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方法論記事

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

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DOI:

10.3791/66845

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2024年8月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。

要約

多細胞腫瘍スフェロイドは、腫瘍の微小環境を再現し、薬物療法を試験および最適化し、3Dコンテキストでバイオセンサーとナノセンサーを使用するための一般的な3D組織微小凝集体モデルです。それらの生産の容易さ、予測可能なサイズ、成長、および観察された栄養素と代謝物の勾配は、3Dニッチのような細胞微小環境を再現するために重要です。しかし、スフェロイドの不均一性やその作製方法のばらつきは、細胞全体の代謝、生存率、薬物応答に影響を与える可能性があります。そのため、サイズ、ばらつき、バイオファブリケーションのニーズ、幹細胞生物学やがん細胞生物学における in vitro 3D組織モデルとしての使用など、最適な方法論を選択することは困難です。特に、スフェロイドの産生は、光学代謝イメージング、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、ナノセンサーによるスフェロイド低酸素症のモニタリング、生存率などの定量的生顕微鏡との適合性に影響を与える可能性があります。ここでは、従来のスフェロイド形成プロトコルをいくつか紹介し、生体広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、および2光子顕微鏡との適合性を強調しています。マルチプレックス自家蛍光FLIMを使用した、さまざまな種類のがんおよび幹細胞スフェロイドを使用した解析パイプラインへのフォローアップイメージングも紹介します。

概要

多細胞スフェロイドは、細胞の自己凝集によって取得され、球形を示す3D組織モデルのグループを表します。これらは、in vitroで細胞間および細胞とマトリックスの相互作用を模倣し、多数のがんおよび幹細胞由来のコンストラクト内で3Dコンテキストを再現するために広く使用されています。細胞の付着を減らし、凝集を促進するために、いくつかの技術が採用されています。これらには、表面張力1に依存する吊り下げ式が含まれます。超低付着プレート、マイクロモールド、マイクロウェルなどの細胞付着をはじく方法2,3;音波ベースのアプローチ4;流動誘起凝集法(スピナーフラスコ、バイオリアクター、マイクロ流体デバイス)5;磁性粒子支援形成6と凝集促進合成およびECMベースのマトリックスおよび足場の使用7,8,9。

癌の研究、開発、および新薬療法の検証において、スフェロイドは、栄養素、老廃物、およびO2の空間拡散制限勾配を再現する能力により魅力的なモデルであり、しばしば固形腫瘍に典型的な壊死性コアの形成につながる10,11。これらのより信頼性が高く洗練されたin vitroモデルは、動物研究の3Rの原則(置換、削減、改良)に従って、動物モデルの広範な使用の必要性に挑戦します(食品医薬品局[FDA]近代化法2.012)。がんに加えて、スフェロイドは幹細胞研究に応用されています。例えば、多能性幹細胞は胚様体(EB)を形成する能力を有しており、これは人工多能性幹細胞(iPSC)を、神経前駆細胞13や卵巣顆粒膜細胞13,14など、患者から直接入手することが困難な特殊な細胞型に分化させるために使用できる。さらに、EBの形成は、しばしば、より複雑なオルガノイドモデル、例えば、神経15、網膜16、心臓17、肝臓18、胃19、および腸オルガノイド20の開発における最初のステップである。実験に適したスフェロイド形成法を選択する際には、サイズ、再現性、スループット、ダウンストリームアプリケーションなどの要素を考慮する必要があります。

3D培養は複雑化するため、2D培養に比べてばらつきが大きくなる可能性があります。栄養組成物21、培地蒸発22、粘度23、pH制御24、スフェロイド形成方法、さらには培養25,26の時間などの要因により、さまざまな形態、サイズ、生存率、および異なる化学療法抵抗性27,28のスフェロイドを得ることができる.最近の研究では、スフェロイドの酸素勾配は常に静的ではなく、形成方法、スフェロイドサイズ、および細胞外粘度の影響を受け、スフェロイドの不均一性に影響を与えることが示された29。スフェロイドの再現性とデータへのアクセス性を向上させるために、MISpheroIDナレッジベースが開発され26、細胞株、培地、形成方法、およびスフェロイドサイズが再現性のある結果のための最小限の情報として特定されています。したがって、複数のハイスループット法(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびマイクロティッシュモールド)および低アタッチメント法(すなわち、BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェルプレート、足場フリーおよびスキャフォールドベース)(図1および表1)について、ウェルサイズ(最大スフェロイドサイズの推定値)、使用した消耗品、調製時間、およびスフェロイドを顕微鏡ディッシュに輸送せずにスフェロイドをモニタリングする可能性を含む詳細な比較が行われました。 後者では長期的な研究が可能ですが、ハイスループット法で作製したスフェロイドは、多くの場合、エンドポイント実験につながります。5DspheriPlateのグリッドを除くすべての方法は、不要な自家蛍光をもたらさないため、顕微鏡で直接使用できます。

figure-introduction-1
図1:スフェロイド形成方法の説明。 特許取得済みのマイクロウェルをプレートに統合したSphericalPlate 5Dなどのハイスループット法や、ラボで製造されたマイクロモールドやMicroTissueモールドは、スタンプを使用してアガロース(青)で複数のマイクロウェルを作製します。Lipidure(Amsbio)やBiofloat(Sarstedt)などの低接着性プレートは、細胞表面の接着を阻害し、細胞の自己凝集を促進する非接着性コーティングを使用しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5Dスフェリプレート自社製作のマイクロモールドマイクロティッシュ低アタッチメント方式
スフェロイド数/ウェル7501589811
直径井戸90μm400μm800μm1ミリメートル
培養量1 mLの5ミリリットル1 mLの200μL
その他の消耗品/3%アガロース7mL500 μL の 2% アガロース/ *
準備時間10分間2時間+3日間のメディア適応0.5時間+15分メディア適応10〜30分+1時間の乾燥
モニタリングはいいいえ**はいはい
オート蛍光はいいいえいいえいいえ
再 利用いいえはいはいいいえ**
費用€€€€€€€€€€€:コーティングとマトリゲル
€€:市販の96ウェルプレート
*一部の細胞株では、コンパクトなスフェロイドを形成するためにECM(2%–5%マトリゲル)を添加する必要があります。
**コーティングは消耗するまで再利用できます。ただし、各プレートは少量のメディアを消費し、時間の経過とともにほこりが蓄積する可能性があります。フィルター滅菌は定期的に必要です。

表1:複数のスフェロイド形成方法の比較29.「モニタリング」:顕微鏡ディッシュに移すことなくスフェロイドをモニタリングする能力。€:0-50€、€€:50-150€、€€:150-500€、€€€:>500€

蛍光顕微鏡法は、細胞死、生存率、増殖、代謝、粘度、さらには機械的特性など、スフェロイド内の主要な生物学的側面を直接モニタリングすることを可能にする30。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、それらの(マイクロ)環境31,32,33,34内での蛍光プローブ相互作用を研究するための追加の定量的次元を提供し、異なる発光寿命35,36に従って重なり合う発光スペクトルを解像することを可能にする内因性細胞自家蛍光に基づく細胞代謝の調査。したがって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NAD(P)H)、フラビンモノヌクレオチド(FMN)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、プロトポルフィリンIXなどの広範な細胞内自己蛍光化合物は、1光子および2光子FLIMで測定でき、グルコース異化作用、酸化的リン酸化(OxPhos)の固有の「センサー」として機能し、細胞の酸化還元状態の一般的な概要を提供します。NAD(P)Hは、遊離細胞質、またはタンパク質結合ミトコンドリア型で存在する37,38。同様に、FADの酸化状態は蛍光性であり、遊離型の寿命が長くなります。NAD(P)HおよびFAD顕微鏡法は、通常、試料の光損傷39を防ぐことを目的として、2光子励起FLIMを使用する。多くの場合、「光学代謝イメージング」FLIMは、色素ベースのプローブ、遺伝的にコードされたバイオセンサー、リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)、およびレシオメトリック強度ベースの測定と組み合わせて使用することで、スフェロイドまたはオルガノイドの代謝、酸素化、増殖、および細胞生存率のより完全な画像を提供することができます29,30,31.さらに、FLIMは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)法と組み合わせて、アクセプターと密接に接触したときのドナー蛍光色素の寿命変動を測定し、薬物とその標的ドメインとの結合を調査することもできます33,40,41。

取得したFLIM画像は、通常、ピクセルごとに寿命を計算するために分析されます。現在、蛍光寿命を得るためには、少なくとも3つの一般的な戦略が用いられています:半定量的な「高速FLIM」42(「タウセンス」と呼ばれることもあります)43,44、1指数関数的、2指数関数的、または3指数関数的フィッティングを使用した減衰曲線フィッティング、およびフェーザ変換とフェーザプロット解析による「フィッティングフリー」アプローチです。ベンダーに応じて、提供されているソフトウェア(LAS X、Symphotime、SPCImageなど)またはオープンソースソフトウェア(FLIMfit45、FLIMJ46、またはその他47など)のいずれかを使用して、測定されたFLIMデータを処理できます。通常、ベンダーが提供するソフトウェアは予備的なデータ分析に役立ちますが、オープンソースのソリューションは、フェーザプロットや3Dビジュアライゼーションなどを使用して、より正確な研究を提供できます。

スフェロイドの研究法としてのFLIMの有用性と魅力にもかかわらず、利用可能な実験プロトコルは非常に少なく、FLIMを含むライブマルチパラメトリック顕微鏡実験を成功させるための最も適切な形成方法を選択するための知識が一般的に不足しています。ここでは、一般的に使用されるスフェロイド形成プロトコルの詳細な比較を、その形態、生存率、および酸素化に基づいて、最近検証され特性評価された遠赤および近赤外(NIR)酸素感知ナノセンサー(MMIR1)と示します。カチオン性ナノ粒子には、参照O2-非感受性aza-BODIPY(励起650 nm、発光675 nm)とNIR O2感受性メタロポルフィリンPtTPTBPF(励起620 nm、発光760 nm)の2つのレポーター色素を含浸させます。MMIR1は、細胞毒性を導入することなく、従来の蛍光顕微鏡(レシオメトリック分析を使用)またはリン光寿命顕微鏡(PLIM)で酸素勾配のリアルタイム分析を可能にし、安定したシグナル、長期モニタリング、およびマルチプレックス25,29を可能にします。色素やナノセンサー、スフェロイドのスループット、または細胞タイプで染色する必要性に応じて、最も適切な形成プロトコルを選択できます。スフェロイドの生存率と酸素化の研究は、がんおよび幹細胞由来のスフェロイドの研究に関連しているため、提示されたプロトコルには、これらのモデルを使用したNAD(P)H-FLIMおよびFAD-FLIMの例と予想される典型的な結果も含まれています。提示されたイメージングおよび分析パイプラインは、最も一般的な時間相関のある単一光子計数ベースのFLIM顕微鏡プラットフォームを対象としています。

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プロトコル

1. 多細胞スフェロイドの作製

  1. 細胞培養





















































    12. figure-protocol-1


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結果

適切なスフェロイド形成法の選択
選択したスフェロイド形成法は、スフェロイドのサイズ、形状、細胞密度、生存率、および薬剤感受性に大きく影響します(図2)。以前は、複数のハイスループット(SphericalPlate 5D、ラボ製マイクロモールド、およびMicroTissueモールド)と「中スループット」の低アタッチメント(BiofloatおよびLipidureコーティングされた96ウェルプレート)法の効果が、スフェロイドの生存率と酸素化について比較されていました29。

ここでは、形成方法が異なれば、初期濃度が500細胞/スフェロイドという同じでも、サイズが異なるスフェロイドが得られます。 低付着の 96 ウェルプレートで形成された HCT116 スフェロイドは、形成から 5 日後には、ハイスループット法と比較して有意に大きかったです(図 2 およ...

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ディスカッション

多細胞スフェロイドは、腫瘍および幹細胞ニッチ微小環境の研究、創薬、およびバイオファブリケーションのための「組織ビルディングブロック」の開発において選択される方法になりつつあります。スフェロイドの不均一な内部構造、栄養素の勾配、および酸素化は、比較的単純化されたアクセス可能な環境で、in vivo組織や腫瘍のそれらを模倣することができます。方法論の透明性26,28および標準化71の必要性により、これらのプロトコルは、研究者がライブ定量的蛍光寿命イメージング顕微鏡実験に最適なスフェロイド形成方法を選択するのに役立つと期待されている。提示された方法は、細胞染色ナノ粒子センサーと内因性細胞自家蛍光を利用しており、細胞死の染色と容易に組み合わせることができます。

最も重要なステップは、スフェロイド形成プロトコルです。したがって、ハイスループットのアガロースベースの方法では、培養培地のアガロース型を十分に平衡化す...

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開示事項

開示するものはありません。

謝辞

この研究は、ゲント大学の特別研究基金(BOF)助成金(BOF/STA/202009/003;BOF/IOP/2022/058)、フランダース研究財団(FWO、I001922N)、欧州連合、fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン-EDTAGibco25300-054シグマからも入手可能
10 mL 血清ピペットVWR612-3700同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
12ウェル細胞培養プレート、滅菌Greiner bio-one665-180同様の製品は、Sarstedt、Corning、その他の企業からも入手可能です。
12ウェルチャンバースライド、取り外し可能なIbidi81201Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientificなどからも入手可能
15mL遠心分離管Nerbe plus02-502-3001同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRなどの企業からも入手可能
3DペトリディッシュマイクロモールドマイクロティッシュZ764000-6EA
6ウェル細胞培養プレート、滅菌Greinerbio-one657160同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
70% エタノールChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400スフェロイド形成のための市販のコーティングされた96ウェルプレート
Calcein Green-AMTebubioAS-89201希釈1:1000
CellSens Dimensionソフトウェアで適用オリンパスの版3
人間の胎盤からのコラーゲン、タイプIVシグマC55330.07 mg/mLのコラーゲンおよび0.03 mg/mLのPoly-D-lysineのコーティングされた顕微鏡皿の調製のため
共焦点FLIMの顕微鏡Leica MicrosystemsN/AStellaris 8 Falconの白い光レーザー、HyD Xの検出器、気候/T制御室(OkoLab)、25x/0.95 Wの目的
D(+)-グルコースメルク8342イメージング培地(最終濃度10 mM)
ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、フェノールレッド、グルコース、ピルビン酸およびグルタミンフリーのSigma-AldrichD5030-10X1Lイメージング培地調製用
シ胎児血清 (FBS)Gibco10270-098シグマからも入手可能です。使用前に熱不活化する必要があります。
HEPES (1M)Gibco15630-080希釈 1/100 イメージング培地調製用 (最終濃度 10 mM)
ヒト結腸がん細胞 HCT116ATCC
ImageJNIHversion 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)Leica Microsystemsversion 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A、1 mMピルビン酸ナトリウムと10 mM HEPESVWR392-0420HCT116細胞の標準増殖培地
マイクロパターン化された3DプリントPDMSスタンプN/AN/Aシステム技術センター提供、ゲント大学
NaClChemlab教授ヤン・ヴァンフレテレン教授CL00.1429.100
ノイバウアーカッティングチャンバーフィッシャーサイエンティフィック15980396
O2プローブ: MMIR1該当なし該当なし 完全な特性評価、検証、および一部のアプリケーションは、以下で見つけることができます: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSフィッシャーサイエンティフィックGibco18912014PBS錠剤を500mLの蒸留水に溶解します。
連鎖球菌連鎖球菌:P (10,000 U/mL) / ストレプトマイシン (10,000 μg/mL) 100倍溶液Gibco15140-122シグマからも入手可能です。1:100に希釈して塗布します。
ポリ-D-リジンシグマP6407-5mg0.07 mg/mLコラーゲンおよび0.03 mg/mLポリ-D-リジンコーティング顕微鏡ディッシュの調製には
ヨウ化プロピジウムシグマ-アルドリッチ25535-16-4細胞死染色、1 & マイクロ;1時間インキュベーション
PVDFシリンジフィルター0.22 µでのg / mL;mNovolabA35149同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の企業からも入手可能
ビン酸ナトリウム (100 mM)Gibco11360-070希釈 1/100 イメージング媒体の調製用(最終濃度 1mM)
球面プレート 5D 24 ウェルクーゲルマイヤーズ SP5D-24W
滅菌ペトリディッシュグライナー バイオワン633181同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
組織培養フラスコ (25 cm² )VWR734-2311同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
です 組織培養フラスコ(75 cm²)VWR734-2313同様の製品は、Sarstedt、Corning、VWRおよび他の会社からも入手可能
Uボトム96ウェルプレートVWR10062-900同様の製品は、Sarstedt、Corning、Greiner Bio-oneおよび他の会社からも入手可能
Ultrapure AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500アガロース低融点(A-9414、シグマ)、ルーチン使用のためのアガロース(A-9539、シグマ)
広視野蛍光倒立顕微鏡リンパスN / A倒立蛍光顕微鏡IX81、電動Z軸制御、CoolLED pE4000(16チャンネル、365-770 nm)、ORCA-Flash4.0LT(浜松)cMOSカメラ、ガラス温暖プレートOkolab、CellSens Dimension v.3ソフトウェアおよび空気対物レンズ4x/0.13 UPlanFLNおよび40x/0.6 LUCPlanFLN。(オプション、高解像度イメージング用) 60x/1.0 LUMPLFLN 水
です です です ウ マイクロ、です ピルです です です オ

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