBEDファイル、 EnsEMBLからSTEP4で取得したTBX5心臓エンハンサー。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 5: GRCh38 形式の BED ファイル、VISTA 心臓エンハンサー ブラウザから取得した TBX5 心臓エンハンサー ²⁵。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するWebベースのプロトコルは、エンハンサーの予測ではなく、エンハンサー検索のワークフローとして機能します。一般に公開されている組織特異的データセット、ヒストン修飾(H3K4me1およびH3K27ac)、およびHi-C相互作用データを活用することで、GoIに関連する可能性のあるエンハンサーを絞り込みます。機械学習やシーケンスベースのモデルに依存する計算予測ツールとは異なり、私たちのアプローチは実験データのみに基づいてエンハンサーを取得することに焦点を当てています。EnsEMBLゲノムブラウザのトラブルシューティング手順は、 補足ファイル1に記載されています。

このワークフローは、ヒストンマークやクロマチン相互作用データなどの重要な要素を統合し、ChIA-PETやPLAC-seqなどの高度な方法と同様に、エンハンサーとプロモーターの相互作用をより高い精度でマッピングします^10,11。ただし、この方法は、高分解能の実験技術が実現できない場合に有益であり、プロトコルはリソース消費が少なく、時間を大幅に節約できるためです。

上記のアプローチの主な制限は、既存のデータセットの可用性と品質に依存することであり、これは取得された相互作用の精度に影響を与える可能性があります。TBX5に関連する遺伝子変異との関連で心臓発生中のエンハンサー活性を調べるには、組織特異的な分解能が必要です。このような解析には、発生調節との関連性を考えると、胚性心臓組織が最も適切です。しかし、解析時点ではヒストン修飾データが公開されていたため、胚データセットには含まれていませんでした。これを考慮するために、ENCODE、Enhancer Atlas 2.0、またはEnhancerFinderなどの代替リソースを統合することで、エンハンサーの同定と検証のための追加のデータセットを提供することで、パイプラインの有用性を拡大できる^18,19。

TBX5 REPFIXでは、H3K4me1に基づく分析により、さらなる調査の出発点として22の推定エンハンサーが明らかになりました。その後のHi-C解析では、以前のヒストン修飾マークに基づく22のエンハンサー候補のうち21が、心筋細胞のTBX5プロモーターと相互作用することが示されました(図5)。これは、関心領域の予測におけるヒストン修飾マークベースのアプローチの信頼性を裏付けています。

このプロトコルでは、種間の配列保存を優先しないことを選択しましたが、これはエンハンサーを特定するための一般的な基準です。以前に証明されたように、組織または種特異的なエンハンサーにはあまり効果がないことが証明されており、その多くは進化中に強く保存されていません²⁶。これを考慮して、機能エンハンサー活性をより直接的に示すクロマチンベースのマーカーに焦点を当てることを選択しました。しかし、配列の保存は、進化的に重要なエンハンサーの研究など、特定の状況ではまだ価値があるかもしれません。この場合、保存された規制要素に関心のあるユーザー向けのオプションのステップとして追加できます。

このプロトコールは、既存のプラットフォームであるVISTA Cardiac Enhancers Browserでは同定ができなかった TBX5 遺伝子の21の心臓特異的エンハンサーをEnsEMBLのウェブサイトから検索するのに効果的であることが証明されました。ここで述べるプロトコールでは、エンハンサーの1つであるhs498を取り出すことができず、検出の制限の可能性を示唆しているが、このアプローチにより、VISTA Cardiac Enhancers Browserでは検出されないいくつかのエンハンサーが明らかになった。ただし、このプロトコルはキュレーションされたVISTAデータベースと比較して推定領域の数が多いため、取得されたエンハンサーのさらなる検証が必要です。この高い数値は偽陽性のリスクを高め、予測されるエンハンサーの数が多いからといって、必ずしも特異性や機能的関連性が向上したことを示すわけではありません。Smemoet al.で実施されたように、これらの候補の生物学的妥当性を確認するためには、追加の実験データセットや遺伝子発現解析、CRISPR摂動、レポーターアッセイなどの機能アッセイを組み込むことが重要になります。の研究²³。

実験的に検証された3つのエンハンサーとの相互比較では、予測された領域と部分的に重複することが示されました(図5)。予測されたエンハンサー「e1」は、検証されたエンハンサー2よりも広く配置されていましたが、「e18」はエンハンサー16と部分的に重複していました(図5)。これらの結果は、このアプローチが既知の調節活性を持つ領域を成功裏に特定することを示唆しているが、予測されたエンハンサーのより広い範囲は、エンハンサー境界の柔軟性を反映している可能性がある。エンハンサーはしばしばモジュラー要素として機能し、その活性はクロマチンの状況、細胞の種類、および発生タイミングに依存する可能性があります^2,27。したがって、予測された領域には、調節機能に寄与する隣接配列を持つコア活性部位が含まれる可能性がありますが、これらの広範な予測のどの部分が組織特異的または発生的な状況で機能的に活性であるかを決定するための実験的検証が必要です。VISTA Cardiac Enhancer Browserは、定義された範囲内の4つの領域を特定しましたが、実験的に検証されたエンハンサーであるEnhancer 16と部分的に重複していたのは、特にH3K4me1でマークされた領域で、1つのエンハンサーmm370だけでした（図^5）23。mm370の残りの部分は、エンハンサー16と重複せず、エンハン^サー28,29の非機能的または不活性なサブ領域を示している可能性がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コンピュータワークステーション	該当なし	該当なし	Webブラウザ対応コンピュータ、Windows/Mac/Linuxオペレーティングシステム
4DNデータポータル	4DNデータポータル	https://data.4dnucleome.org/
銀河	銀河	https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
Github(英語)	Github(英語)	https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
ビスタ	VISTA心臓エンハンサーブラウザ	https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/