方法論記事

フリーハンドおよびセミシン切片を用いたC3およびC4光合成分化のためのTriticum aestivumおよびZea maysの構造形質の評価

2.3K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/66843

⸱

2024年7月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

この記事について

サマリー

C3 と C4 の葉の断面の解剖学的違いを評価することは、光合成効率を理解するのに役立ちます。この論文では、フリーハンドおよび半薄葉の断面の準備と検査、および作物種 Triticum aestivum および Zea maysの準備における注意事項について説明します。

要約

C3のメカニズムと比較して、C4光合成の効率が向上するのは、CO2を束状シース細胞に集中させる能力に起因します。C4光合成の有効性と固有の水利用効率は、葉肉細胞と束葉細胞の割合、束鞘のサイズと密度、束鞘細胞のサイズ、密度、および細胞壁の厚さに直接関連しています。これらの形質の迅速な顕微鏡分析は、従来の光学顕微鏡を使用してフリーハンドおよびセミシンセクショナで行うことができ、特定の細胞タイプを同定および調査することにより、C4作物の光合成効率に関する貴重な情報を提供します。さらに、解剖学的測定や細胞タイプの診断に影響を与えるフリーハンドおよび半薄切片の調製におけるエラーと、これらのエラーを回避する方法を示します。この顕微鏡的アプローチは、環境変動に対する光合成順応に関する洞察を収集する効率的な手段を提供し、将来の気候に対する作物の迅速なスクリーニングに役立ちます。

概要

光合成は、光エネルギーを化学エネルギーに変換する基本的なプロセスであり、陸生栄養ネットワークの基礎となるものです。植物の大部分は光合成のC3経路をたどり、主要な光合成生成物は3炭素化合物グリセリン酸3-リン酸です。C3 光合成は、20 億年以上前に、CO2 が豊富で O21 が少ない大気中で進化しました。これらの条件下で進化した主要な光合成酵素リブロース1,5ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Rubisco)は、O2と競合して光呼吸を開始するため、現在の低CO2高O2条件には最適ではありません。光呼吸は、エネルギーを生成して副産物としてCO2を放出する代わりにエネルギーを消費する無駄な経路です。したがって、葉緑体中のRubisco周辺のCO2濃度を高く維持して、酸素化を防ぐことが重要です3,4。C3植物がCO2を濃縮できないため、周囲の空気から葉緑体へのCO2の大幅なドローダウンがあり、光合成が抑制され、植物の成長とバイオマス生産に影響を及ぼします2,5,6。

C3植物では、光合成は気孔を介したCO2の侵入、葉肉を介したその拡散、および光合成酵素の生化学的活性によって制限されます。CO2の侵入は、まず気孔コンダクタンスによって制限され、これは気温や湿度などの環境条件によって制御されます。次に、CO2は葉の内部気相と液相を通ってRubisco7に拡散します。C3植物では、光合成のすべての段階が葉肉細胞の葉緑体で起こり、植物は大気から葉緑体へのCO2の一定の流入を維持する必要があります。葉緑体におけるCO2の利用可能性は、気孔の開放性、葉肉構造、および個々の細胞および葉緑体の特性に依存するため、植物は、水の利用可能性の低さや高温など、最終的に光合成に影響を与える環境制約の影響を受けやすくなる7,8,9,10、特に気候変動条件に対する脆弱性が強調されている11。

C3経路の非効率性、最適なCO2レベルを維持する限界、環境要因に対する感受性によってもたらされる課題を考えると、特定の植物では、別の経路であるC4光合成経路が進化しています。特徴的に、C4植物は空間的に分離された2つの生化学的経路を持っています。最初のCO2固定は、RubiscoよりもCO2に対する親和性が高く、酸素化活性を欠くホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって葉肉細胞で発生します。形成されたC4生成物は、さらに束状シース細胞に輸送され、そこで脱炭酸され、CO2が再び放出され、Rubisco(C3光合成)によって固定される12,13,14。PEPカルボキシラーゼのCO2および束鞘細胞の厚い細胞壁に対する親和性が高いため、束鞘細胞内のCO2濃度が可能になり、したがって、C4植物はCO2固定とカルバンサイクルを空間的に分離することにより光呼吸を最小限に抑えます。C4経路の採用は、環境制約に対する自然の適応反応を示しており、変化する気候条件15で作物の生産性と回復力を改善するための潜在的な戦略についての洞察を提供します。

C4植物の葉の構造の特殊な解剖学的構造は、葉緑体を含む拡大した維管束鞘細胞に囲まれた静脈と、束鞘細胞の周りをパターン化する外輪内の葉肉細胞の放射状配置によって特徴付けられます。葉肉細胞は束鞘細胞に近接しているため、2つの細胞タイプ間で代謝産物を迅速かつ連続的に輸送することができます。この細胞の配置はC4植物に典型的であり、クランツ解剖学16と呼ばれます。C3種では、葉肉細胞の特殊化と配置はさまざまですが、束鞘細胞は明らかに小さく、葉緑体が少ないか、葉緑体がまったくありません。クランツの特定の解剖学的構造は、C3-カルボキシル化酵素Rubiscoが位置する束鞘細胞の葉緑体にCO2を集中させることを可能にし、光呼吸を効果的に妨げます4,17,18。その一見複雑な配置にもかかわらず、これらの変化は、被子植物の進化において独立して複数回発生しており、これは比較的実現可能な進化経路19,20,21であり、様々な分類群がC3とC4炭素代謝の中間段階にあることが示されており、C3−C4またはC2と呼ばれている。 CO2 22,23,24,25を集中して再同化する能力を持っています。

多くのC4植物は経済的に重要な作物であり、イネのようなC3作物を遺伝子操作して気候の回復力を向上させ、収量を確保することは、過去数十年で関心を集めてきたトピックでした26,27。しかし、工学的な努力には、C4の特殊な解剖学的構造と、それが光合成をどのように制御するかについての詳細な理解が必要です2,28。

C4 クランツの解剖学を確立することは、C4 光合成を C3 作物25 に工学するという野心的な目標を達成するための前提条件です。しかし、クランツの解剖学的構造の制御とその主要な解剖学的形質を迅速にスクリーニングする方法に関する現在の理解は限られており、雑種種を特定することは困難です。これまでの研究で、C3およびC4植物における光合成効率を調節する主要な形質には、静脈間距離、束鞘複合体の直径、および束鞘細胞のサイズが含まれることが示されている14,29。これらの形質は、フリーハンド切片を使用して簡単にスクリーニングでき、セミシン切片を使用して定量的に分析できます。ここでは、フリーハンドのクロス顕微鏡および光学顕微鏡によるC3およびC4の解剖学的鑑別診断を可能にする形質、すなわち束鞘面積、静脈間距離、および静脈頻度を評価する方法について説明します。

プロトコル

1.植物の成長条件

  1. コムギ(Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis")とトウモロコシ(Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam")をそれぞれ代表的なC3 およびC4 植物として選択します。種子から環境制御された成長チャンバーで両方の植物種を育てます。
  2. 相対湿度を55%に維持し、気温を25°C/18°C(昼/夜)にし、12時間の光の期間を設けます。植物表面の光合成光子束密度(Q)を1200 μmol/m2/sに維持し、自然な生育条件を表現します。すべての植物を周囲CO2 濃度400μmol/molで育てます。
  3. 蒸留水で2日 ごとに植物に水をやり、苗が出現してから10日後にホーグランドの溶液で施肥します。与えられた条件で60日間植物を育て、顕微鏡分析のために完全に拡大した葉を使用します。

2. フリーハンド切片の準備と閲覧

  1. 各植物から成熟した非老化性の葉を3枚選択し、蒸留水で保管します。新しい片面カミソリの刃を使用して、葉の表面と直角を形成するように1つのレベリングカットを行い、セクションが葉の表面に対して垂直に作られた横断断面であることを確認します。
  2. 歯用ワックスの上のガラス板に葉の標本を置き、サンプルを安定させ、滑りを防ぎます。葉の標本の上で刃をまっすぐ下に動かして切断し、細胞をきれいに切ります。断面を蒸留水に保管してください。
  3. サンプルをスライドガラスに取り付けて、水滴の上に置き、顕微鏡での観察とイメージングのためにガラスカバースリップで覆います。気泡を閉じ込めないでください。
  4. 複眼顕微鏡でスライドを10倍と20倍の倍率で観察します。ソフトウェアガイドに従って、関連するスケールとともに画像を保存します。

3. セミシン切片の作製

  1. ステップ2.2のように、 Z.mays と T.aestivum の両方の葉から中肋骨に沿って肋間領域から約3 mm x 5 mmのサイズの切片をガラス板に切り取ります。カットセクションの長さが葉の木目に沿っていることを確認してください。
  2. 植物材料を1 mLの固定緩衝液(0.1 Mリン酸緩衝液中の4%グルタル酸アルデヒド、pH = 6.9、 表1)を入れたシリンジに入れます。
  3. シリンジを垂直に持ち、空気を抜いてから、先端に指をかざしてシリンジをポンピングして真空にします。サンプルがシリンジの底にくらみ、浸透が成功するまで繰り返します。
  4. シリンジの内容物をラベル付きガラスバイアルに移し、次のステップに進む前に4°Cで48時間保存します(表2)。
  5. 各バイアルについて、ピペットで固定液を静かに取り出し、サンプルが覆われるまでリン酸緩衝液を加えます。30分間放置します。この手順を3回繰り返します。
  6. ピペットでリン酸緩衝液を取り出し、サンプルが覆われるまで四酸化オスミウム(注意)を追加します。サンプルやその他の有機物は黒くなります。ダブルグローブを使用してください。1時間放置します。
  7. ピペットで前の溶液を取り出し、サンプルを蒸留水で覆います。30分間放置しますこの手順を3回繰り返し、ダブルグローブを使用します。
  8. 前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを50/50蒸留水-エタノール溶液で覆います。30分間放置します。次のシリーズの蒸留水-エタノール溶液でこのステップを繰り返します:30/70、20/80、10/90、および100%エタノールで2x。これらの溶液中のサンプルは、4°Cで一晩放置できます。
  9. 前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを1/3レジンエタノール溶液で覆います。サンプルをミキサープレートに置き、2時間放置します。1/2、1/1、2/1、3/1、および2xの100%樹脂のレジン-エタノール溶液でこのステップを繰り返します。これらの溶液中のサンプルは、4°Cで一晩放置できます。
  10. 平坦な埋込み型(キャビティ16個、キャビティ寸法:14L×W4.8W×D3(mm))のキャビティを100%樹脂で覆い、キャビティの一端にサンプルを置きます。各サンプルに鉛筆で書かれた紙のラベルを準備し、キャビティのもう一方の端に置きます。
  11. すべてのキャビティを100%樹脂で完全に満たし、サンプルとラベルが動いた場合はまっすぐにします。型を埋め込みフィルムで覆い、アクリル樹脂製品のガイドラインに従ってオーブンで重合します。
  12. 重合ブロックをサンプルと一緒にウルトラミクロトームの試料ホルダーにセットします。粗いガラスナイフを使用して、組織が見え、余分な樹脂がなくなるまでブロックをトリミングします。
  13. 半薄切片をガラスナイフまたはダイヤモンドナイフを使用して横方向(1μm)に切断します。水面から金属製の接種ループを使用して切片を採取し、スライドガラスの上に置きます。スライドをホットプレート(60°C)で乾燥させ、切片をガラスに固定します。
  14. 固定切片をトルイジンブルー(1%水溶液)で5秒間染色した後、蒸留水ですすぎ、ホットプレートで再度乾燥させます。
    注:化学固定プロセスがヒュームフードの下で行われることを確認してください。ガラスナイフは定期的に交換して、裂け目や歪みのない部分を可能にする鋭い切り傷を確保する必要があります。

4. サンプルのイメージング

  1. 生葉切片のイメージング
    1. マニュアルに従って、付属のソフトウェアを使用して複合光学顕微鏡をセットアップします。
    2. スライドガラスをステージに置きます。接眼レンズを調整し、 view セクションを10倍で取得しますview 次に、20倍と40倍の対物レンズで。
    3. 各対物レンズで、ライブチャネルをナビゲートし、関心のある領域に焦点を合わせ、静脈の周りの束シース細胞を見つけます。
    4. フォーカスが合ったら、 フリーズ ボタンをクリックし、 スケールバー の スケールバー タブではじょうしゃん。イメージを に保存します。画像分析用の TIF 形式。
  2. レジン浸潤切片のイメージング
    1. 自動光学顕微鏡をコンピューター上の付属のソフトウェアと接続してセットアップします。
    2. 透明チャンネルをロードし、スライドを顕微鏡ステージに置きます。40倍の対物レンズ倍率で切片にピントを合わせ、明るさを調整してすべての細胞構造が見えるようにします。
    3. ナビゲーター機能を使用してセクションの位置領域を設定し、セクション全体が画像化されるようにし、[ ステッチ ]ボタンをクリックします。
    4. [完了] をクリックし、[開始] をクリックして、顕微鏡でセクション全体をイメージングできるようにします。画像解析ソフトを開き、顕微鏡で撮影したタイルを開きます。
    5. 整列機能を使用して、タイルが重ならないようにします。画像を生成したら、[調整]タブを使用して位置、明るさ、回転を調整します。
    6. で保存する前に、画像にスケールを印刷します。TIF 形式。
  3. ImageJソフトウェアを使用した解剖学的測定
    1. ImageJソフトウェアを開き、画像をウィンドウにドラッグして読み込みます。
    2. [ライン] ツールを使用して、縮尺を次のようにキャリブレーションします。縮尺記号の上に線を描画し、[ 解析] > [スケールの設定] を選択し、既知の距離をスケール バーの長さに変更し、長さの単位を正しい単位に変更します。
    3. ラインツールを選択し、関心のある領域全体に線を引き、Mキーを押して、予想される特性を測定します。
    4. 面積計測の場合は、 ポリゴン選択ツール を選択し、対象の組織の周囲に描画します。 M キーを押して終了します。測定値はポップアップウィンドウとして表示され、スプレッドシートにコピーしてさらにデータ分析を行うことができます。

結果

図1A は、新鮮な切片作成と光学顕微鏡の両方で葉を切片化するための正しい向きを示しています。片面カミソリと歯科用ワックスシートを使用して新鮮な切片を切断する方法を 図1Bに示します。結果のセクションを 図 1C に示します。

図2 は、C3 植物 T.aestivum とC4 植物 Z.maysの代表的な葉のフリーハンドセクションを示しています。静脈の周囲には束状の鞘細胞が見られ、トウモロコシは丸みを帯びた緑色の細胞を持ち、葉緑体の存在が高いことを示しています。これらの画像から、葉の厚さと総束鞘面積を取得することが可能です。しかしながら、この方法では、葉肉のさらなる特性評価は不可能である。

図3 は 、T. aestivum と Z. maysの半薄断面を示しています。この方法では、葉のすべての組織が見えて測定可能です。クランツの解剖学的構造は 、Z. maysで明らかであり、葉肉細胞が静脈の周りに配置されています。束鞘は拡大され、葉緑体で満たされており、特に葉肉細胞に向かって集中しています。これにより、束鞘細胞と葉肉細胞との間の代謝産物の迅速な交換が可能になります。これらの画像から、小葉脈と大葉脈の間の静脈間距離、束鞘径、総束鞘面積、葉脈面積、束鞘細胞面積の割合、束鞘細胞面積、静脈数500μm以内、葉厚などの葉の構造的形質が測定されました。 図4 の箱ひげ図は、 T. aestivum と Z. maysの間のそのような形質の違いを示しています。1つの特性である大静脈間の静脈間距離を除くすべての特性は、p値が0.05の95%信頼区間<有意に異なります。

図 4 は、 T. aestivum と Z. mays の解剖学的形質の違いを表す箱ひげ図のコレクションを示しており、C3 と C4 バンドル鞘の構造の違いを例示しています。作物種間の静脈間距離、束鞘の直径(同じ生育条件下で)、束鞘細胞と非光合成材料(すなわち、静脈)の割合、および500μmの切片幅での静脈周波数との間には大きな違いがあり、これらはすべてC3 とC4 葉の解剖学的構造の間に期待されることを強く示しています。

図5 は、サンプルの切断または準備時に発生する可能性のある間違いの例を示しています。これらの画像の葉の解剖学的構造はマスクまたは変形されているため、特性評価には信頼性がありません。トルイジンブルーによる過剰染色は、ウルトラミクロトームで切断された切片で起こり、染色が長時間放置され、細胞構造が不明瞭になることがあります(図5A、B)。一般的なエラーは、樹脂が葉組織に完全に浸透しない浸潤プロトコル中に発生する可能性があります(図5C、D)。葉の断面が穀物に沿って切断されると、葉肉細胞と束鞘細胞の位置を特定できず、正しく測定できない長方形の細胞になります(図5F、G、H)。

統計分析はR(バージョン4.3.1)で行われ、箱ひげ図を作成しました。葉の解剖学的形質は、三重(植物ごとに3枚の葉、種ごとに3枚の植物)で測定されました。

葉切片クロマトグラフィーのセットアップ;緑色の顔料抽出。顔料分離の手順の図。
図1:新鮮な葉の断面をカットするための正しい方法。(A) 断面を取得するための葉のセクションの向き。 (B) 平らな歯科用ワックスに片面カミソリの刃を使用して葉を切片化する技術。 (C) 結果として生じる断面は、スライドガラスに取り付けて顕微鏡で見る準備ができている薄い葉のスライバーとして現れます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

植物の葉構造の断面顕微鏡、50μmおよび100μmスケール、維管束組織の詳細。
図2:代表的な葉のフリーハンドセクション(A)C3植物Triticum aestivum(400倍倍)。(B)C4植物Zeaは(200倍倍)で可能です。細胞の種類は矢印で示され、V = 静脈、BSC = 束鞘細胞、MC = 葉肉細胞です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

維管束の断面を示す植物の解剖学図と、組織と構造のラベル。
図3:セミシン断面 (A) Zea mays および(B) Triticum aestivum は、クランツ解剖学的構造を持つC4 種(A)とクランツ解剖学的構造を持たないC3 種(B)の束鞘と葉緑体の位置の違いを示しています。略語:Tl =葉の厚さ、BS =束鞘、SV =小静脈、ID =静脈間距離、LV =大静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

T.aestivumとZ.をT検定を使用して比較する箱ひげ図。メトリックには、SY-HD、LV-ID、およびVBAが含まれます。
図4:Triticum aestivumとZeaの解剖学的形質の違いを示す箱ひげ図(A)小静脈間の静脈間距離、(B)大静脈間の静脈間距離、(C)束鞘径、(D)総束鞘面積、(E)静脈面積、(F)束鞘細胞面積の割合、(G)束鞘細胞面積、(H)500μm以内の静脈周波数、および(I)葉の厚さ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

植物組織の断面の顕微鏡画像で、細胞の構造と解剖学的構造を強調します。
図5:組織処理で発生する可能性のある一般的な間違いの例(赤い矢印で示されています)。LR Whiteアクリル樹脂(A)Triticum aestivumおよび(B)Zea maysに埋め込まれたサンプルの過剰染色。Spurrのエポキシ樹脂(C)Ceratozamia robustaおよび(D)Dioon mejiaeに埋め込まれたセクションの樹脂の裂け目。(E)断面と(F)縦断面を示すT. aestivumフリーハンドセクション。(G) Annona muricata と (H) Encephalartos villosus の斜めの切り込みによる切片化の偏り。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

解決準備最終巻数
バッファー 1 のベース7.12gのNa2HPO4を溶解します。200 mL の蒸留水に 2H2O200ミリリットル
バッファー 2 のベース7.12gのNaH2PO4を溶解します。200mlの蒸留水中の2H2O200ミリリットル
リン酸緩衝液ベース136mL、ベース214mL、蒸留水50mLを混合します100ミリリットル
固定液9.25 mLの5%グルタルアルデヒド(注意:材料の表を参照)、12.5 mLのリン酸緩衝液、および28.25 mLの蒸留水を混合します。4°Cで保存してください。50ミリリットル

表1:固定液のレシピ。

歩形容期間繰り返す
1バッファーによるすすぎピペットで固定液を静かに取り除き、サンプルが覆われるまでリン酸緩衝液を追加します。30分間放置します。30分3倍
21%四酸化オスミウムによる染色(注意:材料の表を参照):ピペットでリン酸緩衝液を取り出し、サンプルが覆われるまで四酸化オスミウムを加えます。サンプルやその他の有機物は黒くなります。ダブルグローブを使用してください。60分1
3蒸留水でサンプルをすすぐピペットで前の溶液を取り出し、サンプルを蒸留水で覆います。30分間放置します。この手順を3回繰り返します。ダブルグローブを使用してください。30分3回
4エタノールシリーズ浸潤前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを50/50蒸留水-エタノール溶液で覆います。30分間放置します。次のシリーズの蒸留水-エタノール溶液でこの手順を繰り返します:30/70、20/80、10/90、および100%エタノール。30分1
5レジンエタノール系浸潤前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを1/3レジンエタノール溶液で覆います。サンプルをミキサープレートに置き、2時間放置します。1/2、1/1、2/1、3/1、および100%樹脂のシリーズの樹脂-エタノール溶液でこの手順を繰り返します。120分1
6重合する前に冷蔵庫で72時間保管してください
7浸潤した葉片を製品仕様に従って重合し、樹脂包埋サンプルを取得します。

表2:樹脂の浸透プロトコル。

ディスカッション

この記事では、葉の解剖学的構造を測定する定量的方法と定性的方法の両方と、それらを最適化する方法について説明します。さらに、この方法論は、C3 と C4 の断面を区別するのに最も有用な解剖学的形質を決定するために、代表的な作物種に適用されます。これらの形質を理解することは、C2光合成と呼ばれる雑種種が研究のより有望な手段になりつつあるため、不可欠です。現在のところ、C2光合成を使用することが確認されているのは、Diplotaxis tenuifolia(ルッコラ)の1つの作物種のみですが、現在の記録が示すものよりも多くある可能性があります25。C2系統内には、種内光合成の多様性と可塑性が高レベルに存在します。このことは、C2光合成の発生を確認するためには、CO2補償点、超微細構造解析、および免疫組織化学30のような複数の証拠が必要であることを示唆している。

フリーハンドおよびセミシン切片は、長年にわたり特定の植物組織の同定と測定に使用されてきましたが、この記事では、C3 作物とC4 作物植物の間の光合成分化に影響を与える解剖学的葉構造の特定の使用例について議論することを目的としています。フリーハンドとセミシンセクショニングの両方には、考慮すべき注意点があります。フリーハンド切片は、すぐに入手できますが、葉の切片の厚さが一定でなくなる可能性が高く、定量分析の妨げになります。これは、新鮮な植物材料の切片化に特化した装置(ビブラトームやクライオスタットなど)を使用することで回避できます。手作業で切片を切開することで、細胞の複数の層が重なり合い、細胞がぼやけ、解剖学的構造がぼやけてしまうことがあります。切片化の目的が純粋に定性的である場合、フリーハンド切片は、植物組織の化学処理(すなわち、組織化学)の利点を提供する31。これにより、植物細胞内の特定の化合物の存在を定性的に示すことができます。逆に、セミシン セクションは、ほとんどの場合、一貫して厚いセクションになります。ただし、プロセスは長く、デリケートであるため、エラーが発生しやすくなります。起こりうる問題と、それを回避する方法について、さらに議論します。

固定
フリーハンドとセミシンセクションの両方、つまり十分に水和した植物の葉には、新鮮な材料を使用する必要があります。しおれた葉の切片は、細胞の膨満圧が低下しているため、構造的完全性がありません。樹脂に埋め込まれた材料から半薄片を得る場合、葉の中の空気を置き換えるために、葉の切片が真空下で固定されていることを確認することが重要です。これにより、浸透プロセス中の構造的完全性と浸透が可能になります。このステップが正しく行われないと、細胞が崩壊する可能性が高く、実際の葉の構造を正確に描写しない断面が生じ、その結果、解剖学的測定が不正確になる32。

逆に、高真空圧は軟組織(子葉など)を持つ葉を損傷し、細胞が縮小したり、サンプルが破壊されたりする可能性があります。これを回避するには、適切な真空ポンプ設定を使用するか、真空ポンプを完全にスキップしてサンプルを固定液に浸すだけです。後者が好ましい場合、固定剤の組織への浸潤を容易にするために、サンプルをすべての側面で切断することができる。

潜入前
細胞壁の厚さと強膜組織は、試料の最適な固定と浸潤を可能にする溶液の浸透に最も影響を与える解剖学的特性です。植物組織における強膜症の目的は、浸潤プロセス33に影響を与える可能性のある機械的な支持と保護である。これらの組織は非常に肥厚した木質化した細胞壁を有するため、溶液の透過が妨げられる可能性があります。浸潤に問題があるサンプルは、樹脂の細胞が壊れたり裂けたりした半薄片になります(図5C、D)。縦方向の切片化は細胞の歪みをもたらし、解剖学的分析や細胞サイズや細胞密度などの葉形質の測定にバイアスを引き起こします(図5F-H)。

レジンの浸透
質の高い切片作製は、標本が埋め込まれている媒体に直接影響を受ける解剖学的組織の観察に不可欠です。植物組織学で使用される最も一般的な包埋培地は、パラフィンワックス、エポキシ、およびアクリル樹脂34,35である。ワックス包埋は、化学固定剤による試料の調製と、室温で硬化させた液体ワックスによる浸透が必要です。これらの切開は通常、厚さが5〜10μmの切片になりますが、ここで示すように、手作業でも同様に達成でき(図2)、固定されていない新鮮な組織のみが必要です。この場合、束鞘の周りの細胞の配置は、C3植物とC4植物を区別するために不可欠であり、これにはより堅牢で剛性の高い包埋培地の使用が必要です。この研究では、エポキシ樹脂(Spurr's resin36)とアクリル樹脂(LR White)の両方を、硬度、寿命、サンプルの浸透、および切片化耐久性についてテストしました。エポキシ樹脂は、何十年にもわたって生物学的材料の埋め込みに使用されてきました37。アクリル樹脂は比較的新しく、エポキシ樹脂とは異なり、UV曝露の結果として変色せず、収縮しにくいため、経時的な弾力性のために植物標本の埋め込みのために最初に検討されました38。LRホワイトアクリル樹脂(硬質グレード)は、その非毒性とUV安定性の処方のために選択されました。アクリル樹脂はエポキシ樹脂よりも粘度がかなり低い傾向があり、これによりサンプルの浸透が速くなり、材料の硬度により、ミクロトーム39でよりクリーンな切断が可能になります。図5C,Dは、エポキシ樹脂の柔らかさにより裂け目が避けられない構造組織を多く含む葉の試料において、アクリル樹脂と比較してエポキシ樹脂を用いた結果を示しています(図3)。

超微量切開術
余分な樹脂を削ぎ落とすと、樹脂に亀裂が入り込み、試料に浸透することがあります。これを避けるためには、埋め込み用に選択した樹脂の密度と脆性を考慮することが重要です。セクションに深く切り込むことで、手作業や荒いナイフのトリミングによるアーティファクトを回避できます。サンプルは、サンプルホルダーに対して垂直に位置合わせし、接眼レンズで倍率を上げたり、固定された汚れた部分を観察したりして検証する必要があります。完全に直角に切断されていない植物細胞は、一方の端がもう一方の端よりも大きい先細りの細胞として現れます40。

染色後
トルイジンブルー(水溶液中1%)を使用して、ウルトラミクロトームで切断した半薄切片を染色しました。汚れが切片で長時間乾燥しすぎると、染色が過剰になり、画像化時に切片が過飽和になります(図5A)。染色が十分にろ過されていないと、切片上で未溶解の粒子が乾燥し、解剖学的構造の視覚化が妨げられます(図5B)。この問題は、トルイジンブルー溶液を作成するときに細かいフィルターを使用し、汚れへの切片の露出を制限することで回避できます。サンプルは、切片がガラス顕微鏡スライドに結合することを確実にするために、染色前に60°Cのホットプレート上で乾燥させるが、すすぎ、再度乾燥する前にトルイジンブルーに10秒以上さらしてはならない41。

解剖学的測定に関する考慮事項
この論文で示されている測定値は、細胞間空域の一部、平均葉肉の厚さ(血管組織なし)、葉面積42の単位あたりの細胞間空気空間にさらされた葉肉表面積など、半薄切片を使用して定量的に評価できる多くの解剖学的特性の一例にすぎません。しかし、束鞘細胞のサイズがC3代謝とC4代謝を区別するための重要な指標である一方で、束鞘細胞の壁の厚さは、束鞘細胞の漏出の程度、すなわち、葉肉細胞42に逆流するCO2の量を決定するため、光学顕微鏡だけでは見ることができない別の重要な特性である。43.高い漏れ性は、PEPカルボキシラーゼによるCO2固定に使用されるエネルギーの大部分が失われるため、光合成効率を低下させる44,45,46。このような超微細構造解析には、透過型電子顕微鏡法や画像解析が必要です。本研究では光学顕微鏡のみが考慮されましたが、プロトコルには、TEM 顕微鏡法の基礎である対照固定剤である四酸化オスミウムによる治療が含まれています。したがって、重合したサンプルは、調製時に考慮されなくても、必要に応じてTEM分析に使用できます。

解剖学的診断はクランツ様構造を容易に検出することができるが、C4の存在は、典型的なC4生理学、すなわち、低いCO2補償点、光合成の限定的なO2阻害、および異なる炭素同位体組成2,4,47を示すことができるガス交換測定によってさらに診断することができる。

クランツの解剖学的構造は、単一細胞のC4植物48,49,50の発見によって示されるように、C4光合成が発達するために必要ではないことにも留意すべきである。したがって、解剖学的分析だけでは、あまり研究されていない分類群のC4生理機能を検出するには十分ではない可能性があります。解剖学的特性評価と生理学的解析の組み合わせは、作物と野生植物の両方における葉の形質とその構造と機能の関係を調査するための強力なツールを提供します。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、欧州連合H2020プログラム(プロジェクトGAIN4CROPS、GA番号862087)を認めています。センター・オブ・エクセレンス「AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates」は、エストニア教育研究省の資金提供を受けています。 T. aestivum と Z. maysの種子を提供してくださったEvelin Loit-Harro教授、葉の断面作成にご協力いただいたPaula PalmetさんとVaiko Vainolaさん、分析にご協力いただいたJoão Paulo de Silva Souzaさんに感謝いたします。すべての画像は、さまざまなプロジェクトの下でエストニア生命科学大学の顕微鏡ユニットから取得されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸水素二ナトリウム二水和物 (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
埋め込みフィルム, 7.8 mil 厚さ, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
エタノール, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000危険性:引火性の高い液体と蒸気。
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331危険:吸入すると致命的です。飲み込むと有毒です。重度の皮膚や目の損傷を引き起こします。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。保護手袋、保護服、目、顔の保護具を着用してください。
Histo ダイヤモンド ナイフDiatome、米国
ライカ EM UC7ライカ ウィーン、AT
LR 白色樹脂硬質グレード 電子顕微鏡科学、US14383危険性: 皮膚の炎症を引き起こします。重度の眼の炎症を引き起こす呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。眠気やめまいを引き起こす可能性があります保護手袋、保護服、目、顔の保護具を着用してください。
顕微鏡スライドNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019危険: 飲み込んだり、皮膚に接触したり、吸入したりすると致命的です。重度の皮膚の火傷や目の損傷を引き起こす二重の保護手袋、保護服、目と顔の保護具を着用してください。
ピペットとピペットチップThermo Scientific、FIKJ16047
リン酸二水素ナトリウム二水和物 (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA、CZ13472-35-0
シリンジ 10 mlEcoject、DE20010
トルイジンブルー、汎用グレードFisher Scientific、 GB2045836

参考文献

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92(2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, Ü, Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, Ü, Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478(2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818(2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618(2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592(2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485(2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505(2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14(2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, Ü, Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

再版と許可

タグ

C3 C4 ImageJ
フリーハンドおよびセミシン切片を用いたC3およびC4光合成分化のためのTriticum aestivumおよびZea maysの構造形質の評価
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。