このプロトコルは、成体のSprague Dawleyラットから摘出された後根神経節(DRG)をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し、培養する技術を提供します。
この記事について
サマリー
要約
疼痛の最も一般的な末梢神経細胞の特徴は、刺激閾値の低下または後根神経節(DRG)からの末端神経の過敏症です。この過敏症の原因として提案されているのは、末梢組織の免疫細胞とニューロンとの相互作用に関連しています。 In vitro モデルは、これらのメカニズムが侵害受容器過敏症を引き起こす方法を理解するための基礎知識を提供してきました。しかし、 in vitro モデルは、有効性をヒトに翻訳するという課題に直面しています。この課題に対処するために、生理学的および解剖学的に関連する in vitro モデルが開発され、48ウェルプレートの3つの隔離されたコンパートメントで無傷の後根神経節(DRG)を培養しました。一次DRGは、人道的安楽死後に成体のSprague Dawleyラットから採取されます。余分な神経根をトリミングし、DRGを培養に適したサイズにカットします。その後、DRGは天然のハイドロゲルで増殖し、すべてのコンパートメントでしっかりとした増殖を可能にします。このマルチコンパートメントシステムは、神経突起からのDRG細胞体の解剖学的に関連性のある単離、生理学的に関連する細胞タイプ、および神経細胞と免疫細胞の間の相互作用を研究するための機械的特性を提供します。したがって、この培養プラットフォームは、治療の分離戦略を調査するための貴重なツールを提供し、最終的には疼痛を予測するためのスクリーニングアプローチの改善につながります。
概要
慢性疼痛は、世界的に障害と失業の主な原因です1。慢性疼痛は、世界の成人の約20%が罹患しており、社会的および経済的に大きな負担を強いており2、米国では毎年5,600億ドルから6,350億ドルの総費用が見積もられています3。
慢性疼痛患者が示す主な末梢の特徴は、神経の刺激閾値の低下であり、これにより神経系が刺激に対してより敏感になります4,5。刺激の閾値が低下すると、以前は痛みを伴わなかった刺激に対する痛みを伴う反応(異痛症)や、痛みを伴う刺激に対する反応の増加(痛覚過敏)が生じる可能性があります6。現在の慢性疼痛治療薬の有効性は限られており、動物モデルで成功した治療法は、疼痛発現のメカニズムの違いにより、ヒトでの試験で失敗することがよくあります7。末梢感作メカニズムをより正確に模倣できるin vitroモデルは、新しい治療法の翻訳を増加させる可能性を秘めています8,9。さらに、培養システムにおける感作神経の重要な側面をモデル化することにより、研究者は閾値の低下を引き起こすメカニズムについてより深い理解を深め、それらを逆転させる新しい治療標的を特定することができます10。
理想的な in vitro プラットフォームまたは微生物学的システムは、遠位神経突起と後根神経節(DRG)細胞体の物理的分離、三次元(3D)細胞環境、 およびin vivo 条件を厳密に模倣する天然支持細胞の存在を組み込むことです。しかし、Caparasoらによる最近の論文11 では、現在のDRG培養プラットフォームにはこれらの主要な特徴が1つ以上欠けており、 in vivo 条件の再現には不十分であることが示されています。これらのプラットフォームは簡単にセットアップできますが、末梢感作の生物学的基盤を模倣していないため、 in vivo での有効性に変換されない可能性があります。この制限に対処するために、神経突起およびDRG細胞体の時間的流体分離を可能にするために、3つの隔離されたコンパートメントを有するヒドロゲルマトリックス内の後根神経節(DRG)の培養のために、生理学的に関連性のある in vitro モデルが開発された11。このモデルは、生理学的および解剖学的関連性の両方を提供し、 in vitroでニューロンの末梢感作を研究する可能性があります。
3D培養におけるDRG外植片の使用に対する関心の高まりは、DRG生存率の間接的な指標として機能する堅牢な神経突起成長を促進する能力によるものです12。初代新生児または胚性DRG外植片は、主に現在のin vitro培養プラットフォーム13,14で使用されていますが、成体げっ歯類からの外植片を使用すると、成熟したニューロン生理学のより良いモデルが提供され、新生児または胚性げっ歯類15からの外植片と比較して、ヒトのDRG生理学に密接に模倣されます。外植片DRGとは、主に天然の非ニューロン支持細胞を維持することにより、天然のDRG組織の細胞および分子組織の保存を指します。ここでは、このプロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRG外植片をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫および培養する方法を説明します(図1)。
頸椎、胸椎、腰椎からのDRGの培養では、神経突起の成長に観察可能な違いが見られず、有効性が示されています。このアプリケーションの目的は、デバイスの外側のコンパートメントに神経突起の成長を引き出すことでした。したがって、この記事ではDRGレベルを区別しませんでした。ただし、特定の実験に必要な場合は、実験者のニーズに合わせてDRGレベルを調整できます。現在、DRGの3D培養16には他のコンパートメント化された培養モデルがありますが、これらのデバイスには保存された天然の非ニューロン支持細胞が含まれていないため、翻訳が制限される可能性があります。採取したDRGの天然構造を維持することは、非ニューロン支持細胞の保持を確実にするため、重要です。これは、DRGニューロンとの相互作用がこれらのニューロンの機能特性を維持するために不可欠であるためです。いくつかの研究では、ニューロンの髄鞘形成を促進するために、解離したDRGをシュワン細胞などの非天然ニューロン細胞と共培養しました17,18,19。
プロトコル
DRGの収穫は、ネブラスカ大学リンカーン校の動物管理・使用委員会(IACUC)に準拠して行われました。この研究には、12週齢の雌Sprague Dawleyラット(~250 g)を使用しました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1.マルチコンパートメントデバイスの製造と組み立て
- マルチコンパートメントデバイスのコンピューター支援設計と3Dプリンティング
注:MCデバイスは、DRG細胞体と神経突起を単離するための3つのコンパートメントで構成されています(図2A)。MCデバイスは市販されていません。ただし、STLファイル(Supplementary Coding File 1)は、3Dプリンティングを可能にするためにここに提供されています。MCの印刷は完了するまでに1日かかります。 - MCのSTLファイルを対応ソフトウェアを使用してResin 3Dプリンタにアップロードします。
注:印刷に最適な材料は高温樹脂です。高温樹脂を使用する主な利点は、生体適合性があり、オートクレーブして再利用できることです。デジタル光処理(DLP)3Dプリンターまたはその他の3Dプリンターを使用してデバイスを印刷することもできます。 - プリントしたデバイスをイソプロパノール(>96%)の洗浄液に30分間移し、プリントしたMCデバイスの表面に残った樹脂を取り除きます。
- 市販の硬化剤を使用して、デバイスを80°Cで120分間二次硬化させます( 材料の表を参照)。硬化剤は、印刷されたMCデバイスを温度とUVにさらすことにより、印刷されたMCデバイスの機械的特性を向上させます。
- MCデバイスを160°Cのオーブンで180分間熱硬化させます。
- オートクレーブを使用して、重力サイクルで45分間デバイスを滅菌します。
2.ハイドロゲル製剤
- メタクリル化ヒアルロン酸(MAHA、85%-115%メタクリル化)を合成し、Seidlitsらによって記述されたプロトコルを使用して特性評価します20。
注:DRGの増殖をサポートするために、メタクリル化ヒアルロン酸、I型コラーゲン、およびラミニンで構成されるトリプルハイドロゲルが一般的に使用されます。調査結果は、DRGが一般的にMAHAで増殖し、1.25〜2.5 mg / mLの範囲で、コラーゲンが2.0〜4.5 mg / mLであることを示しています。ラミニンについては、0.75mg/mLあればDRGの頑健な増殖を確実にするのに十分であることが見出される。ヒドロゲルの調製は、無菌ワークスペースを提供するために層流キャビネットで行う必要があります。
3. 光開始剤溶液の調製
注:UV光の下でMAHAを架橋するには、光開始剤が必要です。一般的には0.3%から0.6%の割合で使用されています。
- DRG収穫の3日前に光開始剤溶液を準備します。
- 光開始剤溶液を調製する前に、超音波処理水浴を37°Cに予熱します。
- フローフードで滅菌技術を使用して、NaHCO 3を5x Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)-HEPES溶液にNaHCO3を溶解することにより、23.125 mg / mL重炭酸ナトリウム(NaHCO3)溶液を調製します。
- ガラスバイアルで、0.6%重量/体積(w / v)光開始剤を20%vol / vol 1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)および80%vol / vol 5X DMEM / HEPES溶液に混合します。
- 光から保護するために、ガラスバイアルをアルミホイルで包みます。ただし、バイアルを37°Cに加熱した超音波処理水浴に移し、30〜40分間の超音波処理を行う前に、必ずアルミホイルを取り外してください。
注:光開始剤溶液は、光にさらされるとラジカルに分解され、重合プロセスを開始する可能性があるため、光から保護する必要があります21。 - 0.22 μmシリンジフィルターで溶液を滅菌ろ過し、新しい滅菌ガラスバイアルに入れます。
4. メタクリル化ヒアルロン酸溶解
- メタクリル化ヒアルロン酸(ステップ2で調製)を、光開始剤溶液を調製する(ステップ3)同じ日に溶解します。
- 凍結乾燥したMAHAをデシケーターに15分間入れて室温に戻します。
- 層流フードで作業し、滅菌計量技術を使用して、凍結乾燥されたMAHAをガラスバイアルで計量します。
- 必要な量のろ過された光開始剤溶液をMAHAに加えて、目的のMAHA濃度にします。一般的な最終ゲル濃度は、1.25 mg/mL MAHAおよび4.5 mg/mLコラーゲンです。
- キャップを実験室用シーリングフィルムで密封し、ガラスバイアルをアルミホイルで包み、室温でオービタルシェーカープレートに完全に溶解するまで(通常は3日間)置きます。時々、MAHAの均一な溶解を確保するために、MAHAの大きな塊をバラバラにするために溶液をボルテックスします。
5. デバイスの組み立て
- DRG収穫の前日にMCデバイスを48ウェルプレートに入れます。
- 3mLシリンジを使用して、MCデバイス(図2B)の下の溝にシリコーンゲルの細い線を塗布します。これにより、デバイスをウェルプレートにしっかりと取り付けることができます。
- #3鉗子を使用して、 図2Cに示すように、MCデバイスを48ウェルプレートのウェルに静かに置きます。
注意: デバイスのサイズは、目的の用途に合わせて変更でき、必要に応じて異なるサイズのプレートを使用できます。デバイスは再利用できます。再利用するには、ヒドロゲルをすべてのトンネルから穏やかに洗い流し、装置の下のローディング溝を70%エタノールで穏やかに攪拌して使用する必要があります。これが完了したら、使用前にデバイスを再オートクレーブして滅菌することができます。
6. 動物の調理
- 収穫開始前に、必要なすべての解剖ツールをオートクレーブします。
- 12〜20週齢の成体の雄または雌のSprague Dawleyラットを入手します。ラットの性別はDRGの成長に影響を与えません。
- 承認された IACUC プロトコルに従って、CO2 の過剰摂取を安楽死の主要な方法として使用し、両側気胸穿刺を安楽死の二次的な方法として使用して、ラットを安楽死させます 米国獣医師会ガイドライン22.
- 腹側を下にして、解剖台の滅菌アンダーパッドにラットを置きます。70%エタノールで毛皮をスプレーします。
7.背根神経節(DRG)の収穫
- 86%ニューロベースA培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)、1%グルタミン、2%B27、50xを含むトリミング培地を調製し、24ウェルプレートに移します。この培地とウェルプレートは、収穫されたDRGをヒドロゲルに埋め込む前に一時的に保管するために使用されます。
- 白衣、サージカルマスク、ボンネット、安全メガネ、手袋を着用してください。
- 大きな鈍い鼻のはさみを使用して、頸椎の付け根の皮膚を切り取り、次に背骨の長さを下ります。
- 脊柱管から血液をさらに排出するには、肩甲骨の下を切って筋肉を下方向に切り込み、主要な血管を切断します。
- 大きくて鋭い鼻のはさみを使用して、背骨から筋肉を切り取ります。背骨を視覚化するために、できるだけ多くの筋肉をクリアにします。
- 椎骨の背側と外側のセグメントを取り除きます。まっすぐなロンガーと鋭い鼻のはさみを使用して、頸部の端から腰椎の端に向かって移動する椎骨の棘状および横方向の突起を取り除きます。
- 脊髄を切除します。小さな鋭利な鼻のはさみを使用して、脊髄の両側に沿ってDRGに接続されている神経根を慎重に切り抜きます。脊髄の頸部を切断し、脊柱管から慎重に持ち上げて、DRGに接続されている残りの神経根を切り取ります。
注:細かい運動能力は、DRG本体がプロセスで切断されないようにするために不可欠です。 - DRGを露出させるには、湾曲したロンガーを使用して、椎骨の外側部分をさらに除去します。正中線から外側に、交互に引きます。DRG本体を切断すると、細胞体や軸索に損傷を与える可能性があるため、切断しないように注意してください。
- #3鉗子と直定規スプリングハサミを使用して、椎骨の各レベルの間にあるDRGを取り除きます。DRGから脊髄神経根をつかみ、ポケットから慎重に引き出し、脊髄神経のもう一方の端を切り抜きます。DRG本体を直接つかまないように注意してください。
- DRGを氷上の24ウェルプレート(トリミング媒体を含む、ステップ7.1)のウェルに入れます。
- すべてのDRGを収集した後、ワークスペースをクリーンアップし、死体をオートクレーブバッグに入れ、IACUCプロトコルに従って適切に保管/廃棄します。
8.DRGのトリミングと切断
- 清潔なベンチに60mmのシャーレにトリミングメディアを充填します(ステップ7.1)。解剖スコープとガラスビーズ滅菌器を設置し、トリミングツール(#3鉗子とストレートエッジスプリングハサミ)を備えたオートクレーブツールボックスをスコープのそばに置きます。
- 解剖スコープの下で、DRGの周りの余分な組織を取り除き、DRG本体に近い神経根をトリミングします(通常は周囲の神経よりもわずかに暗い)。
- 2番目の60mmシャーレに新しいメディアを入れます。解剖スコープの下で、トリミングされたDRGを約0.5 mm(または0.5 mmから0.8 mm)に切断します。切断中に定規をペトリ皿の下に配置して、切断されたDRGの推定サイズを正しく設定します。
- カットしたDRGを新しい24ウェルプレートに移し、培地を氷上に置きます。
注:DRGのトリミング、切断、および埋め込みは、無菌ワークスペースを提供するために、層流キャビネットで行う必要があります。層流キャビネットがない場合は、最小限の適切な個人用保護具(PPE)(白衣、マスク、ゴーグル、手袋)を推奨し、潜在的な汚染を軽減するためにプロセス全体ですべてのツールを滅菌して、無菌技術を遵守する必要があります。
9.コラーゲンの中和
- DRGをトリミングしてカットした後、DRGの収穫と同じ日にコラーゲンを中和します。
- 氷上での作業では、~8.16 % の超純水、~1.84% の 1 M 水酸化ナトリウム (NaOH)、~10% の 10x PBS、および溶液の総量の ~80% のコラーゲンをガラス バイアルにピペットで入れます。
- 滅菌済みの低保持ピペットチップを使用してゆっくりと混合し、コラーゲン(通常は最後に加える)を混合物にピペットで入れます。混合中は、気泡が発生しないように、ピペットチップを溶液に入れたままにしてください。pHストリップを使用して中和されたコラーゲンのpHが~7であることを確認します。
注:中和されたコラーゲンは、ゲル化せずに2〜3時間氷上に保持できます。したがって、ハイドロゲルの作製は、コラーゲンが中和されたら迅速に行う必要があります。
10.ハイドロゲル製造
- 氷上での作業を行い、ラミニン(最終濃度0.75 mg / mLまで)と1x PBSをガラスバイアルにピペットで入れます。
- 滅菌済みの低保持ピペットチップを使用して、コラーゲンとMAHA溶液をピペットで中和し、混合物にピペットで入れて、目的の濃度に到達します。
- ゆっくりと混合し、得られたヒドロゲルのpH(~7)を確認します。
11. DRGの埋め込み
- マルチコンパートメント埋め込みを実行します。
- プレミックスされたヒドロゲル65.1μLおよび52.8μLをそれぞれ体細胞および神経突起コンパートメントにピペットで入れます。
注:これは、48ウェルプレートでMCデバイスを使用することを前提としています。これらのボリュームは、使用する MC デバイスのサイズに基づいて変更できます。 - カットしたDRGをソーマコンパートメント(図2A)にそっと埋め込み、ウェルプレートの底に傷がつかないようにします。DRGを中央に配置して、神経突起がトンネルを通って隣接するコンパートメントに成長できるようにします。
- インキュベーター内のハイドロゲルを37°Cで30分間サーマルクロスリンクします。これが発生する間、UVランプをオンにしてウォームアップします。
- 熱架橋後、ヒドロゲルを90秒間UV架橋します。
- ハイドロゲルとDRGにDRG増殖培地を添加し、1時間後に全面的な培地交換を行い、培地に残留する未反応または残存する光開始剤の痕跡を除去します。
- 3日ごとに半量の交換を行い、顕微鏡で観察してDRGの成長を監視します。
- ~4週間後、DRG神経突起が成長し始めたら(図3A)、蛍光プレートイメージャーで画像をキャプチャし、FIJIを使用して神経突起の長さを定量化します(ImageJ)。
- プレミックスされたヒドロゲル65.1μLおよび52.8μLをそれぞれ体細胞および神経突起コンパートメントにピペットで入れます。
12. DRGの埋め込みを制御する
- 250 μL のハイドロゲルを 48 ウェルプレートに入れてピペットで取ります (MC なし)。
- カットしたDRGをウェルの中央とハイドロゲルの半分にそっと置き、ウェルプレートの底を傷つけないようにします。
- インキュベーター内のハイドロゲルを37°Cで30分間サーマルクロスリンクします。
- ハイドロゲルを90秒間UV架橋します。
- DRG増殖培地をハイドロゲルとDRGに加え、1時間後に完全な培地交換を行います。
- 3日ごとに半量のメディア交換を行い、DRGを顕微鏡で観察してDRGの成長を監視します。
- ~4週間後、DRG神経突起が成長し始めたら(図3B)、蛍光プレートイメージャーで画像を撮影します。
注:どの明視野顕微鏡でもイメージングに使用できます。自動化されたプレートベースの顕微鏡は、このプロセスを迅速化します。デバイスを使用せずにプレーンゲルに制御包埋することは、マルチコンパートメントでのDRG神経突起の成長を比較するために行われます。DRGがMCゲルとコントロールゲルで同様に増殖することをユーザーが確認すれば、毎回コントロールゲルを繰り返す必要がなくなるかもしれません。
13. DRGイメージング
- 蛍光プレートイメージャーを使用して、さまざまな焦点距離で4倍の倍率で明視野画像をキャプチャし、DRGおよびMCデバイス全体を視覚化します。
- 画像の明るさとコントラストを調整して、神経突起が見やすくします。
- 画像を.tiffファイルとして保存します。
14. DRG神経突起の定量化
- FIJI(ImageJ)をダウンロードしてインストールします。
- ImageJを開きます。画像ファイルを開き、ファイルがモノクロであることを確認します。
- コントラストを強めて、最小の神経突起が見えるようにします。これを行うには、ショートカット Ctrl + Shift + Cを使用して明るさとコントラストのオプションを開きます。
- 必要に応じてコントローラーのスライダーを調整して神経突起を視覚化し、[ 適用 ]をクリックして目的の明るさとコントラストにします。
- Neurite Tracer を開くには、 Plugins メニューを開き、 Segmentation を選択して Simple Neurite Tracer をクリックします。
- 新しいトレースを開始するには、神経突起の一方の端をDRG本体のすぐ近くでクリックします。
- 神経突起に沿った別のポイントをクリックして、神経突起が端から端までトレースされるまでトレースを追加します。神経突起をトレースした後、 パスを終了 をクリックします。
- トレースした長さを実際の単位に変換し、結果をコピーしてExcelに貼り付けて保存します。
- FIJIの直線ツールを使用して、スケールバーと同じ長さの線を描き(線の端を離さないでください)、ツールバーの下に表示される長さの値を確認します。長さの値は変換に使用されます。
- 図 4 に示すように、DRG の両側から伸びる 6 つの長い神経突起の長さを測定し (図 3C、D)、これらの神経突起の平均長さを計算して、DRG の代表的な平均長さを求めます。
注:免疫染色は、非ニューロン支持細胞の存在を示すために、プレーンゲル中のDRG外植片で試験されています7。DRGを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に室温で固定し、1x PBSで15分間3回洗浄し、免疫染色するまで1x PBSで4°Cで保存します。 - MCデバイスの外植片の場合は、MCデバイスを取り外し、上記7と同じプロセスに従います。
結果
本プロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRGをマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し培養する技術を記載しています。 図1に示すように、 成体ラットから採取したDRGをトリミングし、~0.5mmにカットしました。次に、トリミングおよび切断したDRGをMCデバイスの体細胞領域のハイドロゲルに包埋し(図2)、神経突起定量化の前に27日間培養しました。DRGは、コントロールとして機能するためにプレーンゲルで培養されました。この実験に使用したヒドロゲル製剤の濃度は、4.5/1.25 mg/mL コラーゲン:MAHAでした。マルチコンパートメントゲルとプレーンゲルのそれぞれ27日目と21日目に、神経突起の堅調な成長が見られました(図3)。MC中の神経突起の平均長(894.22μm±308.75μm)は、対照プレーンゲルの神経突起長(864.26μm±362.84μm)と同等でした(図4)。これは、MCデバイスがDRGの培養と神経突起の成長をサポートする能力を示しています。神経突起の長さは、ImageJソフトウェアを使用して定量化しました。
図1:実験手順を示す概略図(A)成体Sprague Dawleyラットからの背根神経節(DRG)の収穫。(B)収穫されたDRGのトリミングと切断。(C)ヒドロゲル製剤、DRG包埋、および48ウェルプレートに装着したMC内のハイドロゲルでの培養。(D)培養21〜30日後のDRG神経突起の成長。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3つの分離コンパートメントを備えたプリントされたマルチコンパートメントで、48ウェルプレートで使用できます。 (A)プリントされたMCデバイスの上面図を示す代表的な画像は、DRGおよび神経突起コンパートメント(赤い線)とDRG埋め込み領域(緑)を示しています。(B)MCの側面図(C)48ウェルプレートに装着したMCの画像。スケールバー = 10 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マルチコンパートメント(MC)デバイスにおける神経突起の増殖、およびプレーンゲルの制御。 (A)明視野中のマルチコンパートメント(MC)デバイスにおける神経突起の成長の追跡を示す代表的な画像。(下図)三菱商事のトンネルを通って成長した神経突起は矢印で示されています。(B)コントロールプレーンゲル(MCなし)の神経突起成長の画像。(C)コントロールプレーンゲル(紫色の線)の12本の長い神経突起の神経突起トレースを示す代表的な画像。DRGの両側にある6つの長い神経突起を定量化して、平均神経突起の長さを求めました。画像は蛍光プレートイメージャーで4倍の倍率で撮影し、神経突起はFIJI(ImageJ)を使用して定量化しました。スケールバー = 1000 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マルチコンパートメント(MC)の神経突起の長さとプレーンゲル(PG)の神経突起の長さの比較。 個々の神経突起の長さと、エラーバーで表される平均と標準偏差を示す散布図。MCの平均神経突起長は、プレーンゲルの864.26μm±362.84μm(平均±±SD±1204.40μm690.43μm)であり、MCが神経突起の成長をサポートしていることを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Supplementary Coding File 1: コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して生成されたマルチコンパートメント(MC)デバイスのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
このプロトコルは、成虫のSprague Dawley DRGを収穫し、それらを3D天然ハイドロゲルで培養する方法を概説しています。この方法とは対照的に、マウスやラットからDRGを採取する他のアプローチでは、脊柱を分離します。切除された脊柱は半分になり、脊髄はDRGs23,24,25を露出させるために取り除かれます。脊髄の損傷は血液供給を制限し、DRGと内部ニューロンに影響を及ぼします26。これにより、DRGの活性が低下し、外科的アプローチがより適切になります。さらに、DRGの生理学的に関連性のある培養を可能にする堅牢なMCデバイスを3Dプリントする方法が概説されています。
このプロトコルは、解剖学的および生理学的に関連するモデルでニューロンの末梢感作を研究することを強調して、 in vitroでDRGを培養する方法を概説しています。この培養法は、3D環境下で遠位神経突起とDRG細胞体を物理的に分離することができます。MCデバイスは、細胞を含むDRG外植片が保存され、天然のグリア細胞と共培養できるため、 in vivo 環境を模倣しています。DRG外植片には非天然の神経細胞が含まれており、他の細胞と共培養して生理学的条件を模倣することができます。この生理学的関連性は、非ニューロン細胞が神経突起活性をどのように調節するかについての研究を促進し、侵害受容に関与する基本的なメカニズムの理解に役立ちます。これらの非ニューロン相互作用を組み込むことで、解離したDRGを用いた単純化された培養モデルと比較して、細胞シグナル伝達の結果をより正確に予測できるはずです。2つの神経突起コンパートメントの存在は、単一のDRGが in vivoで異なる組織を神経支配するため、生理学的関連性を最大化します。この設計により、一方の神経突起コンパートメントの治療が可能になり、もう一方のコンパートメントがコントロールとして機能します。単一の体細胞に接続された制御コンパートメントと治療コンパートメントは、クロスコンパートメント効果の研究に使用でき、神経突起が単一の体細胞から伸び、異なる組織を神経支配するときに異なる刺激を経験する in vivo 条件を模倣し、神経突起間のクロストークに関する洞察を提供します。隣接するコンパートメントの神経突起間でクロストークが発生した場合、未処理のDRGが真のコントロールとして機能する可能性があります。
このデバイスは、治療の分離や、痛みの文脈でのニューロンとDRGの間の相互作用の研究に使用できます。遠位神経突起はDRG体細胞および近位神経突起とは別に選択的に治療できるため、このシステムは、末梢感覚ニューロンの末端を直接治療する標的関節治療などの末梢治療に使用できます。
MCデバイスの主な利点は、MCデバイスが48ウェルプレートに収まるように設計されているため、同じプレートの複数のウェルでハイスループットな実験ができることです。 in vitro プラットフォームの追加の利点は、コラーゲンとMAHAの濃度を調整してさまざまな組織微小環境の特性を模倣することにより、MC内のハイドロゲルの剛性を変更できることです。このプロトコルの潜在的な制限の1つは、神経突起とDRG体細胞コンパートメントとの間の流体分離は、培地交換のない72時間を超える培養には理想的ではないということです。以前の研究では、流体の分離が最大72時間コンパートメントで維持され、メディア交換なしであることが確認されました11。先行研究は、ヒアルロン酸濃度を増加させることがコラーゲン架橋密度を有意に増加させ、したがってハイドロゲルマトリックス27を横切る高分子の拡散性を制限することを示している。したがって、72時間を超える培養物の流体分離を改善するために、MAHAの濃度を上げることができます。これは、Caparasoらの研究で示されているように7、MAHAの増加により流体分離が改善されました。コントロールエンベッディングは、MCおよびプレーンゲル中のDRG神経突起の同等の成長を確保するために行われます。これは、MCがDRGの成長に影響を与えないようにするためです。MC での DRG の成長が検証されたら、すべての実験で制御埋め込みを繰り返すことはお勧めしません。
著者たちは、ヒトのDRGはラットのDRGと比較して、より大きく、より多くの細胞を含み、ニューロンサブタイプの割合が異なることを認めている28。げっ歯類の DRG の使用は、臨床への翻訳に関してこの研究の制限です。しかし、このシステムは、ニューロンの興奮性に影響を与える化合物を特定するためのスクリーニングプラットフォームとして価値がある可能性があります。げっ歯類とヒトのDRGとの間には組成上の違いがあるが、ラットとヒトのDRG29の間にはプロテオーム内でも高い重複がある。このプロテオームの重複、および同じニューロンサブタイプの存在は、ラットDRGを高レベルで治療薬のスクリーニングに使用でき、ラットDRGの変化がメカニズム的にヒトDRGに変換されるかどうかを調べるためにさらなる試験を実施できることを示唆しています。
このプラットフォームは、標的薬理学的刺激と、時間制御によるニューロンまたは細胞体の研究を可能にします。ニューロンの興奮性と信号伝達の変化は、神経突起またはDRGを操作することで簡単に測定できます。外植片DRGを含むプレーンコントロールハイドロゲルのカルシウムイメージングを使用してニューロンの興奮性を評価する能力が実証されています7。同様の方法をMCデバイスにおいて採用して、ニューロンの興奮性を評価することができる。
この方法は、椎間板性腰痛など、末梢一次感覚ニューロンの刺激が推進要因となるさまざまな疼痛状態の研究に使用できます。侵害受容器過敏症のスクリーニングは、過興奮性を軽減する新薬を発見するための有望なツールになる可能性があります。過興奮性の低下は、臨床的に痛みの軽減につながる可能性があります。このプラットフォームは、ハイスループット医薬品をスクリーニングし、疼痛様挙動アッセイを用いた in vivo バリデーションに最も有効な候補を同定することができます。
開示事項
この研究の著者は、利益相反がないことを宣言します。
謝辞
この研究は、NSF Grant (2152065) と NSF CAREER Award (1846857) の支援を受けました。著者は、このプロトコルに貢献してくれたWachs Labの現在および過去のメンバー全員に感謝します。 図1 の図はBiorenderで作成されています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11252-00 | DRG |
| 10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
| 1x PBS (オートクレーブ) | ラボ | 7.3 - 7.5 pH | |
| 24 ウェルプレート | VWR | 82050-892 | 収穫して切断した DRG |
| 3 mL シリンジ滅菌、シングルユース | BD | 309657 | |
| 48ウェルプレート | Greiner Bio-One | 677180 | |
| 60 mm ペトリ皿 | フィッシャーサイエンティフィック | FB0875713A | トリミングと切断のためのメディアを保持するため |
| アルミホイル | フィッシャーブランド | 01-213-104 | |
| B27 プラス 50x | サーモフィッシャー | 17504044 | DRGメディア用 |
| コラーゲン I 型 | イビディ | 50205 | |
| 湾曲カップ フリードマン ピアソン ロンガー | ファイン サイエンス ツール | 16221-14 | 解剖用 |
| デュモン #3 鉗子 | ファイン サイエンス ツール | 11293-00 | 解剖用 |
| ウシ胎児血清 (FBS) | サーモフィッシャー | 16000044 | DRG メディア用 |
| フォーム硬化型 | フォーム ラボ | 硬化剤 | |
| フォーム ウォッシュ | フォーム ラボ | MC から余分な樹脂を洗い流すには | |
| ガラスビーズ滅菌器 | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| ガラスバイアル (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | DRG メディア |
| HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
| 高温 V2 樹脂 | FormLabs | FLHTAM02 | |
| ヒアルロン酸ナトリウム塩 | MilliporeSigma | 53747 | MAHA |
| Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
| Laminin | R& の製造に使用Dシステム | 344600501 | |
| 大型鈍鼻ハサミ | Militex | EG5-26 | 解剖用 |
| 大型鉗子(鋸歯状の先端) | Militex | 9538797 | 解剖用 |
| 大型鋭鼻ハサミ | ファインサイエンスツール | 14010-15 | 解剖用 |
| ローリテンションピペットチップ | フィッシャーサイエンティフィック | 02-707-017 | コラーゲンとピペッティング用MAHA |
| メタクリル化ヒアルロン酸(MAHA) | ラボで調製 | N / A | 85 - 115 % メタクリル化 |
| 神経成長因子(NGF) | R&Dシステム | 556-NG-100 | DRGメディア |
| 神経基礎Aメディア | サーモフィッシャー | 10888022 | DRGメディア用 |
| パラフィルム | Bemis | PM996 | |
| パラフィルム | Bemis | PM996 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) | EMD Millipore | 516106 | DRGメディア |
| 用pHテストストリップ | VWRインターナショナル | BDH35309.606 | |
| ピペットチップ(1000 & micro;L) | USA Scientific | 1111-2021 | |
| Preform 3.23.1 software | Formslab | STL ファイルをアップロードするには | |
| Rat | Charles River | ||
| Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
| Small sharp-nosed はさみ | Fine Science Tools | 14094-11 | 解剖用 |
| 重炭酸 | ナトリウムMilliporeSigma | S6014 | |
| ストレート カップ ロンゲール | ファイン サイエンス ツール | 16004-16 | 解剖用 |
| ストレート エッジ スプリング ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 15024-10 | 解剖用 |
| 外科用スカプレル ブレード (No. 10) | フィッシャー サイエンティフィック | 22-079-690 | |
| シリング フィルター、PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
| 小さなスプリングハサミ | World Precision Instruments | 14003 | トリミングと切断用 DRG |
| UVランプ | Analytik Jena US | フォトクロスリンクハイドロゲル (15 - 18 mW/cm2) |
参考文献
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
- Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
- Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
- Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
- Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
- Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
- Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
- Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
- F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
- Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
- Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
- Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
- Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
- Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
- Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
- Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
- Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
- Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
- Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
- Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
- Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
- Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).
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