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方法論記事

フリーハンドおよびセミシン切片を用いたC3およびC4光合成分化のためのTriticum aestivumおよびZea maysの構造形質の評価

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DOI:

10.3791/66843

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2024年7月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

この記事について

サマリー

C3 と C4 の葉の断面の解剖学的違いを評価することは、光合成効率を理解するのに役立ちます。この論文では、フリーハンドおよび半薄葉の断面の準備と検査、および作物種 Triticum aestivum および Zea maysの準備における注意事項について説明します。

要約

C3のメカニズムと比較して、C4光合成の効率が向上するのは、CO2を束状シース細胞に集中させる能力に起因します。C4光合成の有効性と固有の水利用効率は、葉肉細胞と束葉細胞の割合、束鞘のサイズと密度、束鞘細胞のサイズ、密度、および細胞壁の厚さに直接関連しています。これらの形質の迅速な顕微鏡分析は、従来の光学顕微鏡を使用してフリーハンドおよびセミシンセクショナで行うことができ、特定の細胞タイプを同定および調査することにより、C4作物の光合成効率に関する貴重な情報を提供します。さらに、解剖学的測定や細胞タイプの診断に影響を与えるフリーハンドおよび半薄切片の調製におけるエラーと、これらのエラーを回避する方法を示します。この顕微鏡的アプローチは、環境変動に対する光合成順応に関する洞察を収集する効率的な手段を提供し、将来の気候に対する作物の迅速なスクリーニングに役立ちます。

概要

光合成は、光エネルギーを化学エネルギーに変換する基本的なプロセスであり、陸生栄養ネットワークの基礎となるものです。植物の大部分は光合成のC3経路をたどり、主要な光合成生成物は3炭素化合物グリセリン酸3-リン酸です。C3 光合成は、20 億年以上前に、CO2 が豊富で O21 が少ない大気中で進化しました。これらの条件下で進化した主要な光合成酵素リブロース1,5ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(Rubisco)は、O2と競合して光呼吸を開始するため、現在の低CO2高O2条件には最適ではありません。光呼吸は、エネルギーを生成して副産物としてCO2を放出する代わりにエネルギーを消費する無駄な経路です。したがって、葉緑体中のRubisco周辺のCO2濃度を高く維持して、酸素化を防ぐことが重要です3,4。C3植物がCO2を濃縮できないため、周囲の空気から葉緑体へのCO2の大幅なドローダウンがあり、光合成が抑制され、植物の成長とバイオマス生産に影響を及ぼします2,5,6。

C3植物では、光合成は気孔を介したCO2の侵入、葉肉を介したその拡散、および光合成酵素の生化学的活性によって制限されます。CO2の侵入は、まず気孔コンダクタンスによって制限され、これは気温や湿度などの環境条件によって制御されます。次に、CO2は葉の内部気相と液相を通ってRubisco7に拡散します。C3植物では、光合成のすべての段階が葉肉細胞の葉緑体で起こり、植物は大気から葉緑体へのCO2の一定の流入を維持する必要があります。葉緑体におけるCO2の利用可能性は、気孔の開放性、葉肉構造、および個々の細胞および葉緑体の特性に依存するため、植物は、水の利用可能性の低さや高温など、最終的に光合成に影響を与える環境制約の影響を受けやすくなる7,8,9,10、特に気候変動条件に対する脆弱性が強調されている11。

C3経路の非効率性、最適なCO2レベルを維持する限界、環境要因に対する感受性によってもたらされる課題を考えると、特定の植物では、別の経路であるC4光合成経路が進化しています。特徴的に、C4植物は空間的に分離された2つの生化学的経路を持っています。最初のCO2固定は、RubiscoよりもCO2に対する親和性が高く、酸素化活性を欠くホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって葉肉細胞で発生します。形成されたC4生成物は、さらに束状シース細胞に輸送され、そこで脱炭酸され、CO2が再び放出され、Rubisco(C3光合成)によって固定される12,13,14。PEPカルボキシラーゼのCO2および束鞘細胞の厚い細胞壁に対する親和性が高いため、束鞘細胞内のCO2濃度が可能になり、したがって、C4植物はCO2固定とカルバンサイクルを空間的に分離することにより光呼吸を最小限に抑えます。C4経路の採用は、環境制約に対する自然の適応反応を示しており、変化する気候条件15で作物の生産性と回復力を改善するための潜在的な戦略についての洞察を提供します。

C4植物の葉の構造の特殊な解剖学的構造は、葉緑体を含む拡大した維管束鞘細胞に囲まれた静脈と、束鞘細胞の周りをパターン化する外輪内の葉肉細胞の放射状配置によって特徴付けられます。葉肉細胞は束鞘細胞に近接しているため、2つの細胞タイプ間で代謝産物を迅速かつ連続的に輸送することができます。この細胞の配置はC4植物に典型的であり、クランツ解剖学16と呼ばれます。C3種では、葉肉細胞の特殊化と配置はさまざまですが、束鞘細胞は明らかに小さく、葉緑体が少ないか、葉緑体がまったくありません。クランツの特定の解剖学的構造は、C3-カルボキシル化酵素Rubiscoが位置する束鞘細胞の葉緑体にCO2を集中させることを可能にし、光呼吸を効果的に妨げます4,17,18。その一見複雑な配置にもかかわらず、これらの変化は、被子植物の進化において独立して複数回発生しており、これは比較的実現可能な進化経路19,20,21であり、様々な分類群がC3とC4炭素代謝の中間段階にあることが示されており、C3−C4またはC2と呼ばれている。 CO2 22,23,24,25を集中して再同化する能力を持っています。

多くのC4植物は経済的に重要な作物であり、イネのようなC3作物を遺伝子操作して気候の回復力を向上させ、収量を確保することは、過去数十年で関心を集めてきたトピックでした26,27。しかし、工学的な努力には、C4の特殊な解剖学的構造と、それが光合成をどのように制御するかについての詳細な理解が必要です2,28。

C4 クランツの解剖学を確立することは、C4 光合成を C3 作物25 に工学するという野心的な目標を達成するための前提条件です。しかし、クランツの解剖学的構造の制御とその主要な解剖学的形質を迅速にスクリーニングする方法に関する現在の理解は限られており、雑種種を特定することは困難です。これまでの研究で、C3およびC4植物における光合成効率を調節する主要な形質には、静脈間距離、束鞘複合体の直径、および束鞘細胞のサイズが含まれることが示されている14,29。これらの形質は、フリーハンド切片を使用して簡単にスクリーニングでき、セミシン切片を使用して定量的に分析できます。ここでは、フリーハンドのクロス顕微鏡および光学顕微鏡によるC3およびC4の解剖学的鑑別診断を可能にする形質、すなわち束鞘面積、静脈間距離、および静脈頻度を評価する方法について説明します。

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プロトコル

1.植物の成長条件

  1. コムギ(Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis")とトウモロコシ(Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam")をそれぞれ代表的なC3 およびC4 植物として選択します。種子から環境制御された成長チャンバーで両方の植物種を育てます。
  2. 相対湿度を55%に維持し、気温を25°C/18°C(昼/夜)にし、12時間の光の期間を設けます。植物表面の光合成光子束密度(Q)を1200 μmol/m2/sに維持し、自然な生育条件を表現します。すべての植物を周囲CO2 濃度400μmol/molで育てます。
  3. 蒸留水で2日 ごとに植物に水をやり、苗が出現してから10日後にホーグランドの溶液で施肥します。与えられた条件で60日間植物を育て、顕微鏡分析のために完全に拡大した葉を使用します。

2. フリーハンド切片の準備と閲覧

  1. 各植物から成熟した非老化性の葉を3枚選択し、蒸留水で保管します。新しい片面カミソリの刃を使用して、葉の表面と直角を形成するように1つのレベリングカットを行い、セクションが葉の表面に対して垂直に作られた横断断面であることを確認します。
  2. 歯用ワックスの上のガラス板に葉の標本を置き、サンプルを安定させ、滑りを防ぎます。葉の標本の上で刃をまっすぐ下に動かして切断し、細胞をきれいに切ります。断面を蒸留水に保管してください。
  3. サンプルをスライドガラスに取り付けて、水滴の上に置き、顕微鏡での観察とイメージングのためにガラスカバースリップで覆います。気泡を閉じ込めないでください。
  4. 複眼顕微鏡でスライドを10倍と20倍の倍率で観察します。ソフトウェアガイドに従って、関連するスケールとともに画像を保存します。

3. セミシン切片の作製

  1. ステップ2.2のように、 Z.mays と T.aestivum の両方の葉から中肋骨に沿って肋間領域から約3 mm x 5 mmのサイズの切片をガラス板に切り取ります。カットセクションの長さが葉の木目に沿っていることを確認してください。
  2. 植物材料を1 mLの固定緩衝液(0.1 Mリン酸緩衝液中の4%グルタル酸アルデヒド、pH = 6.9、 表1)を入れたシリンジに入れます。
  3. シリンジを垂直に持ち、空気を抜いてから、先端に指をかざしてシリンジをポンピングして真空にします。サンプルがシリンジの底にくらみ、浸透が成功するまで繰り返します。
  4. シリンジの内容物をラベル付きガラスバイアルに移し、次のステップに進む前に4°Cで48時間保存します(表2)。
  5. 各バイアルについて、ピペットで固定液を静かに取り出し、サンプルが覆われるまでリン酸緩衝液を加えます。30分間放置します。この手順を3回繰り返します。
  6. ピペットでリン酸緩衝液を取り出し、サンプルが覆われるまで四酸化オスミウム(注意)を追加します。サンプルやその他の有機物は黒くなります。ダブルグローブを使用してください。1時間放置します。
  7. ピペットで前の溶液を取り出し、サンプルを蒸留水で覆います。30分間放置しますこの手順を3回繰り返し、ダブルグローブを使用します。
  8. 前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを50/50蒸留水-エタノール溶液で覆います。30分間放置します。次のシリーズの蒸留水-エタノール溶液でこのステップを繰り返します:30/70、20/80、10/90、および100%エタノールで2x。これらの溶液中のサンプルは、4°Cで一晩放置できます。
  9. 前の溶液をピペットで取り出し、サンプルを1/3レジンエタノール溶液で覆います。サンプルをミキサープレートに置き、2時間放置します。1/2、1/1、2/1、3/1、および2xの100%樹脂のレジン-エタノール溶液でこのステップを繰り返します。これらの溶液中のサンプルは、4°Cで一晩放置できます。
  10. 平坦な埋込み型(キャビティ16個、キャビティ寸法:14L×W4.8W×D3(mm))のキャビティを100%樹脂で覆い、キャビティの一端にサンプルを置きます。各サンプルに鉛筆で書かれた紙のラベルを準備し、キャビティのもう一方の端に置きます。
  11. すべてのキャビティを100%樹脂で完全に満たし、サンプルとラベルが動いた場合はまっすぐにします。型を埋め込みフィルムで覆い、アクリル樹脂製品のガイドラインに従ってオーブンで重合します。
  12. 重合ブロックをサンプルと一緒にウルトラミクロトームの試料ホルダーにセットします。粗いガラスナイフを使用して、組織が見え、余分な樹脂がなくなるまでブロックをトリミングします。
  13. 半薄切片をガラスナイフまたはダイヤモンドナイフを使用して横方向(1μm)に切断します。水面から金属製の接種ループを使用して切片を採取し、スライドガラスの上に置きます。スライドをホットプレート(60°C)で乾燥させ、切片をガラスに固定します。
  14. 固定切片をトルイジンブルー(1%水溶液)で5秒間染色した後、蒸留水ですすぎ、ホットプレートで再度乾燥させます。
    注:化学固定プロセスがヒュームフードの下で行われることを確認してください。ガラスナイフは定期的に交換して、裂け目や歪みのない部分を可能にする鋭い切り傷を確保する必要があります。

4. サンプルのイメージング

  1. 生葉切片のイメージング
    1. マニュアルに従って、付属のソフトウェアを使用して複合光学顕微鏡をセットアップします。
    2. スライドガラスをステージに置きます。接眼レンズを調整し、 view セクションを10倍で取得しますview 次に、20倍と40倍の対物レンズで。
    3. 各対物レンズで、ライブチャネルをナビゲートし、関心のある領域に焦点を合わせ、静脈の周りの束シース細胞を見つけます。
    4. フォーカスが合ったら、 フリーズ ボタンをクリックし、 スケールバー の スケールバー タブではじょうしゃん。イメージを に保存します。画像分析用の TIF 形式。
  2. レジン浸潤切片のイメージング
    1. 自動光学顕微鏡をコンピューター上の付属のソフトウェアと接続してセットアップします。
    2. 透明チャンネルをロードし、スライドを顕微鏡ステージに置きます。40倍の対物レンズ倍率で切片にピントを合わせ、明るさを調整してすべての細胞構造が見えるようにします。
    3. ナビゲーター機能を使用してセクションの位置領域を設定し、セクション全体が画像化されるようにし、[ ステッチ ]ボタンをクリックします。
    4. [完了] をクリックし、[開始] をクリックして、顕微鏡でセクション全体をイメージングできるようにします。画像解析ソフトを開き、顕微鏡で撮影したタイルを開きます。
    5. 整列機能を使用して、タイルが重ならないようにします。画像を生成したら、[調整]タブを使用して位置、明るさ、回転を調整します。
    6. で保存する前に、画像にスケールを印刷します。TIF 形式。
  3. ImageJソフトウェアを使用した解剖学的測定
    1. ImageJソフトウェアを開き、画像をウィンドウにドラッグして読み込みます。
    2. [ライン] ツールを使用して、縮尺を次のようにキャリブレーションします。縮尺記号の上に線を描画し、[ 解析] > [スケールの設定] を選択し、既知の距離をスケール バーの長さに変更し、長さの単位を正しい単位に変更します。
    3. ラインツールを選択し、関心のある領域全体に線を引き、Mキーを押して、予想される特性を測定します。
    4. 面積計測の場合は、 ポリゴン選択ツール を選択し、対象の組織の周囲に描画します。 M キーを押して終了します。測定値はポップアップウィンドウとして表示され、スプレッドシートにコピーしてさらにデータ分析を行うことができます。

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結果

図1A は、新鮮な切片作成と光学顕微鏡の両方で葉を切片化するための正しい向きを示しています。片面カミソリと歯科用ワックスシートを使用して新鮮な切片を切断する方法を 図1Bに示します。結果のセクションを 図 1C に示します。

図2 は、C3 植物 T.aestivum とC4 植物 Z.maysの代表的な葉のフリーハンドセクションを示しています。静脈の周囲には束状の鞘細胞が見られ、トウモロコシは丸みを帯びた緑色の細胞を持ち、葉緑体の存在が高いことを示しています。これらの画像から、葉の厚さと総束鞘面積を取得することが可能です。しかしながら、この方法では、葉肉のさらなる特性評価は不可能である。

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ディスカッション

この記事では、葉の解剖学的構造を測定する定量的方法と定性的方法の両方と、それらを最適化する方法について説明します。さらに、この方法論は、C3 と C4 の断面を区別するのに最も有用な解剖学的形質を決定するために、代表的な作物種に適用されます。これらの形質を理解することは、C2光合成と呼ばれる雑種種が研究のより有望な手段になりつつあるため、不可欠です。現在のところ、C2光合成を使用することが確認されているのは、Diplotaxis tenuifolia(ルッコラ)の1つの作物種のみですが、現在の記録が示すものよりも多くある可能性があります25。C2系統内には、種内光合成の多様性と可塑性が高レベルに存在します。このことは、C2光合成の発生を確認するためには、CO2補償点、超微細構造解析、および免疫組織化学30のような複数の証拠が必要であることを示唆している。

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、欧州連合H2020プログラム(プロジェクトGAIN4CROPS、GA番号862087)を認めています。センター・オブ・エクセレンス「AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates」は、エストニア教育研究省の資金提供を受けています。 T. aestivum と Z. maysの種子を提供してくださったEvelin Loit-Harro教授、葉の断面作成にご協力いただいたPaula PalmetさんとVaiko Vainolaさん、分析にご協力いただいたJoão Paulo de Silva Souzaさんに感謝いたします。すべての画像は、さまざまなプロジェクトの下でエストニア生命科学大学の顕微鏡ユニットから取得されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
リン酸水素二ナトリウム二水和物 (Na2HPO42H2O) purePENTA, CZ10028-24-7
埋め込みフィルム, 7.8 mil 厚さ, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
エタノール, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000危険性:引火性の高い液体と蒸気。
EVOS Invitrogen FL Auto 2 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, US
Flat Embedding PTFE Mold with Metal Frame, 16 cavitiesPELCO, US10501
Glass vial 2 mlVWR Life Science, US548-0045
Glutaraldehyde 50% solutionVWR Life Science, US23H2856331危険:吸入すると致命的です。飲み込むと有毒です。重度の皮膚や目の損傷を引き起こします。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。保護手袋、保護服、目、顔の保護具を着用してください。
Histo ダイヤモンド ナイフDiatome、米国
ライカ EM UC7ライカ ウィーン、AT
LR 白色樹脂硬質グレード 電子顕微鏡科学、US14383危険性: 皮膚の炎症を引き起こします。重度の眼の炎症を引き起こす呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。眠気やめまいを引き起こす可能性があります保護手袋、保護服、目、顔の保護具を着用してください。
顕微鏡スライドNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 and Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019危険: 飲み込んだり、皮膚に接触したり、吸入したりすると致命的です。重度の皮膚の火傷や目の損傷を引き起こす二重の保護手袋、保護服、目と顔の保護具を着用してください。
ピペットとピペットチップThermo Scientific、FIKJ16047
リン酸二水素ナトリウム二水和物 (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA、CZ13472-35-0
シリンジ 10 mlEcoject、DE20010
トルイジンブルー、汎用グレードFisher Scientific、 GB2045836

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