末梢神経細胞の特徴を研究するためのマルチコンパートメントデバイスにおける後根神経節の採取、埋め込み、および培養

慢性疼痛は、世界的に障害と失業の主な原因です¹。慢性疼痛は、世界の成人の約20%が罹患しており、社会的および経済的に大きな負担を強いており²、米国では毎年5,600億ドルから6,350億ドルの総費用が見積もられています³。

慢性疼痛患者が示す主な末梢の特徴は、神経の刺激閾値の低下であり、これにより神経系が刺激に対してより敏感になります^4,5。刺激の閾値が低下すると、以前は痛みを伴わなかった刺激に対する痛みを伴う反応(異痛症)や、痛みを伴う刺激に対する反応の増加(痛覚過^敏)が生じる可能性があります6。現在の慢性疼痛治療薬の有効性は限られており、動物モデルで成功した治療法は、疼痛発現のメカニズムの違いにより、ヒトでの試験で失敗することがよくあります⁷。末梢感作メカニズムをより正確に模倣できるin vitroモデルは、新しい治療法の翻訳を増加させる可能性を秘めています^8,9。さらに、培養システムにおける感作神経の重要な側面をモデル化することにより、研究者は閾値の低下を引き起こすメカニズムについてより深い理解を深め、それらを逆転させる新しい治療標的を特定することができます¹⁰。

理想的な in vitro プラットフォームまたは微生物学的システムは、遠位神経突起と後根神経節(DRG)細胞体の物理的分離、三次元(3D)細胞環境、 およびin vivo 条件を厳密に模倣する天然支持細胞の存在を組み込むことです。しかし、Caparasoらによる最近の論文¹¹ では、現在のDRG培養プラットフォームにはこれらの主要な特徴が1つ以上欠けており、 in vivo 条件の再現には不十分であることが示されています。これらのプラットフォームは簡単にセットアップできますが、末梢感作の生物学的基盤を模倣していないため、 in vivo での有効性に変換されない可能性があります。この制限に対処するために、神経突起およびDRG細胞体の時間的流体分離を可能にするために、3つの隔離されたコンパートメントを有するヒドロゲルマトリックス内の後根神経節(DRG)の培養のために、生理学的に関連性のある in vitro モデルが開発された¹¹。このモデルは、生理学的および解剖学的関連性の両方を提供し、 in vitroでニューロンの末梢感作を研究する可能性があります。

3D培養におけるDRG外植片の使用に対する関心の高まりは、DRG生存率の間接的な指標として機能する堅牢な神経突起成長を促進する能力によるものです¹²。初代新生児または胚性DRG外植片は、主に現在のin vitro培養プラットフォーム^13,14で使用されていますが、成体げっ歯類からの外植片を使用すると、成熟したニューロン生理学のより良いモデルが提供され、新生児または胚性げっ歯類¹⁵からの外植片と比較して、ヒトのDRG生理学に密接に模倣されます。外植片DRGとは、主に天然の非ニューロン支持細胞を維持することにより、天然のDRG組織の細胞および分子組織の保存を指します。ここでは、このプロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRG外植片をマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫および培養する方法を説明します(図1)。

頸椎、胸椎、腰椎からのDRGの培養では、神経突起の成長に観察可能な違いが見られず、有効性が示されています。このアプリケーションの目的は、デバイスの外側のコンパートメントに神経突起の成長を引き出すことでした。したがって、この記事ではDRGレベルを区別しませんでした。ただし、特定の実験に必要な場合は、実験者のニーズに合わせてDRGレベルを調整できます。現在、DRGの3D培養¹⁶には他のコンパートメント化された培養モデルがありますが、これらのデバイスには保存された天然の非ニューロン支持細胞が含まれていないため、翻訳が制限される可能性があります。採取したDRGの天然構造を維持することは、非ニューロン支持細胞の保持を確実にするため、重要です。これは、DRGニューロンとの相互作用がこれらのニューロンの機能特性を維持するために不可欠であるためです。いくつかの研究では、ニューロンの髄鞘形成を促進するために、解離したDRGをシュワン細胞などの非天然ニューロン細胞と共培養しました17,18,19。

DRGの収穫は、ネブラスカ大学リンカーン校の動物管理・使用委員会(IACUC)に準拠して行われました。この研究には、12週齢の雌Sprague Dawleyラット(~250 g)を使用しました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.マルチコンパートメントデバイスの製造と組み立て

1. マルチコンパートメントデバイスのコンピューター支援設計と3Dプリンティング
   注:MCデバイスは、DRG細胞体と神経突起を単離するための3つのコンパートメントで構成されています(図2A)。MCデバイスは市販されていません。ただし、STLファイル(Supplementary Coding File 1)は、3Dプリンティングを可能にするためにここに提供されています。MCの印刷は完了するまでに1日かかります。
2. MCのSTLファイルを対応ソフトウェアを使用してResin 3Dプリンタにアップロードします。
   注:印刷に最適な材料は高温樹脂です。高温樹脂を使用する主な利点は、生体適合性があり、オートクレーブして再利用できることです。デジタル光処理(DLP)3Dプリンターまたはその他の3Dプリンターを使用してデバイスを印刷することもできます。
3. プリントしたデバイスをイソプロパノール(>96%)の洗浄液に30分間移し、プリントしたMCデバイスの表面に残った樹脂を取り除きます。
4. 市販の硬化剤を使用して、デバイスを80°Cで120分間二次硬化させます( 材料の表を参照)。硬化剤は、印刷されたMCデバイスを温度とUVにさらすことにより、印刷されたMCデバイスの機械的特性を向上させます。
5. MCデバイスを160°Cのオーブンで180分間熱硬化させます。
6. オートクレーブを使用して、重力サイクルで45分間デバイスを滅菌します。

2.ハイドロゲル製剤

1. メタクリル化ヒアルロン酸(MAHA、85%-115%メタクリル化)を合成し、Seidlitsらによって記述されたプロトコルを使用して特性評価します²⁰。
   注:DRGの増殖をサポートするために、メタクリル化ヒアルロン酸、I型コラーゲン、およびラミニンで構成されるトリプルハイドロゲルが一般的に使用されます。調査結果は、DRGが一般的にMAHAで増殖し、1.25〜2.5 mg / mLの範囲で、コラーゲンが2.0〜4.5 mg / mLであることを示しています。ラミニンについては、0.75mg/mLあればDRGの頑健な増殖を確実にするのに十分であることが見出される。ヒドロゲルの調製は、無菌ワークスペースを提供するために層流キャビネットで行う必要があります。

3. 光開始剤溶液の調製

注:UV光の下でMAHAを架橋するには、光開始剤が必要です。一般的には0.3%から0.6%の割合で使用されています。

1. DRG収穫の3日前に光開始剤溶液を準備します。
2. 光開始剤溶液を調製する前に、超音波処理水浴を37°Cに予熱します。
3. フローフードで滅菌技術を使用して、NaHCO 3を5x Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)-HEPES溶液にNaHCO₃を溶解することにより、23.125 mg / mL重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)溶液を調製します。
4. ガラスバイアルで、0.6%重量/体積(w / v)光開始剤を20%vol / vol 1x滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)および80%vol / vol 5X DMEM / HEPES溶液に混合します。
5. 光から保護するために、ガラスバイアルをアルミホイルで包みます。ただし、バイアルを37°Cに加熱した超音波処理水浴に移し、30〜40分間の超音波処理を行う前に、必ずアルミホイルを取り外してください。
   注:光開始剤溶液は、光にさらされるとラジカルに分解され、重合プロセスを開始する可能性があるため、光から保護する必要があります²¹。
6. 0.22 μmシリンジフィルターで溶液を滅菌ろ過し、新しい滅菌ガラスバイアルに入れます。

4. メタクリル化ヒアルロン酸溶解

1. メタクリル化ヒアルロン酸(ステップ2で調製)を、光開始剤溶液を調製する(ステップ3)同じ日に溶解します。
2. 凍結乾燥したMAHAをデシケーターに15分間入れて室温に戻します。
3. 層流フードで作業し、滅菌計量技術を使用して、凍結乾燥されたMAHAをガラスバイアルで計量します。
4. 必要な量のろ過された光開始剤溶液をMAHAに加えて、目的のMAHA濃度にします。一般的な最終ゲル濃度は、1.25 mg/mL MAHAおよび4.5 mg/mLコラーゲンです。
5. キャップを実験室用シーリングフィルムで密封し、ガラスバイアルをアルミホイルで包み、室温でオービタルシェーカープレートに完全に溶解するまで(通常は3日間)置きます。時々、MAHAの均一な溶解を確保するために、MAHAの大きな塊をバラバラにするために溶液をボルテックスします。

5. デバイスの組み立て

1. DRG収穫の前日にMCデバイスを48ウェルプレートに入れます。
2. 3mLシリンジを使用して、MCデバイス(図2B)の下の溝にシリコーンゲルの細い線を塗布します。これにより、デバイスをウェルプレートにしっかりと取り付けることができます。
3. #3鉗子を使用して、 図2Cに示すように、MCデバイスを48ウェルプレートのウェルに静かに置きます。
   注意: デバイスのサイズは、目的の用途に合わせて変更でき、必要に応じて異なるサイズのプレートを使用できます。デバイスは再利用できます。再利用するには、ヒドロゲルをすべてのトンネルから穏やかに洗い流し、装置の下のローディング溝を70%エタノールで穏やかに攪拌して使用する必要があります。これが完了したら、使用前にデバイスを再オートクレーブして滅菌することができます。

6. 動物の調理

1. 収穫開始前に、必要なすべての解剖ツールをオートクレーブします。
2. 12〜20週齢の成体の雄または雌のSprague Dawleyラットを入手します。ラットの性別はDRGの成長に影響を与えません。
3. 承認された IACUC プロトコルに従って、CO₂ の過剰摂取を安楽死の主要な方法として使用し、両側気胸穿刺を安楽死の二次的な方法として使用して、ラットを安楽死させます 米国獣医師会ガイドライン²².
4. 腹側を下にして、解剖台の滅菌アンダーパッドにラットを置きます。70%エタノールで毛皮をスプレーします。

7.背根神経節(DRG)の収穫

1. 86%ニューロベースA培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン(PS)、1%グルタミン、2%B27、50xを含むトリミング培地を調製し、24ウェルプレートに移します。この培地とウェルプレートは、収穫されたDRGをヒドロゲルに埋め込む前に一時的に保管するために使用されます。
2. 白衣、サージカルマスク、ボンネット、安全メガネ、手袋を着用してください。
3. 大きな鈍い鼻のはさみを使用して、頸椎の付け根の皮膚を切り取り、次に背骨の長さを下ります。
4. 脊柱管から血液をさらに排出するには、肩甲骨の下を切って筋肉を下方向に切り込み、主要な血管を切断します。
5. 大きくて鋭い鼻のはさみを使用して、背骨から筋肉を切り取ります。背骨を視覚化するために、できるだけ多くの筋肉をクリアにします。
6. 椎骨の背側と外側のセグメントを取り除きます。まっすぐなロンガーと鋭い鼻のはさみを使用して、頸部の端から腰椎の端に向かって移動する椎骨の棘状および横方向の突起を取り除きます。
7. 脊髄を切除します。小さな鋭利な鼻のはさみを使用して、脊髄の両側に沿ってDRGに接続されている神経根を慎重に切り抜きます。脊髄の頸部を切断し、脊柱管から慎重に持ち上げて、DRGに接続されている残りの神経根を切り取ります。
   注:細かい運動能力は、DRG本体がプロセスで切断されないようにするために不可欠です。
8. DRGを露出させるには、湾曲したロンガーを使用して、椎骨の外側部分をさらに除去します。正中線から外側に、交互に引きます。DRG本体を切断すると、細胞体や軸索に損傷を与える可能性があるため、切断しないように注意してください。
9. #3鉗子と直定規スプリングハサミを使用して、椎骨の各レベルの間にあるDRGを取り除きます。DRGから脊髄神経根をつかみ、ポケットから慎重に引き出し、脊髄神経のもう一方の端を切り抜きます。DRG本体を直接つかまないように注意してください。
10. DRGを氷上の24ウェルプレート(トリミング媒体を含む、ステップ7.1)のウェルに入れます。
11. すべてのDRGを収集した後、ワークスペースをクリーンアップし、死体をオートクレーブバッグに入れ、IACUCプロトコルに従って適切に保管/廃棄します。

8.DRGのトリミングと切断

1. 清潔なベンチに60mmのシャーレにトリミングメディアを充填します(ステップ7.1)。解剖スコープとガラスビーズ滅菌器を設置し、トリミングツール(#3鉗子とストレートエッジスプリングハサミ)を備えたオートクレーブツールボックスをスコープのそばに置きます。
2. 解剖スコープの下で、DRGの周りの余分な組織を取り除き、DRG本体に近い神経根をトリミングします(通常は周囲の神経よりもわずかに暗い)。
3. 2番目の60mmシャーレに新しいメディアを入れます。解剖スコープの下で、トリミングされたDRGを約0.5 mm(または0.5 mmから0.8 mm)に切断します。切断中に定規をペトリ皿の下に配置して、切断されたDRGの推定サイズを正しく設定します。
4. カットしたDRGを新しい24ウェルプレートに移し、培地を氷上に置きます。
   注:DRGのトリミング、切断、および埋め込みは、無菌ワークスペースを提供するために、層流キャビネットで行う必要があります。層流キャビネットがない場合は、最小限の適切な個人用保護具(PPE)(白衣、マスク、ゴーグル、手袋)を推奨し、潜在的な汚染を軽減するためにプロセス全体ですべてのツールを滅菌して、無菌技術を遵守する必要があります。

9.コラーゲンの中和

1. DRGをトリミングしてカットした後、DRGの収穫と同じ日にコラーゲンを中和します。
2. 氷上での作業では、~8.16 % の超純水、~1.84% の 1 M 水酸化ナトリウム (NaOH)、~10% の 10x PBS、および溶液の総量の ~80% のコラーゲンをガラス バイアルにピペットで入れます。
3. 滅菌済みの低保持ピペットチップを使用してゆっくりと混合し、コラーゲン(通常は最後に加える)を混合物にピペットで入れます。混合中は、気泡が発生しないように、ピペットチップを溶液に入れたままにしてください。pHストリップを使用して中和されたコラーゲンのpHが~7であることを確認します。
   注:中和されたコラーゲンは、ゲル化せずに2〜3時間氷上に保持できます。したがって、ハイドロゲルの作製は、コラーゲンが中和されたら迅速に行う必要があります。

10.ハイドロゲル製造

1. 氷上での作業を行い、ラミニン(最終濃度0.75 mg / mLまで)と1x PBSをガラスバイアルにピペットで入れます。
2. 滅菌済みの低保持ピペットチップを使用して、コラーゲンとMAHA溶液をピペットで中和し、混合物にピペットで入れて、目的の濃度に到達します。
3. ゆっくりと混合し、得られたヒドロゲルのpH(~7)を確認します。

11. DRGの埋め込み

1. マルチコンパートメント埋め込みを実行します。
   1. プレミックスされたヒドロゲル65.1μLおよび52.8μLをそれぞれ体細胞および神経突起コンパートメントにピペットで入れます。
      注:これは、48ウェルプレートでMCデバイスを使用することを前提としています。これらのボリュームは、使用する MC デバイスのサイズに基づいて変更できます。
   2. カットしたDRGをソーマコンパートメント(図2A)にそっと埋め込み、ウェルプレートの底に傷がつかないようにします。DRGを中央に配置して、神経突起がトンネルを通って隣接するコンパートメントに成長できるようにします。
   3. インキュベーター内のハイドロゲルを37°Cで30分間サーマルクロスリンクします。これが発生する間、UVランプをオンにしてウォームアップします。
   4. 熱架橋後、ヒドロゲルを90秒間UV架橋します。
   5. ハイドロゲルとDRGにDRG増殖培地を添加し、1時間後に全面的な培地交換を行い、培地に残留する未反応または残存する光開始剤の痕跡を除去します。
   6. 3日ごとに半量の交換を行い、顕微鏡で観察してDRGの成長を監視します。
   7. ~4週間後、DRG神経突起が成長し始めたら(図3A)、蛍光プレートイメージャーで画像をキャプチャし、FIJIを使用して神経突起の長さを定量化します(ImageJ)。

12. DRGの埋め込みを制御する

1. 250 μL のハイドロゲルを 48 ウェルプレートに入れてピペットで取ります (MC なし)。
2. カットしたDRGをウェルの中央とハイドロゲルの半分にそっと置き、ウェルプレートの底を傷つけないようにします。
3. インキュベーター内のハイドロゲルを37°Cで30分間サーマルクロスリンクします。
4. ハイドロゲルを90秒間UV架橋します。
5. DRG増殖培地をハイドロゲルとDRGに加え、1時間後に完全な培地交換を行います。
6. 3日ごとに半量のメディア交換を行い、DRGを顕微鏡で観察してDRGの成長を監視します。
7. ~4週間後、DRG神経突起が成長し始めたら(図3B)、蛍光プレートイメージャーで画像を撮影します。
   注:どの明視野顕微鏡でもイメージングに使用できます。自動化されたプレートベースの顕微鏡は、このプロセスを迅速化します。デバイスを使用せずにプレーンゲルに制御包埋することは、マルチコンパートメントでのDRG神経突起の成長を比較するために行われます。DRGがMCゲルとコントロールゲルで同様に増殖することをユーザーが確認すれば、毎回コントロールゲルを繰り返す必要がなくなるかもしれません。

13. DRGイメージング

1. 蛍光プレートイメージャーを使用して、さまざまな焦点距離で4倍の倍率で明視野画像をキャプチャし、DRGおよびMCデバイス全体を視覚化します。
2. 画像の明るさとコントラストを調整して、神経突起が見やすくします。
3. 画像を.tiffファイルとして保存します。

14. DRG神経突起の定量化

1. FIJI(ImageJ)をダウンロードしてインストールします。
2. ImageJを開きます。画像ファイルを開き、ファイルがモノクロであることを確認します。
3. コントラストを強めて、最小の神経突起が見えるようにします。これを行うには、ショートカット Ctrl + Shift + Cを使用して明るさとコントラストのオプションを開きます。
4. 必要に応じてコントローラーのスライダーを調整して神経突起を視覚化し、[ 適用 ]をクリックして目的の明るさとコントラストにします。
5. Neurite Tracer を開くには、 Plugins メニューを開き、 Segmentation を選択して Simple Neurite Tracer をクリックします。
6. 新しいトレースを開始するには、神経突起の一方の端をDRG本体のすぐ近くでクリックします。
7. 神経突起に沿った別のポイントをクリックして、神経突起が端から端までトレースされるまでトレースを追加します。神経突起をトレースした後、 パスを終了 をクリックします。
8. トレースした長さを実際の単位に変換し、結果をコピーしてExcelに貼り付けて保存します。
9. FIJIの直線ツールを使用して、スケールバーと同じ長さの線を描き(線の端を離さないでください)、ツールバーの下に表示される長さの値を確認します。長さの値は変換に使用されます。
10. 図 4 に示すように、DRG の両側から伸びる 6 つの長い神経突起の長さを測定し (図 3C、D)、これらの神経突起の平均長さを計算して、DRG の代表的な平均長さを求めます。
    注:免疫染色は、非ニューロン支持細胞の存在を示すために、プレーンゲル中のDRG外植片で試験されています⁷。DRGを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に室温で固定し、1x PBSで15分間3回洗浄し、免疫染色するまで1x PBSで4°Cで保存します。
11. MCデバイスの外植片の場合は、MCデバイスを取り外し、上記⁷と同じプロセスに従います。

本プロトコルは、成体のSprague DawleyラットからDRGをマルチコンパートメント(MC)デバイスで収穫し培養する技術を記載しています。 図1に示すように、 成体ラットから採取したDRGをトリミングし、~0.5mmにカットしました。次に、トリミングおよび切断したDRGをMCデバイスの体細胞領域のハイドロゲルに包埋し(図2)、神経突起定量化の前に27日間培養しました。DRGは、コントロールとして機能するためにプレーンゲルで培養されました。この実験に使用したヒドロゲル製剤の濃度は、4.5/1.25 mg/mL コラーゲン:MAHAでした。マルチコンパートメントゲルとプレーンゲルのそれぞれ27日目と21日目に、神経突起の堅調な成長が見られました(図3)。MC中の神経突起の平均長(894.22μm±308.75μm)は、対照プレーンゲルの神経突起長(864.26μm±362.84μm)と同等でした(図4)。これは、MCデバイスがDRGの培養と神経突起の成長をサポートする能力を示しています。神経突起の長さは、ImageJソフトウェアを使用して定量化しました。

図1:実験手順を示す概略図(A)成体Sprague Dawleyラットからの背根神経節(DRG)の収穫。(B)収穫されたDRGのトリミングと切断。(C)ヒドロゲル製剤、DRG包埋、および48ウェルプレートに装着したMC内のハイドロゲルでの培養。(D)培養21〜30日後のDRG神経突起の成長。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:3つの分離コンパートメントを備えたプリントされたマルチコンパートメントで、48ウェルプレートで使用できます。 (A)プリントされたMCデバイスの上面図を示す代表的な画像は、DRGおよび神経突起コンパートメント(赤い線)とDRG埋め込み領域(緑)を示しています。(B)MCの側面図(C)48ウェルプレートに装着したMCの画像。スケールバー = 10 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マルチコンパートメント(MC)デバイスにおける神経突起の増殖、およびプレーンゲルの制御。 (A)明視野中のマルチコンパートメント(MC)デバイスにおける神経突起の成長の追跡を示す代表的な画像。(下図)三菱商事のトンネルを通って成長した神経突起は矢印で示されています。(B)コントロールプレーンゲル(MCなし)の神経突起成長の画像。(C)コントロールプレーンゲル(紫色の線)の12本の長い神経突起の神経突起トレースを示す代表的な画像。DRGの両側にある6つの長い神経突起を定量化して、平均神経突起の長さを求めました。画像は蛍光プレートイメージャーで4倍の倍率で撮影し、神経突起はFIJI(ImageJ)を使用して定量化しました。スケールバー = 1000 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マルチコンパートメント(MC)の神経突起の長さとプレーンゲル(PG)の神経突起の長さの比較。 個々の神経突起の長さと、エラーバーで表される平均と標準偏差を示す散布図。MCの平均神経突起長は、プレーンゲルの864.26μm±362.84μm(平均±±SD±1204.40μm690.43μm)であり、MCが神経突起の成長をサポートしていることを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Supplementary Coding File 1: コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用して生成されたマルチコンパートメント(MC)デバイスのSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

この研究の著者は、利益相反がないことを宣言します。