この研究では、バイオリスティックな方法を使用して酵母ミトコンドリアを形質転換する方法を説明しています。また、形質転換体の選択方法と精製方法、およびミトコンドリアゲノム内の標的位置に目的の突然変異を導入する方法も示します。
この記事について
サマリー
要約
ベーカー酵母 Saccharomyces cerevisiae は、何十年にもわたってミトコンドリアの生物学を理解するために広く使用されてきました。このモデルは、真核生物間の本質的で保存されたミトコンドリア経路、および真菌または酵母特異的な経路に関する知識を提供しました。 S. cerevisiae の多くの能力の1つは、ミトコンドリアゲノムを操作する能力であり、これは今のところ S. cerevisiae と単細胞藻類の Chlamydomonas reinhardtiiでのみ可能です。酵母ミトコンドリアの生物学的な形質転換により、部位特異的な突然変異の導入、遺伝子の再配列、レポーターの導入が可能になります。これらのアプローチは主に、ミトコンドリアにおける2つの高度に協調したプロセス、すなわちミトリボソームによる翻訳と呼吸複合体およびATP合成酵素の集合のメカニズムを理解するために使用されます。しかし、ミトコンドリアの形質転換は、他の経路の研究にも利用できる可能性があります。本研究では、高速微小発射体衝撃によって酵母ミトコンドリアを形質転換し、目的の形質転換体を選択して精製し、ミトコンドリアゲノムに目的の突然変異を導入する方法を示します。
概要
酵母Saccharomyces cerevisiaeは、ミトコンドリアの生合成の研究に使用される広く認識されているモデルです。酵母は嫌気性の通性生物であるため、呼吸を損なう突然変異を導入する原因と結果を広範囲に研究することが可能です。さらに、この生物は、ミトコンドリア経路を研究するための友好的な遺伝的および生化学的ツールを持っています。しかし、呼吸複合体の集合とミトコンドリアタンパク質合成のメカニズムを探求するための最も強力なリソースの1つは、ミトコンドリアを変換し、細胞小器官のゲノムを改変する能力です。これまで、ミトコンドリアDNA(mtDNA)に点変異または小さな欠失/挿入1,2,3,4,5を導入し、遺伝子を欠失6,7し、遺伝子再配列7,8を行い、ミトコンドリアタンパク質9,10にエピトープを付加し、核からミトコンドリア11に遺伝子を再配置することが有用であった。図12に示すように、BarStar13、GFP14,15、ルシフェラーゼ16、および最も広く使用されているARG8m17,18などのレポーター遺伝子を導入します。ミトコンドリアのゲノム改変により、これまで理解するのが難しかったメカニズムを解剖し、特定することが可能になりました。例えば、ミトコンドリアDNAのCOX1遺伝子座に挿入されたARG8mレポーター遺伝子は、Mss51がCox1の生合成に二重の役割を果たしていることを理解する上で極めて重要でした。第一に、それはCOX1 mRNAの翻訳活性化因子であり、第二に、新しく作られたCox1タンパク質7,19のアセンブリシャペロンです。この研究は、S. cerevisiaeミトコンドリアを形質転換するための詳細な方法を提示しています。ミトコンドリア形質転換プロトコルは16,20,21,22,23以前に発表されましたが、方法のさまざまな段階と詳細を完全に理解するには、ビデオによる視覚的なアプローチが不可欠です。この方法はさまざまなステップで構成され、次の 4 つの一般的な段階に分かれています。
図1:高速微小発射体衝撃によるミトコンドリア形質転換手順の概要:1)タングステン粒子はDNAコーティングの前に滅菌および調製されます。2)WPの表面に2つの異なるプラスミドが沈殿します。1つは、ミトコンドリアマトリックスに向けられるコンストラクトを含む細菌プラスミドです。もう1つは、補助栄養マーカーを担ぐ核酵母発現ベクターです。3)ミトコンドリアDNA(rho0)を欠く受容体酵母株は、ガラクトースやラフィノースのような発酵性炭素源で増殖し、ミトコンドリア遺伝子発現のグルコース抑制を一切及ぼさない34,35。培養物は、砲撃媒体を含むシャーレに広げられます。4)プラスミドでコーティングされたWPは、高速微小発射体衝撃によって受容体株に撃ち込まれます。5)ミトコンドリアプラスミドを含有する陽性合成rho-コロニーは、テスター株と交配することによって選択される。6)ミトコンドリア構築物は、サイトダクションとして知られるプロセスによって合成rho-株(ドナー)とアクセプター株と交配することにより、所望の遺伝子座でミトコンドリアゲノムに統合される。7)正の受容体であるミトコンドリア構築物を運ぶ一倍体株を選択し、異なる培地で精製します。略語:WPs =タングステン粒子;mtDNA = ミトコンドリアDNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ミトコンドリアゲノムへの組み込みを目的としたDNAコンストラクトによる細胞の形質転換 (図1、ステップ1-4)
完全なミトコンドリアゲノム(rho+)を含む酵母を直接形質転換することは可能ですが、細胞がミトコンドリアDNA(rho0)を欠いている場合、形質転換は10〜20倍効率的です24。タングステン粒子(WP)は、共形質転換される2つの異なるプラスミドでコーティングされています。第1のものは、 LEU2 または URA3 (例えば、それぞれYEp351またはYEp352)などの補助栄養マーカーを運ぶ酵母2 μ発現ベクターである。酵母細胞へのDNAの生物学的導入が成功すると、形質転換体は補助栄養培地(すなわち、ロイシンまたはウラシルを欠く培地)で増殖します。このプラスミドは、核プラスミドを獲得した細胞を最初に選択するのに役立ちます。そうしないと、結果として生じるコロニーの数がプレートを飽和させます。第2のプラスミドは、ミトコンドリアゲノムに組み込まれることを意図したミトコンドリア構造を含む細菌プラスミド(pBluescriptなど)である。コンストラクトは、目的のミトコンドリア領域と組換えするために、少なくとも100 ntの5'および3'に隣接するミトコンドリア配列を含まなければならない。私たちの経験では、より大きな隣接配列は、ミトコンドリアゲノムの標的遺伝子座とうまく組み換える可能性が高くなります。
具体的な例を図225に示す。この例では、対応するタンパク質(Cox1ΔC15)の最後の15アミノ酸をコードするミトコンドリアCOX1遺伝子の領域を削除することを目的としていました(図2A)。COX1ΔC15変異を持つ細菌プラスミドには、遺伝子の5'および3'の非翻訳領域がそれぞれ395 ntおよび990 nt含まれていました。プラスミドはpBluescript(pXPM61)から導き出され、2 μプラスミドYEp352とともに、WPの表面で共沈しました(図2B)。次に、WPをマイクロ発射体爆撃によって選択した受信者株に導入しました(図2C)。NAB6926と名付けられたこの株は、kar1-1およびade2対立遺伝子を持つMATa、rho0株です(これらの特性の重要性については後述します)。細胞をウラシルを欠く衝撃培地に播種して、2 μプラスミドを獲得した細胞を選択しました(図2C)。細胞を30°Cで5〜7晩増殖させました。
ミトコンドリアコンストラクトを含む細菌プラスミドと補助栄養マーカーを保有する核2 μプラスミドを獲得した細胞の選択 (図1、 ステップ5)
陽性のコロニーは、ミトコンドリア22に細菌プラスミドの多くのコピーを維持します。形質転換細胞はもともとrho0であるため、プラスミド中に存在するミトコンドリア構築物の翻訳を支持するミトコンドリア配列はありません。したがって、形質転換されたミトコンドリア遺伝子は発現しません。ミトコンドリアプラスミドを獲得した酵母コロニーを検出するために、形質転換体をテスター株と交配させる必要があります。テスター株のミトコンドリアゲノムには、目的の遺伝子の非機能的な変異型が含まれています。交配後、ミトコンドリアは融合し、形質転換プラスミドに含まれるミトコンドリア配列は、テスター株の変異したミトコンドリア遺伝子と再結合します。その結果、WT遺伝子の回復は機能を再構成します。結果として生じる二倍体は、検出可能な陽性の表現型(通常、呼吸培地またはアルギニンを欠く培地で成長する能力)を持ちます。ミトコンドリアで細菌プラスミドを運ぶ陽性細胞は、「合成rho細胞」と呼ばれます。図2Dの具体例では、COX1ΔC15コンストラクト(XPM199と命名)を有する合成rho細胞を、ウラシルを欠く培地(これは陽性コロニーを精製したマスタープレート)上にレプリカプレーティングした。また、非機能的な変異cox1D369Nを含むテスター株L4527芝生にレプリカメッキされました。2晩交配した後、L45とXPM199のミトコンドリアゲノムが再結合し、機能的なCOX1遺伝子が生まれました。したがって、二倍体は呼吸器媒体上で成長する能力を回復しました。マスタープレートから、ポジティブコロニーを選びました。それらはウラシルを欠くプレート上に縞模様にされ、選択的試験を繰り返して純粋な合成rho細胞を得ました(図2E)。テストプレートは合成rho-コロニーの同定のみを目的としており、これらのプレートから突然変異体を回収することはできません。
意図した菌株のミトコンドリアゲノムへのコンストラクトの統合
このステップは、サイトダクション28,29と呼ばれるプロセスによって達成される(図1、ステップ6)。このアプローチでは、合成rho-ひずみ(ドナーひずみ)は、反対の嵌合タイプの意図されたアクセプターひずみと交配されます。本質的な要件は、2つの交配株のうち少なくとも1つが、核融合30を妨げるkar1-1変異を有することである。したがって、2つの細胞を交配させると、二核受精卵が生成されます(図3)。親細胞(ドナーとアクセプター)からのミトコンドリアネットワークが融合し、ミトコンドリアDNA分子が再結合します。二核受精卵は、出芽を可能にするためにインキュベート/回収され、一倍体細胞が産生されます。これらの一倍体は、親細胞の1つの核背景を持っています。同様に、一倍体は、親細胞または目的の再結合ミトコンドリアDNAのいずれかからミトコンドリアDNAを運ぶことができます。しかし、kar1-1変異は100%有効ではなく、交配中にいくつかの真の二倍体が形成されます28,29。合成rho-株(ドナー、XPM199)は、例でkar1-1対立遺伝子を運びました。選択的マーカーとして、ade2対立遺伝子を有し、アデニンの補助栄養剤となりました(図4)。アクセプター株はXPM10であり、cox1Δ::ARG8mコンストラクトを持つrho+株であり、レポーターARG8mがミトコンドリアゲノム7のCOX1コドンを置き換えました。両方の細胞培養物の混合物をYPDプレートに滴として加え、交配を可能にしました。3〜5時間後、細胞を光学顕微鏡で観察し、交配に関連する細胞形状であるshmoos(図3B)の形成を検出しました。インキュベーション/回復時間の後、二核受精卵をアデニンを欠く培地に播種して、ドナー細胞の増殖を防いだ。
目的のミトコンドリアゲノムを運ぶ一倍体株の選択 (図1、ステップ7)
ドナー細胞、アクセプター細胞、および二倍体細胞の混合物が細胞導入後に存在します。したがって、二核受精卵のインキュベーション/回収後、目的の半数体を同定および精製するために、細胞を異なる選択培地で増殖させる必要があります。選択培地は、ドナーの遺伝子型、アクセプター株、および意図されるミトコンドリア構造に依存します。しかし、一般的に、選択培地を選択する理由は、i)インキュベーション/回収後、サイトダクションミックスは、ドナーの親株が増殖できない選択培地で増殖する。図4A、Bの具体例では、ドナー(合成rho-株)は非機能的なade2対立遺伝子を運ぶ。したがって、サイトダクションミックスは、アデニンを欠く培地プレート上でインキュベートする必要があります。これがマスタープレートです。ii)コロニーが成長すると、マスタープレートはアデニンを欠く培地で再び複製され(目的の陽性コロニーが精製される新しいマスタープレートを生成するため)、次に、二倍体のみが成長できる培地で複製されます。これは、二倍体コロニーのさらなる不注意な精製を避けるために必要です。図 4C の例の場合、ロイシンが不足している媒体で成長できるのは二倍体のみです。iii)マスタープレートは、目的のミトコンドリアDNAを組み込んだアクセプター一倍体のみが増殖する培地でも複製されます。図4Cの例では、Cox1ΔC15タンパク質が機能しているため、炭素源としてエタノール/グリセロールを含む呼吸器培地で一倍体が成長します。得られた、目的のmtDNAを持つrho+株は、XPM20925と命名されました。 図2および図4で使用した株を表1に示します。
図2:ミトコンドリアの形質転換と陽性のrho-細胞の選択の具体例を説明する図。 (A)ミトコンドリアゲノムの意図された改変は、Cox1サブユニット(Cox1ΔC15)の最後の15アミノ酸をコードする領域の欠失であった。(B)WPを2つのプラスミドでコーティングして、酵母細胞を形質転換しました。1つは、核内で指向性および発現した2 μプラスミドYep352でした。もう1つはプラスミドpXPM61で、これにはCOX1ΔC15対立遺伝子に加えて、COX1 5'および3'-UTRの395 ntおよび990 ntがそれぞれ含まれています。(C)WPは、ミトコンドリアDNAを欠くNAB69株(rho0株)の細胞に導入された。爆撃プレートから得られた形質転換コロニーは、核プラスミドYEp352の補助栄養マーカーであるウラシルを欠く培地で再現されました。(D)陽性のrho-コロニーを選択するために、-URAプレートをウラシルを欠く培地上に複製した。これは、ポジティブコロニーを選別して分離するためのマスタープレートでした。また、リッチメディア(YPD)およびテスター株の芝生を有するプレート上でも複製された。交配中に、合成ロミトコンドリアDNAは、COX1遺伝子(D369N)に変異を持つテスター株L4527由来のミトコンドリアDNAと組み換えられた。呼吸器媒体上で成長した二倍体には、形質転換されたDNAが含まれていました。対応するコロニーをマスタープレートから選択して、レストリークと精製を行いました。すべてのレプリカメッキ全体でマスタープレートの陽性コロニーを識別するために、プレートの端に油性マーカーでマークが付けられました(緑の線)。(E)選択された陽性コロニーは、ウラシルを欠く培地で再調整されました。これが新しいマスタープレートです。Dと同様に、合成rho-コロニーを精製するためにさらに2回の試験が実施された。略語:WPs =タングステン粒子;mtDNA = ミトコンドリアDNA;-URA / Sorb =ウラシルが不足している/ソルビトールを含む;WT = 野生型。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サイトダクション手順を説明する図。 (A)細胞導入中の細胞の交配方法の一般的な概要。サイトダクションでは、ドナー株とアクセプター株のミトコンドリアが融合し、両株のミトコンドリアDNAが再結合します。 kar1-1 変異30により核融合が減少するため、二核接合子が形成される。ある程度のインキュベーション/回復時間の後、意図されたミトコンドリア変異を含む二核受精卵の芽と一倍体受容体が選択されます。(B)合成rho- 株(ドナー)とアクセプター株のサイトダクションによる交配により、交配酵母の特徴的な形状であるshmoos(赤い矢印)の形成が可能になります。画像は、100倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡で撮影されました。スケールバー = 10 μm. この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4:ミトコンドリアゲノムに突然変異COX1ΔC15を組み込むための細胞導入の具体例を説明する図(A)合成rho株(ドナー、XPM199)と目的株(アクセプター、XPM10)の液体培養物を混合して交配させた。shmoo形成後、混合物を液体培養物中で2〜4時間回収した。次に、サイトダクションミックスをアデニンを欠く培地でプレート上に広げ、ドナー細胞の増殖を防いだ。(B)サイトダクション中のドナー(XPM199)とアクセプター(XPM10)からのミトコンドリアDNAの組換えイベントの概略図。(C)マスタープレートを異なる選択培地で複製し、オルガネラのDNA(XPM209)に意図されたミトコンドリア遺伝子を統合した一倍体を同定し精製した(XPM209)25。略語:-ADE =アデニンが不足している。-LEU = ロイシンが不足している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
プロトコル
注:ミトコンドリアの形質転換効率は通常低いため、各コンストラクトに対して6つの形質転換を行うことをお勧めします。異なる増殖培地の組成を 表2に示します。
1. タングステン粒子の調製
- 0.7 μmのタングステン粒子(WP、マイクロキャリア)30 mgをマイクロチューブ内で秤量します。70%エタノール(EtOH)を1.5mL加えて滅菌します。WPをボルテックスし、室温で10分間休ませます。
- 13,200 x g で室温で15分間遠心分離します。WPを洗浄するには、粒子に1.5 mLの滅菌水を加え、ボルテックスし、室温で13,200 × g で15分間遠心分離します。上清を捨てます。
- 滅菌済み50%グリセロール500μLを添加します(最終濃度は60μgのWPs/μLです)。
注:WPは-20°Cで少なくとも6か月間保存できます。このストックから、6回の形質転換に必要な量(100μL)を取ります。
2. WPs DNAコーティング
- 2 μプラスミド 5 μg とミトコンドリア配列を含む細菌プラスミド 15 μg を氷上のマイクロチューブに加えます。
注:DNAコーティングに必要な試薬がさらに希釈されるのを避けるために、最終容量は50μLを超えてはなりません。 - 100 μLのWP懸濁液とボルテックスを5秒間加えます(6 mgのWPs)。
- 1 Mスペルミジンを4 μL加えます。簡単に渦巻きます。
- 氷冷した2.5 M CaCl2 100 μLを加え、短時間ボルテックスします。氷上で10分間インキュベートします。3分ごとにミックスを短時間ボルテックスします。
注:CaCl2 溶液はフィルター滅菌されており、オートクレーブ滅菌しないでください。 - WPを4°Cで13,200 × g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。粒子を-20°Cで200μLの100%EtOHに穏やかに再懸濁して洗浄します。
- WPを4°Cで13,200 × g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。洗濯を繰り返します。
- ピペットチップを使用して、WPを室温100%EtOHの60〜70μLに再懸濁します。渦を巻かないでください。
注:プラスミドの品質を確保するために、DNAコーティングはバイオリスティック形質転換と同じ日に行う必要があります。
3. バイオリスティック材料の調製
- 砲撃の前に、6つのマクロキャリアホルダー(図5)をオートクレーブで滅菌し、完全に乾燥させます。あるいは、それらをEtOHに浸し、鉗子の助けを借りて炎を使用して滅菌します。滅菌ガラスプレートの上に置きます。
- DNA沈殿中(ステップ2.4で氷上で10分間インキュベーション)、滅菌鉗子を使用して、6つのマクロキャリアホルダーのそれぞれに6つのマクロキャリア(またはフライングディスク)を挿入します。
注意: マクロキャリアを滅菌しないでください。 - DNAでコーティングされたWPをピペットと混合します。10 μL の WP を各マクロキャリア表面に加え、ピペットチップで表面全体に分散させます。必要に応じて、マクロキャリアの表面に数マイクロリットルの100%EtOHを追加して、WPが均一に広がるようにします。懸濁液を室温で~20分間乾燥させます。
4.酵母細胞と衝撃板の調製
- rho0 受容体株を2 mLのYPR培地に接種します(表2)。回転するホイールで30°Cで一晩育てます。
- 培養物300 μLを30 mLの新鮮なYPR培地で希釈します。ロータリーシェーカーで30°C、200rpmで培養物が飽和するまで2晩成長させます。
- 酵母細胞を600 × g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、酵母細胞を600μLのYPD培地に再懸濁します(表2)。
- 滅菌ガラスハンドルを使用して、100 μLの酵母細胞懸濁液を固体の衝撃培地プレートに広げます。
注:爆撃培地には、形質転換に使用される2 μプラスミドの選択マーカーが欠けている必要があります。 - 他の5つのプレートについても手順4.4を繰り返します。
- 衝撃前に室温で1〜3時間インキュベートし、液体媒体がプレートの表面に完全に吸収されることを確認します。
5. 生物形質転換による合成rho-株の生成
注意: 始める前に、バイオリスティック機器のユーザーマニュアルを必ずお読みください。参照された機器のプロトコルについて説明します(資料の表 と 図5)。
- バイオリスティック粒子送達システムのチャンバーを70%エタノールで洗浄して汚染を防ぎ、少なくとも10分間放置します。砲撃の直前に、清潔なペーパータオルで表面を拭きます。
- ヘリウムタンクバルブを開いて、約2,000psiに設定します。
- 装置の電源を入れ、真空源をオンにします。
- 鉗子を使用して、マクロキャリアを下向きにしてマクロキャリアホルダーに置きます。
注意: 機器に付属の停止画面は使用しないでください。 - マクロキャリアの蓋をマクロキャリアの上にねじ込みます。すべての部品が一緒になってマイクロキャリア発射システムを構成します(図5)。
- マイクロキャリア発射システムを下から5番目のレベルの真空チャンバー内に配置します。
- rho0 ひずみ芝生を含むプレートの1つを、チャンバーの底から2番目のレベルに置きます。プレートが上を向き、蓋がないことを確認します。
- 滅菌鉗子を使用して、保持キャップに1つのラプチャーディスクを置きます。加速チューブの保持キャップをねじ込みます。保持キャップがぴったりと固定されていることを確認してください。
注:形質転換効率が低下することが観察されているため、マニュアルで提案されているように、破裂した椎間板をイソプロパノールで処理しないでください。 - 真空チャンバーのドアを閉めます。
- VAC / VENT / HOLDスイッチをVACの位置に置きます。25〜28 inHgの真空度に達したら、VAC / VENT / HOLDスイッチをHOLDの位置に変更します。
注意: 達成可能な真空は海面によって異なる可能性があることに注意してください。その結果、25 inHgに達することに成功しました。 - 加速チューブに圧力がかかるのを待ち、1,300 psiに達するとラプチャーディスクが壊れて破裂音がします。
- ラプチャーディスクが壊れた直後は、VAC/VENT/HOLDスイッチをBENTの位置に変更することで、FIREスイッチとバキュームが解除されます。
- 滅菌鉗子を使用して、プレートの表面に存在するラプチャーディスクの破片を慎重に取り除き、プレートを蓋で覆います。
- 残りの5枚のプレートについてもこの手順を繰り返し、各ラウンドに新しいラプチャーディスクとマクロキャリアを配置します。
- 最後に、ヘリウムタンクのメインバルブを閉じます。
- チャンバーを閉じ、 VAC / VENT / HOLD スイッチを VAC の位置にして真空にします。 FIRE スイッチを数回押して放すことにより、システムをヘリウム圧力から解放します。ドアを開けた状態で繰り返します。
- 真空ポンプと爆撃装置の電源を切ります。
- 70% EtOHで送達システムを清掃します。マクロキャリアサポートを0.1%SDS溶液で洗浄します。滅菌蒸留水と100%EtOHですすいでください。
6.合成rho- コロニーの選択
- 砲撃プレートを30°Cで5〜7晩インキュベートします。
注意: プレートに汚れがないか毎日チェックすることが重要です。必要に応じて、汚染された領域を滅菌ヘラで切り取り、さらなる汚染を避けることができます。 - 反対の嵌合タイプのテスター株を2 mLのYPD培地に一晩接種します( 図2D、Eの具体例を参照)。
- 150 μLのテスター株培養物をYPDプレートに接種します。滅菌ガラスハンドルを使用して、テスターをプレート表面に均等に広げます。プレートを少なくとも5分間乾かします。
- ベルベットの複製パッドとレプリケータースタンプを使用して、砲撃プレートのレプリカを作成します。
- 形質転換された2 μプラスミド補助栄養マーカーに対応するドロップアウト培地プレート上に複製します。成長には、30°Cで一晩インキュベートする必要があります。 その後、さらに使用するまで4°Cで保存してください。このプレートが マスタープレートです。
- ステップ6.3のテスターの芝生を含むYPDプレートに複製します。30°Cで2晩インキュベートします。その後、このプレートを選択培地で複製して、目的のミトコンドリア遺伝子(例えば、呼吸用培地やアルギニンを欠く培地)の存在を検出し、30°Cで一晩インキュベートします。 ミトコンドリアに合成細菌プラスミドを保有する細胞のみが、テスター株と交配した後、選択培地上で増殖します。
- マスタープレート(ステップ6.4.1)で、ステップ6.4.2で成長した対応するコロニーを特定します。
注:爆撃プレート(したがってマスタープレート)は形質転換コロニーで密集しているため、テスターの交配プレートで観察された陽性のコロニーを特定するのが難しい場合があります。このため、油性マーカーを使用して、すべてのプレートの両側に数本の小さな線を引くことを強くお勧めします。複製スタンプのリングにも同様の線を引きます。これらの線は、マスタープレート上のポジティブコロニーの向きと位置を特定するのに役立ちます( 図2Dの例を参照)。 - ステップ6.4.1のように、ポジティブコロニーをマスタープレートから2番目の選択的ドロップアウトプレートにストリーキングして、ポジティブコロニーを精製します。30°Cで2晩インキュベートします。
注:ストリーキングにより、単一のコロニーの成長が可能になり、純粋な菌株が確保されることが不可欠です。 - 選択プロセス(ステップ6.2-6.5)を繰り返して、ミトコンドリア中の細菌プラスミドの存在を確認します。
注:通常、このプロセスをさらに2回繰り返すことで、安定した合成rho- 株を選択できます。 - 合成rho- 株がミトコンドリアのプラスミドDNAを安定して維持したら、3〜5の異なる陽性コロニーを選択し、それらを2mLのYPDに接種します。この培養物を使用して、クライオバイアルストックを調製し(600 μLの培養物と600 μLの50%グリセロールを混合して-70°Cで保存)、プラスミド配列を目的のmtDNAにサイトダクションにより挿入します(ステップ6.7)。
注:合成rho- 株からのミトコンドリア内の形質転換プラスミドを維持するための選択圧がないため、プラスミドは容易に失われる可能性があります。そのため、できるだけ早くサイトダクションを行うことをお勧めします。
7. 合成rho株に存在する構造をサイトダクションによるミトコンドリアゲノムの標的部位に統合する
- 2本のチューブに3mLのYPD培地を接種し、1本はドナー細胞(合成rho細胞 )を、もう1本はアクセプター細胞(最終的な構築が予想される酵母細胞)に接種します。30°Cで一晩インキュベートします。
- ドナー株750 μLと受容体株250 μLを滅菌マイクロチューブに混合します(3:1の比率)。
- 混合物を13,200 × gで1分間遠心分離します。上清を捨てます。端を切り落とした1 mLピペットチップを使用して、細胞ペレットを1滴取り、YPDプレートに置きます。30°Cで2〜4時間インキュベートします。
注:交差汚染を避けるために、1つのプレートに2つ以上の細胞懸濁液を入れないでください( 図4Aの例を参照)。 - 細胞混合物を少量取り、スライド上に15 μLの滅菌水に再懸濁し、カバースリップを置きます。光学顕微鏡で、40倍または100倍の対物レンズを備えたshmoosの存在を確認します。この特徴的な形状は、2つの嵌合タイプが存在する場合に現れます(図3B)。
- shmoosが存在する場合は、2 mLのYPD培地に少量(~0.5 mm3)の細胞塊を再懸濁します。回転ホイールで30°Cで2時間インキュベートし、二核受精卵が回復するまで待ちます。
- 混合物をボルテックスし、細胞懸濁液10 μLを990 μLの滅菌水(1:100希釈)で希釈します。ガラスビーズまたは滅菌ガラスハンドルを使用して、アクセプター株(および散発性二倍体)のみが増殖するドロップアウト培地に100 μLの細胞希釈液を広げます。30°Cで2〜3泊インキュベートします。
- 得られたコロニーを、導入部(ステージ4)で説明したように、必要な選択培地に複製します。具体的な例については 図4C を参照ください。
- 陽性コロニーを同定した後、それらを同じ選択培地に再投与して、目的のmtDNAを運ぶ一倍体株を精製します。
- 少なくとも 2 つの陽性コロニーを選択し、2 mL の YPD 培地で 30 °C で一晩増殖させます。600 μLの50%グリセロールと600 μLの飽和YPD培養物を混合して、極低温バックアップを作成します。-70°Cで保存してください。
- 得られた株31,32のDNAを単離する。PCRとシーケンシングにより目的の領域を増幅し、ミトコンドリア変異の存在を確認します。
注:各陽性コロニーは、ミトコンドリアゲノムの正しい配列を確保するために独立して確認する必要がある技術的な複製です。
結果
このセクションでは、ミトコンドリア形質転換のさまざまな段階から得られた代表的な結果をいくつか紹介します。図6は、砲撃の手順を示しています。合成rho細胞は、ミトコンドリア遺伝子のコード配列を置き換えるレポーター遺伝子ARG8mを持つ細菌プラスミドを運びました(図6A)。砲撃後、プレートはウラシルを欠く媒体(-URA)で複製されました。これがマスタープレートです(図6B)。成長するコロニーは、URA3補助栄養マーカーを持つ酵母発現ベクターを持っています。プロトコルセクション6によれば、爆撃プレートは、テスター株の芝生を含むYPD媒体にも複製されました。この場合、テスター株は、ミトコンドリアゲノム(ARG8m-1)1にARG8m遺伝子の欠陥対立遺伝子を保有していました。2晩のインキュベーション後、テスターの芝生と形質転換細胞が交配し、ミトコンドリアが融合しました。このプレートは、アルギニンを欠いた媒体で複製されました。ミトコンドリアプラスミドを含有する二倍体のみが、この選択培地で増殖することができたのは、合成rho-株に存在するARG8m遺伝子が、テスター株のミトコンドリアゲノムから欠陥のあるARG8m-1を置き換えたためです。
陽性コロニーの数は、一般にプレートあたり0から20まで変化します。本例では、4つの陽性合成rhoコロニーが得られ、これらはウラシルを欠く培地でそれらをストリーキングすることによって精製された。精製の最初のラウンドでは、多くのネガティブコロニーがポジティブコロニーとともに得られました。しかし、2〜3ラウンドの精製後、純粋な陽性合成rho-株を得ることが可能です。図6Cでは、3回の精製と試験後に、いくつかの陽性の合成rho-コロニーを示しました。-URAマスタープレートのほとんどのコロニーは、テスタープローブに対して陽性です。興味深いことに、陽性コロニーのすべての細胞にミトコンドリアプラスミドが含まれているわけではなく、形質転換されたプラスミドがコロニーの集団で失われたことを示しています。ミトコンドリアプラスミドを保持するための選択圧がないため、ミトコンドリアプラスミドが不安定になるため、この結果は予想されます。しかし、図6Cに示されているような合成rho株は、次のステップであるcytoduction(プロトコルセクション7)に進めることができ、-70°Cで保存するストックを準備するために使用できます。しかし、この場合、形質転換体は実質的にミトコンドリアプラスミドを維持することができなかったため、それらは廃棄されました。
我々は、図7Aに示されている陽性合成rho-コロニーを選択するための1つの一般的な戦略について説明した。この場合、合成ロー細胞中に存在するミトコンドリア構築物は、テスター株のミトコンドリアDNAと再結合するための数百のヌクレオチドを有する(例えば、合成ロー株のコンストラクトCOX1ΔC15は、テスターのミトコンドリアDNA上の変異遺伝子cox1D369Nと再結合する(図2D;または、変異遺伝子ARG8 を有する合成ロー株のcox1Δ::ARG8 mコンストラクト)m-1 in the tester's mitochondrial DNA(図6A)。しかし、目的の陽性合成rho細胞を選択するためのテスター株の利用可能性がない場合、それらを選択するための間接的なアプローチがある33。この場合、細菌プラスミドには、COX2やCOX3などのミトコンドリア遺伝子の断片も含まれている必要があります。テスター株には、ミトコンドリアのcox2またはcox3遺伝子の非機能的なコピーが含まれています。与えられた例では、細菌プラスミド中に存在するcox3フラグメントの配列は、テスターのミトコンドリア中に存在するcox3配列を補完し、組換え後に機能的なCOX3遺伝子を提供することができる。合成rho-細胞をテスター株と交差させた後、二倍体は、合成rho-細胞がミトコンドリア内に細菌プラスミドを含んでいる場合にのみ呼吸することができます(図7B)。
図8 は、サイトダクションプロセスを例示しています。ドナー株とアクセプター株は、それぞれロイシンとアデニンの補助栄養性を持っています。したがって、サイトダクション後、混合物をロイシンを欠く培地に播種し、ドナー細胞の増殖を防止しました。 これがマスタープレートです。この時点では、アクセプター株の核背景を持つ一倍体と散発的な二倍体のみが成長します。二倍体を除外するために、マスタープレートは、二倍体のみが成長できるアデニンを欠く媒体に複製されました。この例では、細胞導入後に得られるミトコンドリアDNAが変異し、意図された一倍体はエタノール/グリセロールの呼吸培地上で増殖できなくなります。したがって、マスタープレートは、テスター株の芝生を備えたYPDプレートに複製する必要があります。陽性の呼吸二倍体の位置は、マスタープレートから精製するコロニーを示します。最終的な純粋な菌株を得るには、2回の精製が必要です。ミトコンドリアの統合は、通常、関心領域の周辺領域のPCR増幅とシーケンシングによって裏付けられます。
最後に、ミトコンドリアゲノムの特定の遺伝子座に遺伝子を挿入することができます。例えば、レポーター遺伝子は、ミトコンドリア遺伝子のコード配列の3'末端に挿入したり、ミトコンドリア遺伝子のコード領域を置き換えたりすることができます(図9A)。しかし、遺伝子はミトコンドリアゲノムの非コード領域内の異所性部位にも挿入することができます。一般的に使用される部位は、COX2遺伝子の開始コドンの295 nt上流にあります。この非コード領域における変化は無害である13。異所性部位で遺伝子をうまく発現させるためには、ミトコンドリアのプロモーターとターミネーターに隣接している必要があります。COX2は、5'および3'の非翻訳配列が最も短い(5'UTRの73 nt、3' UTRの119 nt)ミトコンドリア遺伝子であるため、COX2の隣接配列が最も最適です(図9B)。この構造では、細菌プラスミドは、以下の特性を有する:テンプレートは、COX2コード領域を含むプラスミドであり、停止コドンの下流1120 ntおよびAUG開始コドンの上流670 ntを有し、pXPM5025と名付けられる。目的の遺伝子は、COX2 5'-UTRの73 ntとCOX2 3'-UTRの119 ntに隣接するように操作されています。その後、前述したように、非コード領域であるCOX2 AUG開始コドンの上流295 ntに挿入されました(図9B)。このプラスミド、ひいては結果として得られるミトコンドリアゲノムでは、COX2 5'および3'UTRが重複していることに注意してください。このプラスミドを照射した後、合成rho細胞は、COX2領域(cox2-62対立遺伝子)1が広範囲に欠失している受容体株とサイトダクションのために交配されます。サイトダクション中、合成rho-株のミトコンドリアプラスミドは、アクセプターからのミトコンドリアDNAと再結合します。結果として得られるミトコンドリアゲノムは、異所構造とWT COX2遺伝子を持っています。したがって、陽性コロニーは呼吸培地で増殖することができます(図9B)。
図5:高速微小発射体爆撃装置の概略図。 当研究室では、Biolistic-PDS-1000/He粒子送達装置(材料一覧表)を使用しています。略語:WPs =タングステン粒子。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:高速微小発射体変換プレートの例(A,B)衝撃後、プレートを30°Cで5〜7晩インキュベートしました。 汚染物質が成長した場合(青い矢印で示されています)、滅菌ヘラで切り取ることができます。選択マーカー培地(この場合は-URA)でプレートを複製した後、マスタープレートをテスター株と交配することにより、ミトコンドリアプラスミドの存在についても試験しました。この場合、テスター株は機能しない対立遺伝子ARG8m-1 1を持っています。2晩交配し、アルギニンを欠く培地(-ARG)でプレートを複製した後、4つの陽性コロニーが生じました(赤い矢印で示されています)。(C)陽性の合成rho-コロニーを-URA培地で再活性化して精製し、前述したようにレプリカ試験を行った。これらのプレートは、3回目の精製を表しています。(D)いくつかの陽性の合成rho-コロニーはミトコンドリア構造を失った。略語:mtDNA =ミトコンドリアDNA;-URA =ウラシルが不足している;-ARG =アルギニンが不足している。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:衝撃後に陽性合成rho-コロニーを選択する方法を示す図(A)細菌プラスミドには、ミトコンドリア遺伝子の非機能的な変異バージョンが含まれています。検出のために、合成rho-コロニーは、ミトコンドリアDNAの同じ遺伝子の異なる非機能的変異を含むテスター株と交配されます。交配後、変異型mtDNAは再結合し、補完によって機能的な遺伝子を回収することができます。ここでは、二倍体は、合成rho-ひずみもテスターも成長できない選択的な媒体上で成長します。(B)この場合、プラスミドは、ミトコンドリア遺伝子(すなわち、COX3の一部)の追加配列を含む。形質転換後、合成rho-株は、テスター株のCOX3変異を補完する能力によって選択されるため、二倍体のみが選択培地(すなわち、呼吸培地)上で成長できます。この方法は、目的の遺伝子のテスター株が利用できない場合に便利です。この場合の陽性合成rho-コロニーの検出は間接的です。略語:mtDNA = ミトコンドリアDNA。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ミトコンドリアDNAの標的遺伝子座にコンストラクトを組み込むためのサイトダクションの例。 交配および回収後、混合細胞および二核受精卵をロイシンを欠く培地に播種した。この場合、ドナー株は leu2,3-112対立遺伝子を有するため、この培地はドナーの増殖を防ぎます。このプレートは、二倍体のみが成長できる培地(-ADE)と、意図した突然変異を持つアクセプターが成長できる培地(赤い矢印)で、同じ培地(マスタープレート)で複製されました。この場合、ドナー細胞も受容体細胞も呼吸器培地上で増殖することはできません。テスター株の芝生と交配した後に得られた二倍体のみが、呼吸媒体上で成長することができます。これらの呼吸する二倍体コロニーは、マスタープレートからポジティブコロニーを選択して精製するためのガイドです。略語: -LEU = ロイシンが不足している;-ADE =アデニンが不足している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:変異したミトコンドリアコンストラクト(合成rho-株に存在する)をアクセプター株に統合する方法を示す図(A)この例では、アクセプター株は、目的の遺伝子からコドンを置き換えるARG8mレポーター遺伝子を運ぶ。合成rho-DNAには、この遺伝子の変異バージョンが含まれています。プラスミドとミトコンドリアDNAは、5'および3'隣接する領域を介して再結合し、ARG8mレポーターは目的の遺伝子の変異配列に置き換えられます。(B)外来遺伝子は、ミトコンドリアゲノム7,13,36の特定の領域に異所的に挿入することができる。この例では、遺伝子をCOX2遺伝子の上流295 ntの位置に導入できます。これはmtDNAの非コード領域です。目的の外来遺伝子は、COX2 5'UTRと3'UTRのそれぞれ73 ntと119 ntに隣接しています。この構造は、COX2遺伝子に加えて、5'および3'UTR領域の670 ntおよび1120 ntを含むプラスミドに挿入されます。合成rho-株(ドナー)は、ミトコンドリアでこの構築物を運びます。この場合、アクセプター株(XPM13)7は、cox2遺伝子(対立遺伝子cox2-62)1の有意な欠失を有する。サイトダクション後、ドナーとアクセプターからのミトコンドリアDNAが再結合します。COX2遺伝子が回復し、目的の遺伝子が異所性部位(COX2遺伝子の上流295nt)に挿入されます。略語:mtDNA =ミトコンドリアDNA;nt = ヌクレオチド。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 酵母株 | 遺伝子型 | リファレンス | ||
| NAB69 | Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0) | 1 | ||
| NB71の | Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1) | 1 | ||
| XPM10bの | Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m) | 7 | ||
| XPM209の | Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15) | 26 | ||
| XPM199の | Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61) | 26 | ||
| XPM13の | Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m) | 7 | ||
| L45 | Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N) | 28 | ||
表1:バイオリスティックな形質転換および細胞導入に用いる酵母株の例。
| 成長培地 | コンポーネント | ||
| YPD(イーピーディー) | 2%グルコース、2%バクトペプトン、1%酵母抽出物 | ||
| YPRの | 2%ラフィノース、2%バクトペプトン、1%酵母抽出物 | ||
| イペグ* | 3%グリセロール、3%エタノール*1、2%バクトペプトン、1%酵母エキス | ||
| ドロップアウトメディア | グルコース2%、酵母窒素塩基6.8%、(NH4)2SO4、ドロップアウトアミノ酸ミックス*2 | ||
| 爆撃メディア | グルコース5%、酵母窒素塩基6.8%、(NH4)2SO4、ソルビトール1 M、ドロップアウトアミノ酸ミックス*2,3 | ||
| *1 オートクレーブ後、培地が温かい状態でエタノールを添加してください。 | |||
| *2 アミノ酸配合量は、在庫状況やメーカー指定量により異なります。 | |||
| *3 衝撃培地は、酵母株により必要に応じてアミノ酸と窒素塩基を添加してください。組成が、選択に使用した2μLプラスミドの補助栄養性に特異的であることを確認してください。 | |||
表2:このプロトコルで使用される酵母増殖培地。
ディスカッション
本研究では、酵母 S.cerevisiae からミトコンドリアを成功裏に形質転換する方法について説明しました。このプロセスは、高速微小発射体衝撃から目的の酵母株の精製まで、合成rho- 株の精製のラウンド数に応じて、8~12週間かかります。この方法の重要なステップのいくつかは次のとおりです。まず、ミトコンドリア遺伝子コンストラクトの突然変異部位の周囲に付加される隣接領域が大きければ大きいほど、標的変異がうまく統合される確率が高くなります。隣接する領域の最小サイズは ~100 nt です。ただし、突然変異の両側で500を超えるNTを使用することを強く推奨します。第二に、形質転換後に合成rho-コロニーを選択する場合、3〜4ラウンド以下の精製が行われることが推奨されます。そうしないと、プラスミドをミトコンドリアに保持するための選択圧力がないため、最終的にミトコンドリア構築物が失われるリスクが高くなります。第三に、ユーザーや機器に害を与えないように、手順を開始する前に爆撃機のマニュアルを注意深く読む必要があります。この装置はデリケートで、高圧と真空を使用しています。
この手順の1つの制限は、これまでのところ、酵母と緑藻 C.reinhardtii のみがこの方法でミトコンドリアを形質転換する候補であることです。他の生物のミトコンドリアゲノムに部位特異的な突然変異を導入できれば、それは関連性があります。もう 1 つの制限は、同じセッションで多くの異なる構成体を変換するのが難しいことです。各構造に対して 6 つの変換を行い、それぞれをテスト、選択、および精製することをお勧めします。これにより、単一のミトコンドリア変異の純粋なrho- コロニーを得るためだけに、50プレート以上の培地が得られます。
これらの制限にもかかわらず、酵母のミトコンドリアゲノムを操作する能力は、呼吸複合体の生合成の多くの経路を理解するのに大きく貢献しています。このアプローチは、ミトコンドリア翻訳1,7,36,37をモニターおよび定量するためのレポーター遺伝子の導入、ミトコンドリア遺伝子の中断38、呼吸複合体のアセンブリシャペロンの同定39、ミトコンドリアの結合翻訳およびアセンブリ7,11,12,36のメカニズムの理解を深めるために使用できますそして、変異したミトコンドリア遺伝子の発現を追うときにサプレッサーを探す40。これまでのところ、哺乳類のミトコンドリアゲノムを操作する特定のアプローチは以前に報告されているが41、これらの生物に対してミトコンドリアDNAを形質転換する広範な方法は存在しない。
開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この出版物は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M] の支援を受けました。UPD は CONAHCYT フェロー (CVU:883299) です。光学顕微鏡の画像に関する技術的な支援を提供してくださったAriann Mendoza-Martínez博士に感謝いたします。バイオレンダリングライセンス:DU26OMVLUU(図2)。BK26TH9GXH(図3)。GD26TH80R5(図4)。PU26THARYD(図7)。ML26THAIFG(図 9)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 mLピペットチップ | Axygen | T-1000-B | |
| 1.5 mL マイクロチューブ | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μLピペットチップ | Axygen | T-10-C | |
| 15 mL コニカルボトムチューブ | アクシゲン | SCT-25ML-25-S | |
| 200 μLピペットチップ | Axygen | T-200-Y | |
| 50 mL 円錐底 チューブ | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| AfiII | ニューイングランド バイオラボ | R0520S | |
| アガロース | SeaKem | 50004 | |
| 分析天秤 | OHAUS | ARA520 | |
| オートクレーブ | タミー | ES-315 | |
| バクト寒天 | BD | 214010 | |
| バクトペプトン | BD | 211677 | |
| Biolisitic Macrocarrier holder | BIO-RAD | 1652322 | |
| ブンゼンバーナー | VWR | 89038-528 | |
| 塩化カルシウム | フィッシャー・サイエンティフィック | C79-500 | |
| CSM -ADE | フォーミディアム | DCS0049 | |
| CSM -ARG | フォーミディアム | DCS0059 | |
| CSM -LEU | フォーミディアム | DCS0099 | |
| CSM -URA | フォーミディアム | ||
| 培養ガラスフラスコ | KIMAX KIMBLE | 25615 | |
| 培養ガラス管 | パイレックス | 9820 | |
| デキストロース | BD | 215520 | |
| エタノール | JT ベーカー | 9000 | |
| 鉗子 | ミリポア | 620006 | |
| ガラスビーズ | シグマ | Z265926 | |
| ガラスハンドル | シグマ | S4647 | |
| グリセロール | JTベイ | カー2136-01 | |
| ヘリウムタンクグレード5(99.99%) | - | HSTaq | |
| キット | PCR BIO | ||
| 微量遠心分離機 | Eppendorf | 022620100 | |
| NdeI | New England BioLabs | R0111L | |
| オービタルシェーカー | ニューブランズウィック州 scientific | NB-G25 | |
| PCRチューブ | Axygen | PCR-02-C | |
| PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System | BIO-RAD | 165-2257 | |
| シャーレ (100X10) | BD | 252777 | |
| QIAprep スピン Miniprep | Qiagen | 27106 | |
| Raffinose | Formedium | RAF03 | |
| レプリカ プラター | Scienceware | Z363391 | |
| ラプチャー ディスク 1350 Psi | BIO-RAD | 1652330 | |
| ソルビトール | シグマ | S7547 | |
| スペルミジン | シグマ | S0266 | |
| T4 DNAリガーゼ | Thermo Scientific | EL0011 | |
| 組織培養ローテーター | Thermo Scientific | 88882015 | |
| タングステンマイクロキャリア M10 | BIO-RAD | 1652266 | |
| 100L /分容量 | |||
| ベルベットパッド | Bel-Art | H37848-0002 | |
| ボルテックス | サイエンティフインダストリー | ズSI-0236 | |
| ウッドアプリケータースティック | PROMA | 1820060 | |
| 酵母抽出物 | BD | 212750 | |
| なし酵母窒素ベース | BD291920 |
参考文献
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