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方法論記事

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

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DOI:

10.3791/66857

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2024年11月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Italian Liver Foundation, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

この記事について

サマリー

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro 長期培養に単離された肝細胞を使用する方法を示します。

要約

初代肝細胞は、 in vitro 肝臓関連研究に一般的に使用されるツールです。しかし、これらの細胞の維持は、培養における形態、生存率、および機能性の急速な損失のために、常に課題でした。長期培養への最近のアプローチは、肝臓の驚異的な自己再生能力に基づいて皿内の組織を再現できる in vitro ツールである3次元(3D)オルガノイドの生成です。公開されたプロトコルは、初代成体肝細胞(Hep-Orgs)から長期的な機能的3Dオルガノイドを取得するように設計されています。3Dオルガノイドの最先端ツールには、成体組織から細胞を分離する能力が必要であり、この最初のステップは高品質の最終結果を得るために重要です。1970年代に導入された2段階コラゲナーゼ灌流は、単一の肝細胞を得るための有効な手順です。本稿は、外科的処置のすべての重要なステップを説明することを目的としており、それによってラットモデルにおける初代肝細胞単離手順を最適化します。さらに、PREPAREガイドラインには特に注意が払われており、手順が成功する可能性を高め、高品質の結果を確保することができます。詳細なプロトコルにより、研究者は下流の作業をスピードアップおよび最適化して、初代成体ラット肝細胞から3Dオルガノイドを確立できます。2D肝細胞と比較して、Hep-Orgsは15日目でも生存可能で活発な増殖を示しており、長期的な可能性を示しています。

概要

初代肝細胞は、in vitro肝臓関連研究において重要かつ広く使用されているツールです。しかし、その拡大と維持は歴史的に困難であり、培養1で数日後に形態と機能を失う。2D培養は、特に、多角形の形状と分化した頂端膜と基底外側膜を持つ偏光構造を持つ肝細胞にとって制限条件です。実際、プレートへの肝細胞の接着は、細胞間および細胞と細胞外マトリックス(ECM)との間の相互作用が制限された平坦な細胞骨格をもたらし、分極と関与するシグナル伝達経路を減少させるため、プレートの正常な活性を妨げます2。

この方法の限界を回避するために、Dunn氏ら3 はまずコラーゲン二重層を使用しました。この培養方法は「サンドイッチ培養法」と呼ばれ、マトリックスの2つの層の間に初代肝細胞を播種することに基づいています。この方法には、長期培養、多角形形態の維持、新たに単離された肝細胞に匹敵する転写活性など、多くの利点があります4。同じ原理に基づく同様の方法、つまり、下敷きがマトリゲルで構成され、コラーゲンのオーバーレイが、確立された小管ネットワークの存在を証明しています5。

肝細胞増殖のためのサンドイッチ培養法の信頼性にもかかわらず、本研究では、ディッシュ内の組織を再現するために使用されるin vitroツールである3Dオルガノイド培養を確立し、個別化医療への潜在的な架け橋を形成することを楽しみにしています。これにより、疾患特異的な生物学的洞察の生成、分子標的の特定、薬物の試験、バイオバンクの確立、Organ-on-chip6などの革新的技術の新たな地平を切り開くことができます.初代肝細胞は、「ドーム」と呼ばれる半球状のマトリックス液滴に埋め込まれ、ドーム内のオルガノイドの堅牢な成長を可能にし、肝細胞成長因子(HGF)や上皮成長因子(EGF)などの可溶性因子が培地から流れ込むようにしました。これらの成長因子は、肝細胞の生存を確実にするためにシグナル伝達経路を直接活性化します7。肝臓オルガノイドは、通常、胚期または成体ラット、マウス、ヒト(およびイヌおよびネコ)の肝臓から単離された幹細胞/前駆細胞から得られる8。3Dコンフォメーションが幹細胞の成体肝細胞への分化を改善したとしても、このツールはまだ元の初代組織の成熟度を欠いています9。この問題を解決するために、2018年に、2つの異なるグループ9,10が同時に、成体初代マウス肝細胞(Hep-Orgsと呼ばれる)から始まる3D肝臓オルガノイドの長期培養を得るためのプロトコルを発表しました。彼らのプロトコルは、肝臓再生の増殖性損傷反応を再現し、部分肝切除術後に発生する高レベルの炎症性サイトカインで肝細胞を成長させます。実際、上記の研究は、肝細胞が損傷後12または胆管細胞の増殖が抑制されたときに、膠管状態に切り替わることを実証している13。その二能性は、オルガノイドのような複雑な構造にとって重要な細胞の可塑性を可能にします。したがって、これらのプロトコルは、初代肝細胞をin vitroで拡張できないという問題を克服する。

3Dオルガノイドの最先端ツールには、成体組織から細胞を分離する能力が必要であり、この最初のステップは高品質の最終結果を得るために重要です。3Dオルガノイドの調製は、最近開発された技術と見なすことができますが(オルガノイドの定義はわずか10 年前にLancaster 14とHuch15 によって造られたため)、2ステップコラゲナーゼ灌流は、1970年代にSeglenによって導入された古い手順です16。この分野の最新の出版物に焦点を当てると、Ng17 およびShen18 のプロトコルはラットで手順を実行するためのゴールドスタンダードと見なすことができ、マウスのCabral19 およびCharni-Natan20 のプロトコルは、手順を実行するためのゴールドスタンダードと見なすことができます。研究者が3Dオルガノイドを開発するために最適な細胞外マトリックス(ECM)と成長因子の選択に焦点を当てる一方で、不適切な外科的処置、低肝細胞の生存率と収量、高レベルの細菌汚染などの失敗に遭遇することは珍しくありません。これらの問題により、下流の実験が長くなり、次の実験に必要な動物の数が増えます。逆に、外科的および単離的処置が適切に設定されていれば、得られる生存可能な肝細胞の数が多いため、膨大な数のオルガノイドを調製することができ、動物の使用が制限されます。現在のプロトコルは、主に市販のソリューションを使用し、肝臓 での最適な灌流および消化ステップを保証する正確な門脈カニューレ挿入を最適化することにより、これらの問題に対処します。

動物研究の品質、再現性、翻訳性を向上させるために、PREPAREガイドライン「動物実験計画および実験手順:卓越性のための推奨事項21」を慎重に検討しました。これらの報告ガイドラインは、計画を通じて成功の可能性を高めようとしており、Russel and Burch の 3R (交換、削減、改良) の実装における重要なステップを表しています。PREPAREガイドラインは、個々の研究プロジェクトに応じて取り組むべき15の主要なトピックをカバーしています。プロジェクトの計画と準備中に焦点を当てたトピックについて説明します。

本研究は、ラットモデルでの手術の重要なステップを網羅的で詳細かつ重要なプロトコルで記述し、研究者が下流の作業をスピードアップおよび最適化できるようにすることを目的としています。最初にこれらのプロトコルに取り組んだとき、細菌汚染、肝臓消化効率の低さ、初代肝細胞の収量の低さ、肝細胞生存率の低さなどの問題があり、技術の成功に容易に影響を与える可能性があります。重要な特徴に対処し、解決する方法を示すこのプロトコルは、初代ラット肝細胞単離の手順を最適化しました。ラットの肝臓灌流とそれに続く成人の一次肝細胞の単離は、さまざまなアプリケーションの主要な準備ステップです。特に、このプロトコールは、高品質で生存率の高い成体肝細胞を良好な収量で得る必要があるすべての処置に適しています。プロトコールの結果は、肝臓の生理学および病理学を研究するための in vitro モデルを確立するのに適しています。

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プロトコル

すべての手続きと動物の飼育は、イタリア法および欧州共同体指令のガイドラインに従って行われました。この実験プロトコルは、2014年政令第26条第31条に基づき、地元の動物管理委員会とイタリア保健省(許可番号321/2022-PR)によって承認されました。

1. 動物用処置の準備

注:培地とバッファーの組成については 表1 を、商業的な詳細については 材料の表 を参照してください。

  1. ウォーターバスを42°Cで温め、灌流バッファーと1x PBSをウォーターバスに約20分間置きます。
    注:酵素感受性のため、消化バッファーは灌流手順が正常に開始された場合にのみ温められます。灌流処置中は、溶液をウォーターバスに保持します。
  2. ウィリアムズコンプリートミディアムとPBS + 3%P / Sを氷の上に置きます。
  3. 蠕動ポンプを準備し、チューブをガラス瓶とバブルトラップ(両方とも灌流バッファーで満たされた)に接続します。
  4. ポンプをプライミングしながら、チューブに温かい灌流バッファーを充填して空気を取り除き、残留エタノールを洗浄します(ポンプ速度を遅くします)。このステップは、ポンプの正しい動作とチューブの漏れの可能性を確認するためにも重要です。

2. 肝細胞単離の準備

  1. 動物の処置中に、次の器具をUV光にさらします:ペトリ皿100 mm、セルストレーナー100 μm、スクレーパーサイズM、大型ピンセット、氷用ビーカー、氷用トレイ。

3.最初の動物処置と麻酔

  1. 成体ラット(体重250-350 g、10-12週齢)に麻酔薬ミックス(キシラジンの最終濃度:22.5 mg / kg、ケタミンの最終濃度:112.5 mg / kg、約最終容量:0.8-1.0 mL)の腹腔内注射により麻酔をかけます。.
  2. ラットが有害な刺激に反応しなくなるまで、つま先をつまんで麻酔の深さを監視します。通常5分かかります。麻酔薬の投与量は、処置中の苦痛や苦痛のリスクを最小限に抑える深い外科的麻酔を保証します
    注:放血は、この実験で使用されたラットの安楽死の二次的な方法であり、動物が効果的に安楽死したことを保証します。
  3. 腹部を剃り、70%エタノールで洗浄することで、手術中の細菌汚染を減らします。
    注:これは非生存手術であるため、完全な無菌は維持されません。
  4. ラットを解剖トレイの中央に置き、針で手足を固定します。
  5. 下腹部の中心から胸郭まで皮膚と筋肉をU字型に切開し、皮膚をクランプして頭まで折りたたむと腸が露出します。
  6. 腸を動物の左側に慎重に移動させ、腹腔から出し、肝門脈と大静脈を露出させます。
  7. ペンチを使用して、門脈の下に綿糸を通し、静脈自体を囲むように、互いに1cmずつ2つの結び目を準備します。
    注:黒い糸は視覚化しやすくなります。
  8. 1x PBSに溶解したヘパリン100〜150IU(総量300μL)を大静脈に注入し、血液凝固を防ぎます。

4.カニューレ挿入と肝臓灌流

  1. ポンプを低速(1 mL / min未満の流量)でオンにします。
  2. 18 Gの血管カテーテルを門脈の糸の高さで、静脈に対して平らな角度で挿入します。
  3. 内側の針を手動で取り外して、カニューレを静脈に残します。その中を血液が流れ、プラグを満たし、次のステップで閉じ込められた気泡を回避します。
  4. 灌流バッファーがチューブ内を流れている間に、ルアーロックコネクタを使用してCボタンを押してカニューレを出口端に接続します。
  5. この時点で、静脈に入る前に、静脈内のカテーテルの周りに1つ、カテーテルの周りに1つずつ結び目を結び、チューブを正しい位置に安定させます。
  6. 大静脈を切って血液を排出させます。肝臓が2〜3秒で急速に(数秒)腫れて漂白し始めることを確認します。これにより、灌流バッファーが肝臓を正しく流れていることが確認されます。
    注:一部の葉が赤いままの場合は、血管カテーテルが深く配置されすぎています。赤い斑点しかない場合は、肝臓を軽くたたいて、特定のポイントでの灌流を助けることができます。開いた腹部に1xPBSを注ぎ、血液を動かし、漏れがないかチェックします。
  7. ポンプの流量をゆっくりと10 mL / minに増やし、少なくとも10分間維持して、血液から肝臓を洗浄できるようにします。
  8. 灌流中、綿棒で大静脈に圧力を10秒間隔で加えます:肝臓がクランプ時に腫れ、解放時にリラックスすることを確認します。定期的に(5〜10回)圧力を繰り返し、肝臓の腫れと弛緩を確認します。
    注:この手順は、灌流を視覚的に検証するための重要なチェックポイントとして機能します。これは、高い肝細胞の活力を確保し、最終収量を最大化するために不可欠でした。このプロセスを積極的に検証することにより、バッファーは肝臓血管系のすべての部分に効果的に到達できますが、これは受動的な血液清浄だけでは達成できません。

5.肝臓の消化

  1. 灌流後、流れを中断したりチューブ内の気泡を避けたりすることなく、事前に温めた消化バッファーに切り替えます。
    注意: 一時的に流量を減らすと、この通過を実行するのに役立ちます。分解バッファーにはフェノールレッドが含まれており、灌流バッファーから消化バッファーへの切り替えを視覚化しやすくなります。
  2. ポンプ速度を20 mL / minに上げ、定期的に綿棒で押して肝臓の腫れとリラクゼーションを実現します。.
  3. このステップ(約15分)の後、肝臓がますますどろどろになることを確認します。この時点で、針を取り外すことができ、ポンプは停止します。
  4. 肝臓のカプセルは消化後に壊れやすいため、肝臓を優しく慎重に解剖します:鉗子で葉の間の中央結合組織をつかみます。他の臓器へのすべての接続を切断し、肝臓を持ち上げます。
  5. 肝臓を洗い、事前に冷却したPBS + 3%P / S溶液に数秒間浸します。次に、事前に冷却したウィリアムの完全な培地含有チューブに入れます。
    注:放血と死は、大静脈を介した灌流を確実にします。動物の死亡の確認は、肝臓が摘出され、横隔膜が完全に解剖された瞬間に誘発された気胸から来ており、検査時には呼吸と心拍が機能しなくなります。

6. 肝細胞の精製

  1. 生物学的フードの下で、肝臓を100mmのシャーレに移し、氷で満たされたトレイの上に15mLの冷たいウィリアムズコンプリートメディウムを入れます。
  2. スクレーパーで臓器を強く押して、培地中の細胞を放出します。
    注:消化段階が正しく実行されていれば、細胞の放出は容易で、肝臓にあまり圧力をかける必要はありません。肝臓を細かく切らないでください。そのままにしておきます。肝臓を培地に浸したままにしておくと、細胞の放出が改善されます。
  3. 培地を含む細胞を採取し、100 μmフィルターでろ過しながら、滅菌済みの円錐管に移します。このろ過により、結合組織や未消化の組織片を除去することができます。
  4. ペトリ皿の砕けた肝臓に約15mLの冷たいウィリアムズ完全培地を注ぎ、より多くの細胞を放出するのを助けます。手順 6.2 と 6.3 を繰り返します。
  5. すべてのセルが解放されるまで、ポイント6.4を少なくとも1回繰り返します。必要に応じて、媒体をより円錐形のチューブに分割し、複数の100μmフィルターを使用します。
    注:肝細胞が放出された後、ろ過する前に、培地は肝細胞の存在により不透明に見えるはずです。残りの肝臓は繊維状に見えるはずで、廃棄されます。
  6. 肝細胞を含むろ過培地を50 x g で4°C、3分間、低速ブレーキで遠心分離します。
    注:肝細胞は他の肝細胞よりも密度が高いです。遠心分離力が低いため、ペレットには肝細胞のみが含まれ、他の細胞は上清に残ります。
  7. 細胞ペレットを乱さずに上清を捨てます。氷のように冷えたウィリアムズ完全培地約40mLをチューブに静かに加え、ゆっくりと2〜3回上下させて細胞ペレットを再懸濁します。
    注:細胞ペレットは、細胞の損傷を避けるために慎重に再懸濁する必要があります。
  8. 50 x g で4°Cで3分間遠心分離します。
    注:最初の試行では、次のステップに進む前に、2回目の遠心分離後に1:10トリパンブルーアッセイで生存細胞をカウントします。これにより、すべての細胞が死んでいる場合に培地と時間を浪費することを避けることができます。
  9. 上清を捨て、細胞ペレットを氷冷したウィリアムズ完全培地25mLに再懸濁します。
  10. 25 mLの90%密度グラジエント溶液をチューブに加え、穏やかに混合します。
    注:密度勾配溶液は、生存可能な肝細胞を死んだ肝細胞および細胞破片からその密度に基づいて分離します。
  11. 200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 チューブの底部には、生存可能な肝細胞に対応する可視のペレットを取得し、死んだ肝細胞で構成される勾配の上部に透明な層を確保する必要があります。
    注:ペレットがまったくない場合は、渦巻き状にして溶液を再度混合し、遠心分離を繰り返してみてください。
  12. グラジエントの上から死細胞層を吸引し、ペレットと共に1〜2mLの培地を残します。
  13. ペレットをウィリアムズ完全培地30〜40mLに再懸濁します。
    注:手順全体では、25mLの血清ピペットのみを使用してください。小口径のピペットは、肝細胞の生存率を低下させる可能性があります。+4°Cを維持するために、すべてのステップを氷上で行う必要があります。
  14. 200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引します。

7. 肝細胞培養とRNAコレクション

  1. 細胞計数に適量の培地を添加します。1:10トリパンブルーで細胞生存率をカウントします。
  2. 2D肝細胞培養
    1. 500,000細胞/ウェルの濃度で細胞を500,000細胞/ウェルの6ウェル皿に、予め加温したウィリアムズ完全培地でコラーゲンコーティングした細胞プレートにプレートします。
    2. 細胞培養物を、95%の空気、5%のCO2 、37°Cの加湿インキュベーターに入れます。
    3. 4時間後、培地を新しい予温済みウィリアムの完全な培地に変更します。
    4. 細胞をインキュベーターに保管します。媒体は毎日交換してください。
    5. レーティング前(0日目)および培養1日目から3日目に、RNA抽出用の試薬に初代肝細胞を採取します。
    6. メーカーのプロトコールに従ってRNAを抽出し、それをcDNAに逆転写して、RT-qPCRによる肝マーカー遺伝子の評価を行います。プライマーリストを 表2に示します。
  3. 3D長期肝細胞培養の場合:
    1. 細胞を20μL中の1,000〜10,000細胞の濃度で冷清純マトリックスに再懸濁します。
      注:マトリックスバブルを作らないようにしてください。
    2. 予め冷却したピペットチップを使用して、マトリックスを含む細胞滴を予熱した細胞培養プレートにプレートします。
    3. プレートを逆さまにして、細胞培養インキュベーターに20〜30分間放置します。
    4. それを上にして、Pengの研究22に従って、予め温めた3D長期肝細胞培地と特定の培養培地を追加します。細胞をインキュベーターに保管します。
    5. 3D長期肝細胞培地を2〜3日ごとに交換します。
    6. 少なくとも14日間の培養後、Hep-Orgsareはマトリックスから分離され、生存可能なHep-OrgsはトリパンブルーおよびEdU増殖アッセイによって評価され、Pengの研究に従って継代されます。

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結果

セットアップ手順(ステップ6.13)の終了時に、ラットの約300gの肝臓からの単離ごとに最大1×108 細胞の細胞収量を得ました。78%から97%の細胞生存率は、トリパンブルーカウンティングによって確立されました。

以前の研究1,18,19ですでに述べられているように、培養中の初代肝細胞は、その形態、肝臓特有の機能を失い、数日以内に死滅する。

文献23,24では、初代成体肝細胞がすぐに立方体六角形の形態を失い、数日以内に「線維芽細胞様」の形状に変わり、死滅することがよく知られている。図1は、コラーゲンコーティングされたプレートにプレーティングした...

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ディスカッション

3Dオルガノイドは、個別化医療のフロンティアであり、長期的な肝細胞培養を可能にします。この革新的な技術の品質には、生存可能な初代肝細胞の良好な収率と、適切に実施された肝灌流および肝細胞の単離が必要です。この古い手順はまだ広く使用されています。ただし、それは困難な場合があるさまざまなステップで構成されています。この手術に臨むにあたり、細菌汚染、肝臓消化効率の低さ、初代肝細胞の収量の低さ、肝細胞の生存率の低さなど、技術の成功に容易に影響を及ぼす重大な問題に直面しました。ゴールデンスタンダードプロトコル17,18から始めて、ここでは一般的な問題を克服する方法を強調し、一次ラット肝細胞単離の最も重要なステップを明確にし、ラットモデルでの技術の成功に容易に影響を与える可能性のある散在するヒントを要約します。肝灌流の手順は非常に困難であり、オペレーターからの正確な専門知識が必要ですが、初代肝細胞の収量、完全性、生存率、および機能性の点で高品質の結果を保証します。これ...

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開示事項

すべての著者は、利益相反のすべてを明らかにしています。

謝辞

トリエステ大学ソレンティーノラボのDavide Selvestrel博士とGiovanni Sorrentino教授には、EdU増殖アッセイの実施にご協力いただき、感謝いたします。この作業は、Banca d'Italiaの アドホック 助成金と学内FIF助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A83-01- ALK5阻害剤IVツインヘリックス T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect リアルタイム PCR 解析システム  バイオ・ラッド
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 イメージングキットThermofisher ScientificC10499
コラーゲン、I型、ラットテール由来の溶液MerckC3867-1VL
デキサメタゾン メルクD4902
EGFメルク E9644
ウシ胎児血清 (FBS)ユーロクロンECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEサーモフィッシャー サイエンティフィA1413202
ヘパリンナトリウム 25000 IU/5 mlB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech 100-39H 
インスリン-トランスフェリン-セレン溶液100倍 サーモフィッシャーサイエンティフィ41400045
L-グルタミン溶液ユーロクロンECB3000D
肝臓消化培地 サーモフィッシャーサイエンティフィ 17703-034
肝臓灌流培地サーモフィッシャー サイエンティフィ17701038
N2 サプリメントサーモフィッシャー サイエンティフィサイエンティフィック 17502048
N-アセチルシステインメルクA9165
ニコチンアミドメルク N-0636
非必須アミノ酸MerckM7145
NormocinAurogeneant-nr-1
PBS 緩衝液 1XPanReac AppliChemA0964,9050
ペニシリン - ストレプトマイシン溶液 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
蠕動ポンプイスマテック&トレード; MS-4/12 レグロ デジタルポンプ
TNFaペプロテック 300-01A
TRI試薬メルクT9424
チューブ イスマテック&トレード;  ID.2,79mm
ウィリアムズ E ミディアム、グルタミンなしサーモフィッシャー サイエンティフィ31415029
Y27632ツイン ヘリックスT1725
ック ックックック ック ック

参考文献

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