Method Article

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

DOI:

10.3791/66845

⸱

August 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多細胞腫瘍スフェロイドは、腫瘍の微小環境を再現し、薬物療法を試験および最適化し、3Dコンテキストでバイオセンサーとナノセンサーを使用するための一般的な3D組織微小凝集体モデルです。それらの生産の容易さ、予測可能なサイズ、成長、および観察された栄養素と代謝物の勾配は、3Dニッチのような細胞微小環境を再現するために重要です。しかし、スフェロイドの不均一性やその作製方法のばらつきは、細胞全体の代謝、生存率、薬物応答に影響を与える可能性があります。そのため、サイズ、ばらつき、バイオファブリケーションのニーズ、幹細胞生物学やがん細胞生物学における in vitro 3D組織モデルとしての使用など、最適な方法論を選択することは困難です。特に、スフェロイドの産生は、光学代謝イメージング、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、ナノセンサーによるスフェロイド低酸素症のモニタリング、生存率などの定量的生顕微鏡との適合性に影響を与える可能性があります。ここでは、従来のスフェロイド形成プロトコルをいくつか紹介し、生体広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、および2光子顕微鏡との適合性を強調しています。マルチプレックス自家蛍光FLIMを使用した、さまざまな種類のがんおよび幹細胞スフェロイドを使用した解析パイプラインへのフォローアップイメージングも紹介します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多細胞スフェロイドは、細胞の自己凝集によって取得され、球形を示す3D組織モデルのグループを表します。これらは、in vitroで細胞間および細胞とマトリックスの相互作用を模倣し、多数のがんおよび幹細胞由来のコンストラクト内で3Dコンテキストを再現するために広く使用されています。細胞の付着を減らし、凝集を促進するために、いくつかの技術が採用されています。これらには、表面張力1に依存する吊り下げ式が含まれます。超低付着プレート、マイクロモールド、マイクロウェルなどの細胞付着をはじく方法2,3;音波ベースのアプローチ4;流動誘起凝集法(スピナーフラスコ、バイオリアクター、マイクロ流体デバイス)5;磁性粒子支援形成6と凝集促進合成およびECMベースのマトリックスおよび足場の使用7,8,9。

癌の研究、開発、および新薬療法の検証において、スフェロイドは、栄養素、老廃物、およびO2の空間拡散制限勾配を再現する能力により魅力的なモデルであり、しばしば固形腫瘍に典型的な壊死性コアの形成につながる10,11。これらのより信頼性が高く洗練されたin vitroモデルは、動物研究の3Rの原則(置換、削減、改良)に従って、動物モデルの広範な使用の必要性に挑戦します(食品医薬品局[FDA]近代化法2.012)。がんに加えて、スフェロイドは幹細胞研究に応用されています。例えば、多能性幹細胞は胚様体(EB)を形成する能力を有しており、これは人工多能性幹細胞(iPSC)を、神経前駆細胞13や卵巣顆粒膜細胞13,14など、患者から直接入手することが困難な特殊な細胞型に分化させるために使用できる。さらに、EBの形成は、しばしば、より複雑なオルガノイドモデル、例えば、神経15、網膜16、心臓17、肝臓18、胃19、および腸オルガノイド20の開発における最初のステップである。実験に適したスフェロイド形成法を選択する際には、サイズ、再現性、スループット、ダウンストリームアプリケーションなどの要素を考慮する必要があります。

3D培養は複雑化するため、2D培養に比べてばらつきが大きくなる可能性があります。栄養組成物21、培地蒸発22、粘度23、pH制御24、スフェロイド形成方法、さらには培養25,26の時間などの要因により、さまざまな形態、サイズ、生存率、および異なる化学療法抵抗性27,28のスフェロイドを得ることができる.最近の研究では、スフェロイドの酸素勾配は常に静的ではなく、形成方法、スフェロイドサイズ、および細胞外粘度の影響を受け、スフェロイドの不均一性に影響を与えることが示された29。スフェロイドの再現性とデータへのアクセス性を向上させるために、MISpheroIDナレッジベースが開発され26、細胞株、培地、形成方法、およびスフェロイドサイズが再現性のある結果のための最小限の情報として特定されています。したがって、複数のハイスループット法(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびマイクロティッシュモールド)および低アタッチメント法(すなわち、BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェルプレート、足場フリーおよびスキャフォールドベース)(図1および表1)について、ウェルサイズ(最大スフェロイドサイズの推定値)、使用した消耗品、調製時間、およびスフェロイドを顕微鏡ディッシュに輸送せずにスフェロイドをモニタリングする可能性を含む詳細な比較が行われました。 後者では長期的な研究が可能ですが、ハイスループット法で作製したスフェロイドは、多くの場合、エンドポイント実験につながります。5DspheriPlateのグリッドを除くすべての方法は、不要な自家蛍光をもたらさないため、顕微鏡で直接使用できます。

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図1:スフェロイド形成方法の説明。 特許取得済みのマイクロウェルをプレートに統合したSphericalPlate 5Dなどのハイスループット法や、ラボで製造されたマイクロモールドやMicroTissueモールドは、スタンプを使用してアガロース(青)で複数のマイクロウェルを作製します。Lipidure(Amsbio)やBiofloat(Sarstedt)などの低接着性プレートは、細胞表面の接着を阻害し、細胞の自己凝集を促進する非接着性コーティングを使用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5Dスフェリプレート自社製作のマイクロモールドマイクロティッシュ低アタッチメント方式
スフェロイド数/ウェル7501589811
直径井戸90μm400μm800μm1ミリメートル
培養量1 mLの5ミリリットル1 mLの200μL
その他の消耗品/3%アガロース7mL500 μL の 2% アガロース/ *
準備時間10分間2時間+3日間のメディア適応0.5時間+15分メディア適応10〜30分+1時間の乾燥
モニタリングはいいいえ**はいはい
オート蛍光はいいいえいいえいいえ
再 利用いいえはいはいいいえ**
費用€€€€€€€€€€€:コーティングとマトリゲル
€€:市販の96ウェルプレート
*一部の細胞株では、コンパクトなスフェロイドを形成するためにECM(2%–5%マトリゲル)を添加する必要があります。
**コーティングは消耗するまで再利用できます。ただし、各プレートは少量のメディアを消費し、時間の経過とともにほこりが蓄積する可能性があります。フィルター滅菌は定期的に必要です。

表1:複数のスフェロイド形成方法の比較29.「モニタリング」:顕微鏡ディッシュに移すことなくスフェロイドをモニタリングする能力。€:0-50€、€€:50-150€、€€:150-500€、€€€:>500€

蛍光顕微鏡法は、細胞死、生存率、増殖、代謝、粘度、さらには機械的特性など、スフェロイド内の主要な生物学的側面を直接モニタリングすることを可能にする30。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、それらの(マイクロ)環境31,32,33,34内での蛍光プローブ相互作用を研究するための追加の定量的次元を提供し、異なる発光寿命35,36に従って重なり合う発光スペクトルを解像することを可能にする内因性細胞自家蛍光に基づく細胞代謝の調査。したがって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NAD(P)H)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、プロトポルフィリンIXなどの広範な細胞内自己蛍光化合物は、1光子および2光子FLIMで測定でき、グルコース異化作用、酸化的リン酸化(OxPhos)の固有の「センサー」として機能し、細胞の酸化還元状態の一般的な概要を提供します。NAD(P)Hは、遊離細胞質、またはタンパク質結合ミトコンドリア型で存在する37,38。同様に、FADの酸化状態は蛍光性であり、遊離型の寿命が長くなります。NAD(P)HおよびFAD顕微鏡法は、通常、試料の光損傷39を防ぐことを目的として、2光子励起FLIMを使用する。多くの場合、「光学代謝イメージング」FLIMは、色素ベースのプローブ、遺伝的にコードされたバイオセンサー、リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)、およびレシオメトリック強度ベースの測定と組み合わせて使用することで、スフェロイドまたはオルガノイドの代謝、酸素化、増殖、および細胞生存率のより完全な画像を提供することができます29,30,31.さらに、FLIMは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)法と組み合わせて、アクセプターと密接に接触したときのドナー蛍光色素の寿命変動を測定し、薬物とその標的ドメインとの結合を調査することもできます33,40,41。

取得したFLIM画像は、通常、ピクセルごとに寿命を計算するために分析されます。現在、蛍光寿命を得るためには、少なくとも3つの一般的な戦略が用いられています:半定量的な「高速FLIM」42(「タウセンス」と呼ばれることもあります)43,44、1指数関数的、2指数関数的、または3指数関数的フィッティングを使用した減衰曲線フィッティング、およびフェーザ変換とフェーザプロット解析による「フィッティングフリー」アプローチです。ベンダーに応じて、提供されているソフトウェア(LAS X、Symphotime、SPCImageなど)またはオープンソースソフトウェア(FLIMfit45、FLIMJ46、またはその他47など)のいずれかを使用して、測定されたFLIMデータを処理できます。通常、ベンダーが提供するソフトウェアは予備的なデータ分析に役立ちますが、オープンソースのソリューションは、フェーザプロットや3Dビジュアライゼーションなどを使用して、より正確な研究を提供できます。

スフェロイドの研究法としてのFLIMの有用性と魅力にもかかわらず、利用可能な実験プロトコルは非常に少なく、FLIMを含むライブマルチパラメトリック顕微鏡実験を成功させるための最も適切な形成方法を選択するための知識が一般的に不足しています。ここでは、一般的に使用されるスフェロイド形成プロトコルの詳細な比較を、その形態、生存率、および酸素化に基づいて、最近検証され特性評価された遠赤および近赤外(NIR)酸素感知ナノセンサー(MMIR1)と示します。カチオン性ナノ粒子には、参照O2-非感受性aza-BODIPY(励起650 nm、発光675 nm)とNIR O2感受性メタロポルフィリンPtTPTBPF(励起620 nm、発光760 nm)の2つのレポーター色素を含浸させます。MMIR1は、細胞毒性を導入することなく、従来の蛍光顕微鏡(レシオメトリック分析を使用)またはリン光寿命顕微鏡(PLIM)で酸素勾配のリアルタイム分析を可能にし、安定したシグナル、長期モニタリング、およびマルチプレックス25,29を可能にします。色素やナノセンサー、スフェロイドのスループット、または細胞タイプで染色する必要性に応じて、最も適切な形成プロトコルを選択できます。スフェロイドの生存率と酸素化の研究は、がんおよび幹細胞由来のスフェロイドの研究に関連しているため、提示されたプロトコルには、これらのモデルを使用したNAD(P)H-FLIMおよびFAD-FLIMの例と予想される典型的な結果も含まれています。提示されたイメージングおよび分析パイプラインは、最も一般的な時間相関のある単一光子計数ベースのFLIM顕微鏡プラットフォームを対象としています。

Protocol

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1. 多細胞スフェロイドの作製

  1. 細胞培養





















































    12. figure-protocol-1


Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適切なスフェロイド形成法の選択
選択したスフェロイド形成法は、スフェロイドのサイズ、形状、細胞密度、生存率、および薬剤感受性に大きく影響します(図2)。以前は、複数のハイスループット(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびMicroTissueモールド)と「中スループット」の低アタッチメント(BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェルプレート)法の効果が、スフェロイドの生存率と酸素化について比較されていました29。

ここでは、形成方法が異なれば、初期濃度が500細胞/スフェロイドという同じでも、サイズが異なるスフェロイドが得られます。 低付着の 96 ウェルプレートで形成された HCT116 スフェロイドは、形成から 5 日後には、ハイスループット法と比較して有意に大きかったです(図 2 および 表 2)。さらに、低接着法では、ヨウ化プロピジウム染色(赤)によって検出される壊死性コアの明らかな発達につながり、他の方法(MicroTissue、実験室製金型、および球面プレート5D)で生成されたスフェロイドは、スフェロイド体全体に死細胞が拡散して分布していることを示しました(図2A)。スフェロイドの体積にわたる細胞生存率のこの違いは、培地を介した酸素拡散にも影響を与える可能性があり、これはO2 分圧、消費速度、温度、およびO2 溶解度の影響を受ける可能性があります。さらに、ハイスループット分析法では、同じ容量内に多数のスフェロイドが存在するため、栄養素が枯渇し、老廃物がより早く蓄積されるため、より頻繁な培地交換が必要になります(図2A)。

全体的なスフェロイドの酸素化は、最近特徴付けられ検証されたMMIR1プローブ29を使用して測定され、以前に報告された詳細なプロトコル25を使用して測定されました。酸素化は、比較したすべてのスフェロイド形成法でS/N比が異なるため、ハイスループット法とローアタッチメント法の間で別々に比較することしかできませんでした(図2B)。球状プレート5Dスフェロイドは、MicroTissue(P値= 0.0697)および実験室で作られたマイクロモールド(P値= 0.0005)と比較して、全体的な酸素化が低いことを示しました(図2C)。球状プレート5Dで作製したスフェロイドは、アガロースモールド法と比較して、培地のエアインターフェース表面からの距離が長いため、静的培養ではO2 の送達が遅くなります。この仮説は、両方の低付着プレート間、さらに両方のアガロースモールド法間の酸素化値が統計的に類似しているため、有効です(図2D)。

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図2:スフェロイド形成法は、形態、サイズ、生存率、および酸素化に影響を与えます。 (A)HCT116スフェロイド(初期播種密度500細胞)を5日間培養し、ヨウ化プロピジウム(細胞壊死、赤、1 μg/mL)およびCalcein Green-AM(生細胞、緑、1 μg/mL)で1時間経度染色しました。低付着性の形成法では、壊死性コア(赤)を含むより大きなスフェロイドを作製します。(B) HCT116スフェロイドにおける酸素化(スフェロイド形成中に20μg/mL MMIR1を添加した500細胞の初期播種、6日間)は、MicroTissueおよび実験室で製造されたマイクロモールドで、SphericalPlate 5Dよりも多くの酸素化スフェロイドを示しました。 (C)比率測定によって計算された全体的なスフェロイドの酸素化。(D)5日後の面積正方形のスフェロイドサイズ。結果は、6〜16個のスフェロイドの平均±SEMを示しています。5D = SphericalPlate 5D、MM = Micromold法、MT = MicroTissue法。P値<0.001および****P値<0.0001 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

形成方法ウェルあたりのスフェロイドの量ウェルごとに播種された細胞の総量面積 (μm²)
マイクロティッシュ8140,500細胞/190 μl112,558±15,702
ラボメイドマイクロウェル1859794,500細胞/mL53,460±8,332
球面プレート 5D750375,000細胞/mL44,048±7,259
リピデュア1500 / 200 μL257,148人±28,132人
バイオフロート1500 / 200 μL254,475±21365

表2:スフェロイド形成方法が異なると、面積の2乗で測定すると、スフェロイドのサイズに違いが生じます。

実験に特定のスフェロイド形成方法を選択する際には、ナノ粒子の添加がスフェロイドの形状に影響を与える可能性があることに留意する必要があります。丸底マイクロウェルを用いた脂質ベースのコーティングを使用すると、プローブの沈殿が発生し、「サテライトスフェロイド」または非円形スフェロイドが形成される可能性があります(図3)。市販のBiofloatプレートにO2 プローブを添加すると、スフェロイド周辺部が非コンパクトになり、ナノ粒子とマイクロプレートコーティングとの干渉の可能性が示唆されます。スフェロイドの形態は、ピペットチップに付着した粉塵によっても影響を受けることがあります。懸濁液中の細胞は粉塵に付着することがあり、これにより形状に影響を与えます。したがって、ラックにすでに付属している詰め替え可能なピペットチップを使用することをお勧めします。

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図3:非理想的なスフェロイド形成の例を含む透過光顕微鏡画像。 ナノ粒子の不適切な保存は、プローブの沈殿を引き起こし、スフェロイドの形成を妨げる可能性があります。プローブとダストの干渉の例。スケールバーは100μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

明らかに、スフェロイド形成方法はスフェロイドのサイズ、形態、および生存率に影響を与え、それらの酸素化に違いをもたらします。アガロース型(MicroTissue型などの市販)を用いたハイスループット法は、ほとんどの実験に適合します。その結果、より再現性の高い形状が得られ、ナノ粒子の沈殿を誘発せず、再利用可能で、直接フォローアップ顕微鏡法に適合します。ただし、大型スフェロイド(>800 μm)や長期培養の場合は、ハイスループット法では頻繁な培地交換が必要になるため、低結合法が推奨されます。このような場合、ナノ粒子の沈殿問題とそのスフェロイド形成への影響は、スフェロイド形成前に2次元単分子膜培養物を一晩前染色することで回避できます(図4)。

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図4:生蛍光顕微鏡のスフェロイド形成法を選択するための推奨アルゴリズム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  

スフェロイドのマルチパラメータFLIM 2光子FLIM顕微鏡によるNAD(P)Hイメージングにより、HCT116スフェロイドの代謝不均一性が明らかになりました
ラベルフリー代謝イメージングにおける著名な自家蛍光マーカーであるNAD(P)Hは、解糖系の寿命が短く、OxPhosの寿命が長いことを示しており、スフェロイドやオルガノイドなどの3Dモデルにおける代謝活性の空間分布を解読することができます31。HCT116スフェロイドのNAD(P)H分布を簡便に解析するために、フェーザーベースの定量法による自家蛍光NAD(P)H分析を行い、解糖と酸化的リン酸化(OxPhos)が結合した状態を明らかにしました。HCT116スフェロイドの蛍光強度画像ではスフェロイド間に有意差は認められませんでしたが、NAD(P)Hの高速FLIMイメージングでは、スフェロイドの光学切片内に明確な差が見られました。高速FLIM画像では、内部領域が蛍光寿命が短いスフェロイドを白い円でマークし、これを解糖コアとして識別しました(図5A)。その結果、スフェロイドは、解糖コアの有無に基づいて、解糖コアグループと非解糖コアグループの2つのグループに分けられました。重心ベースのフェーザ解析を使用して、2つの異なるグループ間の違いを統計的に解析し、ピクセルクラスタの重心から自由NAD(P)Hポイントまでの距離を測定しました。 図 5B に示すように、フェーザ プロットでは、解糖基と非解糖基との間に明らかなピクセル クラスターの違いがありました。距離を正確に測定するために、フェーザプロット上の自由NAD(P)H点をLAS XソフトウェアのFLIMモジュールを使用して正確にマークし、正確な座標を決定するためにFIJIソフトウェアにエクスポートしました。その後、プロトコル2.3に従って、FIJIソフトウェアを使用して各グループのフェーザプロットで重心座標を測定しました。ピタゴラスの定理を使用して、重心から自由NAD(P)H点までの距離(D)を計算し、これにより、OxPhosスフェロイドと解糖コアを持つスフェロイドを区別するためのNAD(P)Hプロファイルの解析を容易にしました。箱ひげ図に示されているように、結果は、解糖コアスフェロイドと非解糖コアグループ(***P値<0.001)との間の有意な距離差を示しています(図5C)。この結果は高速FLIMイメージングと一致しており、このフェーザー解析法がスフェロイド集団のNAD(P)H分岐の定量解析に適していることが示されました。さらに、このアプローチが2つの回転楕円体グループ間の距離を比較するために適用可能かどうかを検証するために、両方のグループからの重心と自由NAD(P)H点の線形回帰分析を実行しました(図5D)。その結果、重心は自由NAD(P)Hと整列しており、相関係数が高い(R2 = 0.997)ことが示され、スフェロイドグループ間のNAD(P)H差を推測するための距離の比較が可能であることが確認されました。

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図5:低付着プレートを使用して作成されたHCT116スフェーザ解析:解糖コアと非解糖コアの比較 2光子FLIMによるNAD(P)H分布の比較。 取得パラメータ:レーザー強度:15%、解像度:512 x 512ピクセル、例:741 nm/em。411-491 nm。(A)蛍光強度と高速FLIM画像は、HCT116スフェロイドのNAD(P)H分布を示し、解糖コアを持つスフェロイド(左)とそうでないスフェロイド(右)を区別します。高速FLIM画像の白い円は、より短い寿命の領域を示し、解糖コアを定義しています。初期播種密度:50細胞(左)および500細胞(右)、インキュベーション時間:6日、スケールバー:50μm(B) HCT116スフェロイドの重心からフェーザプロット上の遊離NAD(P)H点までの距離を測定するための方法論、LAS X FLIMモジュールとFIJIソフトウェアを使用して、2つの異なるスフェロイドグループ(D:距離)。HCT116スフェロイドについては、ウェーブレットフィルタと閾値10をフェーザプロットに使用しました。(C) 重心から自由NAD(P)H点までの距離の差を、解糖コアグループと非解糖コアグループ(***P < 0.001)を比較した箱ひげ図。(D)解糖コア、非解糖コアグループ、および自由NAD(P)H理論座標からのフェーザプロット重心の線形フィッティングは、R2 = 0.997で正確な線形アライメントを示し、解糖コアと非解糖コアスフェロイド間の距離差を直接比較することを可能にしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒト歯髄幹細胞(DPSC)スフェロイドにおけるFAD自家蛍光および低酸素症のマルチプレックス解析
歯髄幹細胞スフェロイドは、骨芽細胞25,66,67を含むさまざまな組織のバイオファブリケーションのための魅力的な実験ツールです。しかし、それらの生存率と代謝はめったに研究されていません。これらの幹細胞由来スフェロイドは、かなり小さいサイズ(<200μm)、FAD/フラビン(後にFADと呼ばれる)からの明るい緑色の自家蛍光(例:460nm、em.550nm)、および「直接」および「逆」の低酸素勾配の存在を示す29。図6は、スフェロイドの共焦点レシオメトリックイメージング、酸素化(O2センシングナノ粒子MMIRの助けを借りる)、およびFADの自家蛍光FLIMを組み合わせた結果を示しています。「古典的な」直接酸素化勾配は直径69 mmの回転楕円体で観察されましたが、より大きな(141 μm)回転楕円体は「逆」勾配を示しました。これらの測定値にFAD-FLIMを追加すると、高速FLIMプロットとフェーザープロットが示すように、酸化代謝の違いを検証するのに役立ちます:小さなスフェロイドは、より長いFAD寿命のより顕著な割合を示し、小さなサイズのスフェロイドでより高い解糖活性を示している可能性があります。

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図6:ハイスループット自己作製アガロースマイクロモールド法(共焦点FLIM)により作製した、サイズの異なるhDPSCスフェロイド(小:188細胞/スフェロイド、大:820細胞/スフェロイド)におけるフラビン自家蛍光(例:例:460 nm/em.510-590 nm)および酸素化(MMIR O2感度ナノ粒子による強度比分析:例:614 nm/参照試薬631-690 nm/感度波長724-800 nm)のマルチパラメトリックイメージングの例(A、B)大きなhDPSCスフェロイド(A、B Sphs)および小さなhDPSCスフェロイド(B、S Sphs)における酸素化強度比とフラビン自家蛍光寿命イメージングの代表例。 (C,D)フェーザー雲幾何学的中心の比較に基づくフェーザープロット雲分析を使用したフラビン自家蛍光寿命の比較分析。(E)フェーザプロット上の大きなhDPSCスフェロイド(B Sphs)と小さなhDPSCスフェロイド(S Sphs)からのフラビン自家蛍光のピクセル重心(幾何学的中心)座標。τによる色分けは平均光子到着時間(FAST-FLIM画像)分布を示し、τ φ-tau相による色分けは、同じスフェロイドの蛍光寿命のフェーザー-FLIM分析に対応する、異なるFLIM分析アプローチに適用される2つの異なるカラーコード。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒトiPS細胞スフェロイドにおけるFAD自家蛍光と細胞死のマルチプレックス解析
ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)スフェロイドは、組織特異的分化の誘導やオルガノイドの産生の最初のステップとしてよく使用されます(例:神経オルガノイド培養の場合)。その取り扱いと特定の生成プロトコルによっては、オルガノイドの生存率とその後の再現性に深刻な影響を与える可能性があります。オルガノイドおよび神経前駆細胞を含むスフェロイドの非破壊研究は、成長および組み立てられた神経組織の構造評価、モニタリング、およびその発生中の品質を予測するために重要である68,69。図7Aは、自己蛍光性フラビン/FAD分子の非破壊FLIMが、iPS細胞スフェロイドの生存率に関する情報を提供できることを示しています。イメージングは、市販の超低アタッチメントプレートウェル(Corning)に9,000個のiPS細胞を播種してから4日後に行いました。イメージングの前に、スフェロイドを0.5 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)で1時間染色し、死細胞を可視化しました。これらのiPS細胞スフェロイドには、4日後に播種密度が9,000細胞の壊死性コアは観察されませんでした。フラビン/FAD自家蛍光の対応するフェーザープロット(図7B左パネル)では、3つの主要なパターンを区別することができます:培地自家蛍光のパターン(マゼンタ色)、PI領域なしに対応するパターン(平均τ φ - タウ相、~2.6 ns)、および細胞死マーカー - 染色(ROI2)と相関する領域のパターン(平均τ φ ~3.1 ns)です。PI処理したiPS細胞の2D培養物と未処理の2D培養物をさらに比較したところ、PIは長寿命のフラビン/FADフェーザーパターンの出現に影響を与えなかったことが示され(図7C)、このフラビン/FAD寿命の増加は、iPS細胞とその誘導体の生存率の低下の独立したマーカーとなり得ることを示しています。この観察は、強度ベースのイメージング70に関する最近の報告と一致していますが、FAD発光チャネル(506-582 nm)によるヨウ化プロピジウム強度の存在を完全に排除することはできません。フラビン/ FADの寿命変化と細胞死の潜在的なイベントとの関連を証明するには、さらなる調査が必要です。ROI領域のシンプルなマルチパラメトリックフェーザベースの分析は、迅速なスクリーニングとデータ分析のためのエレガントな方法を示しています。

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図7:細胞生存率を評価するためのiPS細胞スフェロイドにおけるフラビン自家蛍光共焦点FLIMおよびヨウ化プロピジウム 染色 (A)フラビン自家蛍光(左)およびヨウ化プロピジウム-PI(右)超低接着プレート(コーニング)に9,000細胞を播種し、イメージング前にPI染色(0.5 μg/mL、1時間)してから4日後のiPS細胞スフェロイドのFLIM。(B)フラビン自家蛍光(左)とヨウ化プロピジウム(右)の全体的な画像と対応するROI(ROI1-緑とROI2-赤、メディア自家蛍光-マゼンタ)のフェーザプロット分析。ROIは、ヨウ化プロピジウム標識の存在に基づいて選択されました。(C)PIで処理したiPS細胞および未処理のiPS細胞(0.5 μg/mL、1時間)の2D培養におけるフラビン自家蛍光の高速FLIMおよびフェーザープロット解析。469-542 nmの範囲でフラビン励起を収集した場合、フラビンの長い蛍光寿命(ピンクの円内のフェーザーパターンに対応)の外観に対するPI染色の影響は検出されませんでした。この検出器の範囲は、PI(550-720 nm)の励起スペクトルと重複しません。FADのより広い励起範囲(469-590 nm)を収集すると、PIの影響が見られます。画像の色分けは、平均光子到着時間の値(fast-FLIM)に対応します。イメージングパラメータは、T = 35°C、25X/0.95水浸対物レンズ(A-B)、40X/1.25グリセロール対物レンズ(C)でした。フラビン:例:460nm、em。506-582nm(AB)、ピンホール4AU。PI: ex. 535 nm, em.584-667 nm、ピンホール 1 AU。チャンネル:強度とタウ。フラビン自家蛍光の完全な崩壊を収集するための40MHzの繰り返し率。フェーザ解析設定ハーモニック1、スレッショルド1(AB)、47(C)、メディアンフィルター17(AB)、11(C)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:スフェロイド形成に関する追加プロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:解糖系コアと非解糖系コアのFLIMデータ.lif.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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補足ファイル7:解糖コアフリーNAD(P)H point.tif このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル8:解糖系コアフェーザー plot.tif このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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多細胞スフェロイドは、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境の研究、創薬、およびバイオファブリケーションのための「組織ビルディングブロック」の開発において選択される方法になりつつあります。スフェロイドの不均一な内部構造、栄養素の勾配、および酸素化は、比較的単純化されたアクセス可能な環境で、in vivo組織や腫瘍のそれらを模倣することができます。方法論の透明性26,28および標準化71の必要性により、これらのプロトコルは、研究者がライブ定量的蛍光寿命イメージング顕微鏡実験に最適なスフェロイド形成方法を選択するのに役立つと期待されている。提示された方法は、細胞染色ナノ粒子センサーと内因性細胞自家蛍光を利用しており、細胞死の染色と容易に組み合わせることができます。

最も重要なステップは、スフェロイド形成プロトコルです。したがって、ハイスループットのアガロースベースの方法では、培養培地のアガロース型を十分に平衡化することが不可欠です。平衡化時間が不十分な場合、残りのPBS中の栄養素が希釈され、スフェロイドの不均一性21,26,72,73の追加要因がもたらされます。また、作りたてのアガロース型は、気泡や微小な亀裂などの欠陥がないか目視で確認する必要があります。

ナノ粒子懸濁液はイメージングには効率的ですが、低付着形成法では自己凝集を示し、不規則な形状のスフェロイドの形成を引き起こす可能性があります。これは、多くの場合、培養培地に血清を添加するか、スフェロイド形成前に単層細胞培養を事前に染色することで軽減できます。多くの場合、スフェロイドの圧縮中に、少量のナノ粒子(例えば、初期染色濃度の10%)を添加することも、スフェロイドの増殖ゾーンの染色に役立つことがあります。最後に、すべての形成方法で「ダストフリー」の滅菌ピペットチップを使用することが重要です。

イメージング実験では、照明が細胞の生存率に及ぼす潜在的な影響を常に考慮する必要があります。したがって、各ライブイメージング実験に悪影響を与えるリスク要因を知ることが重要です。一般に、光損傷にはいくつかのメカニズムが関与している:(1)高い局所的な温度上昇、(2)機械的ストレス、(3)光化学的ストレス(酸化反応とフリーラジカル反応)74。イメージングモダリティ(例:1光子共焦点イメージングと多光子イメージング、連続照明モードとパルス照明モード、検出器の感度、励起調整が可能な場合は異なる波長での光源の出力)、細胞および組織の種類(例:効率的に光を吸収する色素またはその他の自家蛍光分子の組織タイプ依存の蓄積、3D組織と2D組織、 増殖およびイメージング培地組成)、蛍光プローブの起源(例えば、光増感特性)リスク因子の異なる組み合わせは、イメージング中に光毒性を誘発し得る。さらに、照射後に細胞死の増加が観察されない場合でも、ミトコンドリアおよび代謝に対する光力依存の早期死前の影響は、実験の分析および解釈を潜在的に妨げる可能性がある55。

実験結果への光毒性の影響を排除するために、研究者は、無傷のコントロールと比較して細胞生存率と細胞形態の変化の一般的なモニタリングを行うか、または細胞死プローブを使用して照明後の細胞死率の増加を推定する必要があります。代謝実験を実施する場合、パイロット実験では、測定された代謝パラメータに対するイメージングの影響を推定し、最小限に抑えるために、イメージングパラメータの最適化を行う必要があります。酸素感受性プローブの場合、光の過剰摂取は、いわゆる「光誘導O2消費」効果53,75によるO2感受性色素の燐光寿命と強度の突然の増加(O2感受性色素への参照の強度比の対応する変化)によって容易に追跡できる53,75.これは、例えば、以下の公開されたプロトコル25を使用して、異なる光パワーパラメータを用いたタイムラプス実験の運動曲線解析によって容易に行うことができる。パルス照明(例えば、TCSPC-F(P)LIM顕微鏡法で利用)の「防御」において、最近の研究は、定常照明測定76,77と比較して、ROS産生およびプローブ光退色への影響が最小限であることを示し、TCSPC-FLIMの従来の強度ベースのイメージングアプローチに対するさらなる利点を指摘している。

提示されたスフェロイド形成法の主な制限は、直接的および長期的なモニタリングアプリケーションにあります。アガロース型は、アガロースの厚い層と5D球面板の材料が赤色蛍光チャンネル(O2 プローブ)の測定を妨げる可能性があるため、長い作動距離対物レンズ(または追加の正立顕微鏡または蛍光実体顕微鏡)を必要とします。ハイスループット法で作製されるスフェロイドサイズは、マイクロウェルの直径によって制限され、培地の枯渇や酸性化を避けるために頻繁な培地交換が必要です。これらすべての制限があるため、ハイスループットを必要とする実験(3Dバイオプリンティングアプリケーションなど)には3Dシャーレ(MicroTissue)を、細胞数が少なくて済む「ミディアムスループット」の基礎研究には低接着法をお勧めします。

レシオメトリック酸素化モニタリングと従来の生細胞蛍光色素ベースの顕微鏡実験は、近赤外線(NIR)感度カメラ、発光ダイオード(LED)ベースの励起、および適切な対物レンズ25が装備されている場合、広く利用可能な倒立顕微鏡で手頃な価格です。より適切な光学セクショニングとFLIMのためには、市販の市販の共焦点顕微鏡システム(こちらで説明しているようなもの)をお勧めします。NAD(P)H自家蛍光を検出する方法についても説明しますが、より高価な2光子FLIM顕微鏡が必要ですが、白色光レーザーとハイブリッドまたはSPAD検出器を理想的に装備した共焦点FLIMシステムと互換性があり、有用な多くの異なるアプローチがあります。これらには、細胞代謝の評価、FRET-FLIMバイオセンサータンパク質、細胞および組織力学のイメージング、特定の細胞および組織タイプの自家蛍光、およびFLIM-FRET31を介して視覚化された受容体-薬物相互作用が含まれます。

ベンダーが提供するFLIM取得および解析ソフトウェアは、IRFまたは画像をダウンストリームのオープンソース解析と互換性のある形式でエクスポートできるとは限らないため、実験の成功に影響を与える可能性があります。ポストプロセッシングはFLIM解析ワークフローの重要な部分ですが、まだ普遍的に標準化されておらず、受け入れられているわけでもありません。カーブフィッティングには、フェーザアプローチと比較して、より多くの光子とより多くの計算能力が必要です。FLIMfit45 (グローバルおよびピクセル単位のフィッティング)とFlimview78 はカーブフィッティング解析に使用されるオープンソフトウェアであり、PAM79、FLUTE64、およびAlliGator80 はフェーザ解析に使用されます。FLIMJ46 は、両方のアプローチで動作する便利なImageJプラグインです。全体として、これらのオプションは、後処理ルーチンを改善し、より速く、より用途が広く、ユーザーフレンドリーになるのに役立ちます。

Disclosures

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開示するものはありません。

Acknowledgements

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この研究は、ゲント大学の特別研究基金(BOF)助成金(BOF/STA/202009/003;BOF/IOP/2022/058)、フランダース研究財団(FWO、I001922N)、欧州連合、fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% トリプシン-EDTAGibco25300-054シグマからも入手可能
10 mL 血清ピペットVWR612-3700同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
12ウェル細胞培養プレート、滅菌Greiner bio-one665-180同様の製品は、Sarstedt、Corning、その他の企業からも入手可能です。
12ウェルチャンバースライド、取り外し可能なIbidi81201Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientificなどからも入手可能
15mL遠心分離管Nerbe plus02-502-3001同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRなどの企業からも入手可能
3DペトリディッシュマイクロモールドマイクロティッシュZ764000-6EA
6ウェル細胞培養プレート、滅菌Greinerbio-one657160同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
70% エタノールChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400スフェロイド形成のための市販のコーティングされた96ウェルプレート
Calcein Green-AMTebubioAS-89201希釈1:1000
CellSens Dimensionソフトウェアで適用オリンパスの版3
人間の胎盤からのコラーゲン、タイプIVシグマC55330.07 mg/mLのコラーゲンおよび0.03 mg/mLのPoly-D-lysineのコーティングされた顕微鏡皿の調製のため
共焦点FLIMの顕微鏡Leica MicrosystemsN/AStellaris 8 Falconの白い光レーザー、HyD Xの検出器、気候/T制御室(OkoLab)、25x/0.95 Wの目的
D(+)-グルコースメルク8342イメージング培地(最終濃度10 mM)
ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、フェノールレッド、グルコース、ピルビン酸およびグルタミンフリーのSigma-AldrichD5030-10X1Lイメージング培地調製用
シ胎児血清 (FBS)Gibco10270-098シグマからも入手可能です。使用前に熱不活化する必要があります。
HEPES (1M)Gibco15630-080希釈 1/100 イメージング培地調製用 (最終濃度 10 mM)
ヒト結腸がん細胞 HCT116ATCC
ImageJNIHversion 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)Leica Microsystemsversion 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A、1 mMピルビン酸ナトリウムと10 mM HEPESVWR392-0420HCT116細胞の標準増殖培地
マイクロパターン化された3DプリントPDMSスタンプN/AN/Aシステム技術センター提供、ゲント大学
NaClChemlab教授ヤン・ヴァンフレテレン教授CL00.1429.100
ノイバウアーカッティングチャンバーフィッシャーサイエンティフィック15980396
O2プローブ: MMIR1該当なし該当なし 完全な特性評価、検証、および一部のアプリケーションは、以下で見つけることができます: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSフィッシャーサイエンティフィックGibco18912014PBS錠剤を500mLの蒸留水に溶解します。
連鎖球菌連鎖球菌:P (10,000 U/mL) / ストレプトマイシン (10,000 μg/mL) 100倍溶液Gibco15140-122シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。
ポリ-D-リジンシグマP6407-5mg0.07 mg/mLコラーゲンおよび0.03 mg/mLポリ-D-リジンコーティング顕微鏡ディッシュの調製には
ヨウ化プロピジウムシグマ-アルドリッチ25535-16-4細胞死染色、1 & マイクロ;1時間インキュベーション
PVDFシリンジフィルター0.22 µでのg / mL;mNovolabA35149同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
ビン酸ナトリウム (100 mM)Gibco11360-070希釈 1/100 イメージング媒体の調製用(最終濃度 1mM)
球面プレート 5D 24 ウェルクーゲルマイヤーズ SP5D-24W
滅菌ペトリディッシュグライナー バイオワン633181同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
組織培養フラスコ (25 cm² )VWR734-2311同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
です 組織培養フラスコ(75 cm²)VWR734-2313同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
Uボトム96ウェルプレートVWR10062-900同様の製品は、Sarstedt、Corning、Greiner Bio-oneおよび他の会社からも入手可能
Ultrapure AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500アガロース低融点(A-9414、シグマ)、ルーチン使用のためのアガロース(A-9539、シグマ)
広視野蛍光倒立顕微鏡リンパスN / A倒立蛍光顕微鏡IX81、電動Z軸制御、CoolLED pE4000(16チャンネル、365-770 nm)、ORCA-Flash4.0LT(浜松)cMOSカメラ、ガラス温暖プレートOkolab、CellSens Dimension v.3ソフトウェアおよび空気対物レンズ4x/0.13 UPlanFLNおよび40x/0.6 LUCPlanFLN。(オプション、高解像度イメージング用) 60x/1.0 LUMPLFLN 水
です です です ウ マイクロ、です ピルです です です オ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  2. Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs. J Vis Exp. (190), e64564(2022).
  3. Griner, L. M., et al. Generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening. J Vis Exp. (139), e57476(2018).
  4. Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids. J Vis Exp. (200), e66078(2023).
  5. He, H., et al. Dynamic formation of cellular aggregates of chondrocytes and mesenchymal stem cells in spinner flask. Cell Prolif. 52 (4), e12587(2019).
  6. Perez, J. E., Nagle, I., Wilhelm, C. Magnetic molding of tumor spheroids: Emerging model for cancer screening. Biofabrication. 13 (1), 015018(2020).
  7. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3d bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomater. 95, 357-370 (2019).
  8. Guillaume, O., et al. Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering. Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).
  9. Danilevicius, P., et al. laser-made 3D microscaffolds for tissue spheroid encagement. Biointerphases. 10 (2), 021011(2015).
  10. Jamieson, L. E., Harrison, D. J., Campbell, C. Chemical analysis of multicellular tumour spheroids. Analyst. 140 (12), 3910-3920 (2015).
  11. Dmitriev, R., Borisov, S., Jenkins, J., Papkovsky, D. Multiparametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. SPIE BiOS. 9328, (2015).
  12. Zushin, P. -J. H., Mukherjee, S., Wu, J. C. FDA Modernization Act 2.0: transitioning beyond animal models with human cells, organoids, and AI/ML-based approaches. J Clin Invest. 133 (21), e175824(2023).
  13. Kim, D. -S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human es and ips cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev Rep. 6 (2), 270-281 (2010).
  14. Hart, D., Gutiérrez, D. R., Biason-Lauber, A. Generation of a human ovarian granulosa cell model from induced pluripotent stem cells. bioRxiv. , 2022(2022).
  15. Chiaradia, I., et al. Tissue morphology influences the temporal program of human brain organoid development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1351-1367 (2023).
  16. Wagstaff, E. L., Ten Asbroek, A. L., Ten Brink, J. B., Jansonius, N. M., Bergen, A. A. An alternative approach to produce versatile retinal organoids with accelerated ganglion cell development. Sci Rep. 11 (1), 1101(2021).
  17. Thavandiran, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49), E4698-E4707 (2013).
  18. Harrison, S. P., et al. Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human pscs. Exp Mol Med. 55 (9), 2005-2024 (2023).
  19. Noguchi, T. -A. K., Kurisaki, A. Formation of stomach tissue by organoid culture using mouse embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2017, 217-228 (2017).
  20. Takahashi, J., et al. Suspension culture in a rotating bioreactor for efficient generation of human intestinal organoids. Cell Reports Methods. 2 (11), 100337(2022).
  21. Lagziel, S., Gottlieb, E., Shlomi, T. Mind your media. Nat Metab. 2 (12), 1369-1372 (2020).
  22. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
  23. Bera, K., et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611 (7935), 365-373 (2022).
  24. Michl, J., Park, K. C., Swietach, P. Evidence-based guidelines for controlling ph in mammalian live-cell culture systems. Commun Biol. 2, 144(2019).
  25. Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable oxygen microscopy-assisted biofabrication of multicellular spheroids. J Vis Exp. (182), e63403(2022).
  26. Peirsman, A., et al. Mispheroid: A knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  27. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  28. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: Comparison of different protocols. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  29. Debruyne, A. C., et al. Live microscopy of multicellular spheroids with the multimodal near-infrared nanoparticles reveals differences in oxygenation gradients. ACS Nano. 18 (19), 12168-12186 (2024).
  30. Debruyne, A. C., Okkelman, I. A., Dmitriev, R. I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 144, 55-66 (2023).
  31. Barroso, M., Monaghan, M. G., Niesner, R., Dmitriev, R. I. Probing organoid metabolism using fluorescence lifetime imaging microscopy (flim): The next frontier of drug discovery and disease understanding. Adv Drug Deliv Rev. 201, 115081(2023).
  32. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging-techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  33. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. J Cell Sci. 134 (9), 1-17 (2021).
  34. Sarder, P., Maji, D., Achilefu, S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 26 (6), 963-974 (2015).
  35. Alfonso-Garcia, A., et al. Mesoscopic fluorescence lifetime imaging: Fundamental principles, clinical applications and future directions. J Biophotonics. 14 (6), e202000472(2021).
  36. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  37. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. J Cell Biol. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  38. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 4 (2), 241-263 (2010).
  39. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  40. Verma, A., et al. Fluorescence lifetime imaging for quantification of targeted drug delivery in varying tumor microenvironments. bioRxiv. , 2024(2024).
  41. Smith, J. T., et al. In vivo quantitative fret small animal imaging: Intensity versus lifetime-based fret. Biophys Rep. 3 (2), 100110(2023).
  42. Alvarez, L. A., et al. Application Note: SP8 Falcon: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal flim. Nat Methods. , (2019).
  43. Roberti, M. J., et al. TauSense: A fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00364-w.pdf (2020).
  44. Auer, J. M. T., Murphy, L. C., Xiao, D., Li, D. U., Wheeler, A. P. Non-fitting flim-fret facilitates analysis of protein interactions in live zebrafish embryos. J Microsc. 291 (1), 43-56 (2023).
  45. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLoS One. 8 (8), e70687(2013).
  46. Gao, D., et al. Flimj: An open-source imagej toolkit for fluorescence lifetime image data analysis. PloS One. 15 (12), e0238327(2020).
  47. Tullis, I. D. C., Ameer-Beg, S. M., Barber, P. R., Rankov, V., Vojnovic, B. Mapping femtosecond pulse front distortion and group velocity dispersion in multiphoton microscopy. Proc. SPIE 6089, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VI. , 60890(2006).
  48. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (22), e3080(2018).
  49. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  50. Badea, M. A., et al. Influence of matrigel on single-and multiple-spheroid cultures in breast cancer research. SLAS Discov. 24 (5), 563-578 (2019).
  51. Lang, S., Sharrard, R., Stark, M., Villette, J., Maitland, N. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
  52. Barra, J., et al. DMT1-dependent endosome-mitochondria interactions regulate mitochondrial iron translocation and metastatic outgrowth. Oncogene. 43 (9), 650-667 (2024).
  53. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Intracellular probes for imaging oxygen concentration: How good are they. Methods Appl Fluoresc. 3 (3), 034001(2015).
  54. Schweikhard, V., et al. Application Note: The power HyD family of detectors for confocal microscopy. Nat Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00398-0 (2020).
  55. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon flim microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).
  56. Bush, P. G., Wokosin, D. L., Hall, A. C. Two-versus one photon excitation laser scanning microscopy: Critical importance of excitation wavelength. Front Biosci. 12, 2646-2657 (2007).
  57. Liu, M., et al. Instrument response standard in time-resolved fluorescence spectroscopy at visible wavelength: Quenched fluorescein sodium. Appl Spectrosc. 68 (5), 577-583 (2014).
  58. Szabelski, M., et al. Collisional quenching of erythrosine b as a potential reference dye for impulse response function evaluation. Appl Spectrosc. 63 (3), 363-368 (2009).
  59. Chib, R., et al. Standard reference for instrument response function in fluorescence lifetime measurements in visible and near infrared. Meas Sci Technol. 27 (2), 027001(2015).
  60. Talbot, C. B., et al. Application of ultrafast gold luminescence to measuring the instrument response function for multispectral multiphoton fluorescence lifetime imaging. Opt Express. 19 (15), 13848-13861 (2011).
  61. Becker, W. Recording the instrument response function of a multiphoton flim system. Becker & Hickl. , Available from: https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/recording-the-instrument-response-function-of-a-multiphoton-flim-system/ (2007).
  62. Leben, R., Köhler, M., Radbruch, H., Hauser, A. E., Niesner, R. A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free nad (p) h fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci. 20 (22), 5565(2019).
  63. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using nadh and nadph autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  64. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A python gui for interactive phasor analysis of flim data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  65. Malacrida, L., Ranjit, S., Jameson, D. M., Gratton, E. The phasor plot: A universal circle to advance fluorescence lifetime analysis and interpretation. Annu Rev Biophys. 50, 575-593 (2021).
  66. Okkelman, I., Vandenberghe, W., Dmitriev, R. Role of preconditioning with oxygen and glucose deprivation in promoting differentiation of dental pulp stem cells in 3D culture. Mol Biol Cell. 34 (2), 1212(2022).
  67. Park, J. H., et al. The effect of bmp-mimetic peptide tethering bioinks on the differentiation of dental pulp stem cells (DPSCs) in 3D bioprinted dental constructs. Biofabrication. 12 (3), 035029(2020).
  68. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  69. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  70. Bryanskaya, E. O., et al. High levels of FAD autofluorescence indicate pathology preceding cell death. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1868 (1), 130520(2024).
  71. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 152(2021).
  72. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  73. Gstraunthaler, G., Seppi, T., Pfaller, W. Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures: Are renal cells in tissue culture hypoxic. Cell Physiol Biochem. 9 (3), 150-172 (1999).
  74. Glickman, R. D. Phototoxicity to the retina: Mechanisms of damage. Int J Toxicol. 21 (6), 473-490 (2002).
  75. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring Parameters of Oxygen Transport to Cells in the Microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , The Royal Society of Chemistry. (2018).
  76. Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41 (2), 191-197 (2006).
  77. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of pvp-hypericin: A new strategy using ms pulses of led and the fluorescent dye cfse. J Microsc. 245 (1), 100-108 (2012).
  78. Carrasco Kind, M., et al. flimview: A software framework to handle, visualize and analyze flim data. F1000Research. 9, 574(2020).
  79. Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. Pam: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophys J. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  80. Chen, S. -J., Sinsuebphon, N., Barroso, M., Intes, X., Michalet, X. Optical Molecular Probes, Imaging and Drug Delivery. , Optica Publishing Group. (2021).

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