方法論記事

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

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DOI：

10.3791/66862

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2024年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。

要約

小胞体(ER)-ミトコンドリア接触部位は、Ca2+ および脂質恒常性の調節、ミトコンドリアダイナミクス、オートファゴソームおよびミトファゴソームの生合成、アポトーシスなど、細胞の健康および恒常性において重要な役割を果たします。正常なERとミトコンドリアの結合を維持できないことは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝性痙性対麻痺など、多くの神経変性疾患に関与しています。ERとミトコンドリアの接触の調節不全がどのように細胞死につながるか、そしてこれらの接触を正常なレベルに修復することで神経変性疾患を改善できるかどうかを調査することは非常に重要です。したがって、これらの接触のレベルを測定する改良されたアッセイは、これらの疾患の病原性メカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります。最終的には、シンプルで信頼性の高いアッセイを確立することで、新しい治療戦略の開発が容易になります。ここでは、生細胞内のER-ミトコンドリア接触レベルを定量的に測定するためのスプリットルシフェラーゼアッセイについて説明します。このアッセイは、これらの接触の病態生理学的役割を研究するためだけでなく、ハイスループットスクリーニングにおけるそれらのモジュレーターの同定にも使用できます。

概要

小胞体とミトコンドリアとの間の相互作用は、細胞の恒常性と生存に不可欠です1,2,3,4。以前の証拠は、ER-ミトコンドリア接触部位におけるあらゆる種類の混乱または調節不全が、いくつかの神経変性疾患、代謝性疾患、および心血管疾患、ならびに癌5,6,7,8,9,10に寄与する可能性があることを示しています。例えば、ミトコンドリアへのCa2+の取り込みが異常に増加すると、アルツハイマー病の一部のモデルでよく見られるミトコンドリア透過性遷移孔が開き、細胞死につながる可能性があります5,11。同様に、ERとミトコンドリアの接触の減少は、筋萎縮性側索硬化症のモデルに見られるように、ATP産生の減少とCa2+摂取の障害をもたらす可能性があります5,11,12。ERとミトコンドリアの接触の領域でより多くの研究が行われるにつれて、これらの接触に影響を与える可能性のある追加の疾患関連タンパク質と遺伝子が発見されています。ERとミトコンドリアの接触部位の役割を示す現在の知識と証拠にもかかわらず、これらの接触がどのように細胞機能の喪失、そして最終的には細胞死につながるかを解明するには、まだ多くの研究が必要です。

2つの膜の近接性、構造形態、および2つの細胞小器官接触部位3,4,13間の距離を評価するために、さまざまな方法が開発されてきました。ER-ミトコンドリア結合をモニターするアプローチには、蛍光マーカーベースのイメージング14,15、FRETレポーターベースのイメージング16、および分外蛍光プローブベースのイメージング17,18が含まれ、落射蛍光および共焦点顕微鏡を使用する。超解像顕微鏡法および原子分解能顕微鏡法も、オルガネラ間接触を正確に視覚化するための強力なツールであるが、接触部位分析におけるそれらの利用は、高度に専用の顕微鏡と技術的専門知識を必要とするため、依然として限られている19。さらに、透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型電子顕微鏡(SEM)、および電子線トモグラフィー(ET)やクライオ電子顕微鏡などの他のEM技術は、接触部位の高解像度の超微細構造イメージングを提供するため、一般的に使用されていますが、これは他の実験的アプローチでは探索が不可能なことが多い20,21,22。.しかし、これらのEMベースの方法は、非常にロースループットの手法であり、化学固定手順の影響も受ける可能性があります。最近では、近接ラベリングベースの方法を使用して、接触部位を検出したり、新しい接触部位タンパク質を同定したりしています。例えば、近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、オルガネラの近接性を定量するために使用されてきた23,24一方、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX)アッセイの改訂版は、新しい接触部位タンパク質の同定に利用されてきた25,26。上記のすべての方法には、オルガネラ間の接触を検出する上で長所と固有の制限があることを認識することが重要です。したがって、オルガネラ接触部位の徹底的な解釈を得るためには、異なる技術の組み合わせが必要です。

以前に、ERミトコンドリア膜接触のレベルを監視するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を確立しました(図1A)24,26,27。簡単に言うと、Renillaルシフェラーゼの各分割された半分は、ERまたはミトコンドリアの標的配列と結合されています。一緒にトランスフェクトすると、酵素の各分割された半分はERまたはミトコンドリア膜のいずれかで発現します。ERとミトコンドリアが互いに近接して配置されると、分割された半分が一緒になり、ルシフェラーゼ活性を持つ酵素全体が再構成されます。split-Rluc コンストラクトでは、初期テンプレートに pBAD/Myc-His27 の Renilla luciferase 8 (Rluc8) を使用しました。分裂部位(アミノ酸91と92の間)は、以前の報告27に基づいて決定された。Rluc8のN末端半分については、PCR27により、R luc8のアミノ酸1-91のDNA配列をFLAGタグの3'末端とマウスAKAP1ミトコンドリア標的配列のpcDNA3.1 TOPOベクターに融合させた。小胞体を標的とするC末端の半分については、アミノ酸92-311をコードするDNA配列をmycタグの5'末端と酵母UBC6 ER局在配列に融合させた。ここでは、Renillaルシフェラーゼの分割半分が同じプロモーターの下で単一ベクター(pCAG)で発現し、その後、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列であるT2Aが2つの分割半分の間に挿入されるときに2つのフラグメントに切断されるように、split-R lucプラスミドコンストラクトをアップグレードしました(図1B)。プラスミドDNAマップおよび配列は、補足ファイル1および補足図S1に記載されています。このシステムを用いて、3つの化学物質(アクチン重合に関与するGTPaseを阻害する物質)がER-ミトコンドリアの接触に及ぼす影響を測定しました。このsplit-Rlucアッセイは、細胞小器官間接触モジュレーター24のハイスループットスクリーニングのためのシンプルでありながら堅牢なアッセイシステムです。

プロトコル

1. 細胞の維持と播種(1日目)

  1. HEK293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)(100 mm培養皿)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む細胞培養培地で、37°C、5%CO2の加湿インキュベーターで維持します。
  2. 開始する前に、顕微鏡で観察してプレートの合流点を確認してください。細胞が約80〜90%の密度に達したら、培地を取り出し、10 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄することにより、6ウェル培養プレートで細胞を播種する準備をします。
  3. 培養皿からDPBSを取り出し、0.05%トリプシン-EDTAフェノールレッド1mLで細胞を処理します。3分間インキュベートした後、インキュベーターからプレートを取り出し、9 mLの培地(DMEMと10% FBS)を加えてトリプシン反応を停止します。ゆっくりとピペットで上下に動かし、プレートに付着したままの細胞が取り除かれていることを確認します。細胞懸濁液を50mLチューブに移します。
  4. 300 × g で室温で5分間遠心分離します。培地を取り出し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な培地(DMEM + 10% FBS)で再懸濁します。
  5. 血球計算盤を使用して細胞の数を数えます。
    1. チューブを静かに渦巻かせることで、細胞が均一に分布するようにします。直ちに10 μLの細胞懸濁液を取り出し、1.7 mLの微量遠心チューブに入れます。同じチューブに90μLの培地を加えます。
    2. 細胞と培地を穏やかに混合した後、細胞懸濁液を取り、カバーガラスの下で静かにピペッティングして、血球計算盤の各チャンバーに10μLを適用します。
    3. 10倍対物レンズを使用して、顕微鏡下で血球計算盤のグリッド線に焦点を合わせます。焦点を合わせたら、ハンドタリーカウンターを使用して、16個の正方形(4 x 4個の正方形)の1セットのセルの数を数えます。16個の正方形の4つのセットがすべてカウントされるまで繰り返します。
    4. 平均細胞数(16個の角のそれぞれから)を取り、それに10:5を掛けて、細胞数/mLの合計を計算します。
      注:血球計算盤を使用して細胞をカウントする代わりに、製造元の指示に従って自動セルカウンターを使用することができます。
  6. 細胞計数が完了したら、6ウェルプレートで細胞を7.5 × 105細胞/ ウェル密度で2 mLの培地/ウェルでプレートする準備をします。50 mLのチューブに、必要な量の細胞と13 mLの培地を加えます。希釈した細胞懸濁液2 mLを6つのウェルのそれぞれに分注します。
    1. めっきする前に、C1V1 = C2V2を用いて、7.5 × 105細胞/ウェルに必要な細胞数を計算します。ここで、C1は初期細胞数(細胞数/mL)、V1は初期細胞懸濁液から必要な容量、C2は所望の標的細胞密度(細胞数/mL)、 V2は、細胞播種に必要な最終量です。
  7. 分注後、プレートの四方を軽くたたいて細胞を広げ、5% CO2 を加えた 37 °C の加湿インキュベーターに一晩置きます。

2. ポリエチレンイミン(PEI)を介した細胞トランスフェクションとトランスフェクション後の細胞播種(2日目)

  1. インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、各ウェルから既存の培地を吸引します。ウェルあたり2 mLの新鮮な培地を加えます。
  2. TEバッファー(pH 8.0)に溶解したsplit-RlucプラスミドDNA(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)を細胞にトランスフェクションします。
    1. 各ウェルについて、DNA(750 ng)とPEI(DNA/PEIの比率=1:3)を1.7 mLの微量遠心チューブ内の200 μLのDMEMに混合します。レベル 8 の DNA/PEI を約 2 秒間すばやくボルテックスして、それらがよく混ざり合って複合体を形成することを確認します。その後、ミニ遠心分離機で短時間(<3秒)スピンダウンします。
    2. DNA/PEIの混合物を室温で15分間インキュベートし、細胞を含む6ウェルプレートの培地の表面に混合物を滴下して加えます。プレートを軽くたたいて(混合物を均等に分散させるため)、加湿インキュベーターで37°C、5%CO2 で6時間インキュベートします。
  3. インキュベート中に、まず70 μLのPDL(DPBSで50 μg/mL)を各ウェルに加え、加湿インキュベーターで5% CO 2を5%CO2 で少なくとも1時間インキュベートして、Poly-D-Lysine(PDL)コーティング96ウェルプレートを調製します。PDL溶液を取り出し、各ウェルを100 μLのDPBSで2回洗浄します。2回目の洗浄の最後に、残りのDPBSがすべて除去されていることを確認してください。
  4. トランスフェクション後6時間で、トランスフェクションした細胞をPDLでコーティングした96ウェルプレートに播種する準備をします。
    1. トランスフェクションした細胞を含む6ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引し、各ウェルを2 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを取り外した後、0.05%トリプシン-EDTAフェノールレッドを350μL加え、1〜2分間インキュベートします。トリプシン反応を止めるには、各ウェルに1.7 mLの培地を加えます。
    2. 細胞を培地とともに50 mLチューブに移した後、卓上遠心分離機でチューブを300 × g で5分間回転させます。培地を吸引し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な培地で再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞の数をカウントします(ステップ1.5で説明)。
  5. PDLでコーティングした96ウェルプレートに、100μLの培地に4×104 細胞/ウェルの密度で細胞を播種します。このためには、50 mLのチューブに、必要な量の細胞(計算については下記参照)と適切な量の培地(合計容量12 mL)を追加します。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈した細胞懸濁液100 μLを96ウェルのそれぞれに分注します。細胞を加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で18時間インキュベートします。
    1. C1V1 = C2V2 を使用して、4 × 104 cells/well に必要な細胞数を計算します。ここで、C1 は初期細胞数 (細胞数/mL)、V1 は初期細胞懸濁液から必要な容量、C2 は目的の標的細胞密度 (細胞数/mL)、V2 は細胞播種に必要な最終容量です。

3. 生細胞における化学処理とルシフェラーゼアッセイ(3日目)

  1. 1.7 mLのマイクロチューブに、50 μM Rhosin(DMSOに50 mMストック)、25 μM Ehop-016(DMSOに25 mMストック)、50 μM ZCL278(DMSOに50 mMストック)の3種類のフレッシュ溶液を、各ストック溶液(50 mM Rhosin、25 mM Ehop-016、50 mL ZCL278、すべてDMSO中)を必要量(50 μL/ウェル×ウェル数)の培地に1:1,000で希釈して調製します。各溶液に、最終濃度25 μMまで1:2,000に希釈した Renilla ルシフェラーゼ用の生細胞基質(DMSO中の50 mMストック)を添加します。0.5、5、50 μM ZCL278溶液を調製するには、培養培地で最初の50 μM ZCL278を使用して段階希釈を行います。
    注:化学的インキュベーション時間が1〜1.5時間未満で必要な場合は、細胞を生細胞基質( Renilla ルシフェラーゼ用)と1〜1.5時間予備インキュベートしてから、各化学物質で処理することができます。化学物質と生細胞基質を同時に添加することで、ハイスループットな薬物スクリーニングのためのプロトコールを最適化します。
  2. トランスフェクションされた細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルから培地を取り出し、各ウェルに50 μLの化学培地と基質培地の混合物を加えます。
  3. 細胞を1時間、2時間、または5時間インキュベートした後、インキュベーターから培養プレートを取り出し、発光プレートリーダーにロードして発光を測定します。
    1. 開始する前に、プレートリーダーがオンになっていることを確認してください。マイクロプレートリーダーソフトウェアにアクセスし、[ New Session]をクリックして新しいファイルを作成します。プレートリーダー の温度 を 37°C に設定するには、 インキュベーターをクリックし、温度オプションをチェックして、 37°Cと入力します。 [プレート レイアウト] で [不明] オプションを選択し、クリックしてドラッグして測定するウェルを指定します。
    2. [プロトコル] で [Luminescence] をクリックし、デフォルト設定のままにします。セットアップが終了したら、蓋を外した状態でプレートをプレートリーダーにロードし、[プレートインの実行]を選択します。[開始]をクリックすると、ファイルの保存ウィンドウが表示されます。ファイルの名前を変更して [保存] をクリックし、デスクトップに保存します。
      注:発光は、生細胞基質の添加後>24時間にわたって生成され続けます。
  4. 読み取りが完了したら、プレートリーダーからプレートを取り外し、[プレートインを実行]をクリックしてリーダーを元に戻します。完了したら、プレートを加湿インキュベーター(37°C、5%CO2)に戻し、次の読み取りまで待ちます。
  5. 終了したら、発光データをグラフプログラムに転送して、各変数(化学物質や濃度など)(x軸)の相対発光単位(RLU)(y軸)をプロットし、データを分析します。

4. split-Rluc assayの他法によるバリデーション

  1. 近接ライゲーションアッセイ(PLA)、透過型電子顕微鏡法、およびミトコンドリアカルシウム取り込みモニタリングなどの他のアッセイを実施して、前述の24のsplit-Rlucアッセイから得られた結果を検証する。

結果

我々は、上記のプロトコルを使用して、特定のGTPaseを阻害することが知られている3つの化合物を添加したときのER-ミトコンドリア接触のレベルを測定しました。CDC42、RHO、およびRACは、活性化されるとアクチン重合28を促進するGTPアーゼであり、それぞれZCL278、Rhosin、およびEhop-016によって阻害される24。split-RlucでトランスフェクションしたHEK293T細胞をDMSO(コントロール)、ZCL278(50 μM)、Rhosin(50 μM)、またはEhop-016(25 μM)で処理し、1時間、2時間、および5時間インキュベートしました。プレートリーダーを使用して、定義された時点でのsplit-Rluc活性を測定しました(図2)。

Rhosin(RHO GTPase阻害剤)処理細胞は、1時間、2時間、および5時間の処理で、対照DMSO処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性に有意な変化を示さなかった（p > 0.9999、p = 0.6956、p > 0.9999)）(図2)。これらの結果は、RhosinがER-ミトコンドリアの接触に影響を与えないことを示しており、RHO GTPase活性が2つの細胞小器官間の接触の調節に関与していないことを示唆しています。

対照的に、RAC GTPase阻害剤Ehop-016は、治療の1時間、2時間、および5時間でDMSOよりも有意に低いルシフェラーゼ活性を示しました(p = 0.0106、p = 0.0009、p = 0.0024)(図2)。これらのデータは、細胞内の正常なER-ミトコンドリア相互作用を維持するためには、RAC GTPase活性が必要であることを示しています。

最後に、CDC42阻害剤ZCL278は、ルシフェラーゼ活性の最も劇的な変化を示しました(図2)。ZCL278で処理した細胞は、対照DMSOと比較してルシフェラーゼ活性の有意な低下を示し、3つの時点すべてを通じて最も低いp値を示し、全体を通してp<0.0001を維持しました。我々のデータは、CDC42 GTPase活性がZCL278によってブロックされると、ERミトコンドリア結合の強力な阻害を示しており、これは、split-ルシフェラーゼの各半分を別々にコードする2つのベクターと共トランスフェクトした細胞で実施された元のsplit-Rlucアッセイを使用した以前の報告と一致しています24。

ZCL278の顕著な結果を考えると、特に他のGTPase阻害剤と比較した場合、ZCL278活性は、DMSOコントロールに対してさまざまな濃度[0.5μM、5μM、50μM]でさらに試験されました。治療後1時間、2時間、および5時間で測定されたルシフェラーゼ活性は、用量依存的な反応を示しました。0.5 μMのZCL278はルシフェラーゼ活性に対する影響が最も弱くなり、5 μMはより強く、50 μMは再構成酵素活性の最も強い低下を示しました(図3)。まとめると、私たちの結果は、ZCL278が用量依存的にsplit-Rluc活性をダウンレギュレートし、時間が経つにつれて、高濃度のZCL278(CDC42阻害剤)は、低濃度と比較して対照DMSOと比較して有意な変化を示すことを示しています。

当社のsplit-Rlucアッセイを検証する方法として、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、透過型電子顕微鏡(TEM)、ミトコンドリアカルシウム取り込みモニタリングなどの確立された独立したアッセイを実施することができます(図4およびデータは示されていません)24。β2アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールは、ER-ミトコンドリア接触プロモーター(図4A)のスクリーニングで同定された化合物の1つであり、イソプロテレノール治療時のsplit-Rlucのルシフェラーゼ活性が、PLAシグナル強度の変化とミトコンドリアカルシウムの取り込み(図4B-E)によって示されるように、ERミトコンドリア接触の増強により増加したことを確認しました。

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図1:split-Rluc再アセンブリアッセイ (A)Split-RLucアッセイの概略図。ミトコンドリアと小胞体との間に膜接触がない場合、Mito-R lucNとRlucC-ERは相互作用せず、したがってRluc8活性はありません。しかし、Mito-R lucNとRlucC-ERとの間の相互作用は、ER膜とミトコンドリア膜が接触することで、完全な酵素活性をもたらし、これは基質の発光への変換によって検出されます。(B)split-Rluc DNAコンストラクト(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)の模式図。(C)HEK293T細胞におけるsplit-Rlucアッセイのワークフローの図。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;IRES、内部リボソームエントリーサイト。rb_glob pA、ウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナル;T2Aは、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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(A-C) DMSO(コントロール)、Rhosin [50 μM]、Ehop-016 [25 μM]、または ZCL278 [50 μM] 処理後 (各群で n = 12) の (A) 1 時間後、(B) 2 時間後、または (C) 5 時間後に再構成されたルシフェラーゼ活性。すべてのデータは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。p 値は、p > 0.05 (ns)、p ≤ 0.05 (*)、p ≤ 0.01 (**)、p ≤ 0.001 (***)、p ≤ 0.0001 (****) として報告されます。エラーバーは±測定の平均誤差標準誤差を示します。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;RLU = 相対光単位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:ZCL278で処理した細胞内のER-Mito接触のレベルを測定するsplit-R luc活性。(A-C) DMSO(コントロール)またはZCL278の(0.5 μM]、5 μM]、または[50 μM]濃度(各群でn = 12)の(A)1時間後、(B)2時間後、または(C)5時間後にルシフェラーゼ活性を再構成した。すべてのデータは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。p 値は、p > 0.05 (ns)、p ≤ 0.05 (*)、p ≤ 0.01 (**)、p ≤ 0.001 (***)、p ≤ 0.0001 (****) として報告されます。エラーバーは±測定の平均誤差標準誤差を示します。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;RLU = 相対光単位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:split-Rlucアッセイの検証。 (A)ER-ミトコンドリア接触プロモーターの化合物スクリーニングで同定された、イソプロテレノールを含む11種類の薬物でHEK293T細胞を処理した後のsplit-Rluc活性の定量化の例。(B)DMSOまたはイソプロテレノール(1 μM)で処理したHeLa細胞における近接ライゲーションアッセイの一例。PLA信号(赤)は、ERと水戸の密接な接触を示します。Sec61-GFP(緑):ERにラベルを付けます。DAPI(青):核。(C)AにおけるPLAシグナルの定量化(n = 4、それぞれ77〜97個の細胞を用いた実験。Mann-Whitney test)。(D)ヒスタミン(100μM)に反応したミトコンドリアカルシウムの取り込み。DMSOまたはイソプロテレノール処理細胞で2.5秒ごとにプロットされたMito-R-GECO1蛍光強度変化(平均は複数のHeLa細胞で取得)。矢印はヒスタミン添加を示す。(E)左: Aにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みの最大ピーク。対応のない両側 t検定(n = 10、DMOS;14、イソプロテレノール)。右:ミトコンドリアのカルシウム取り込み率( Aと同様、7.5〜12.5秒)。マンホイットニー検定(n = 12、DMSO;11、イソプロテレノール)。この図は、Lim et al.24から修正されています。略語:RLU =相対光単位;PLA = 近接ライゲーションアッセイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ER-ミトコンドリア接触の現在の技術の要約。 各方法の利点と制限の一覧。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherryのDNA配列(PDFおよびGBK形式)を含むZipファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherryの地図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

私たちは、ER-ミトコンドリアカップリングのレベルを定量するために、split-Renillaルシフェラーゼ8再構成アッセイ(split-Rlucアッセイ)を使用しました。本研究では、ルシフェラーゼの各分割半分が同量の発現を確保するために、各split-Rluc成分(MitoRlucNおよびRlucCER)およびThosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列をコードする単一のベクター、pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherryを生成することにより、元のsplit-Rlucコンストラクト24を改変した。レニージャ・ルシフェラーゼの基質として、セレンテラジンの代わりに、修飾された生細胞基質(セレンテラジンの保護誘導体;材料表参照)が以下の理由により使用された。まず、水性環境で自己発光を生じるセレンテラジン(特に血清中での自己発光が悪い)とは異なり、この保護された誘導体は、10%の血清を含む培地では非常に低い自己発光(しばしば検出できない)を生成するため、そのシグナル対バックグラウンド比はコエレンテラジンによって生成されるものよりも高くなります。第二に、セレンテラジンとは異なり、基質を添加した直後に発光が最も強くなるが、非常に急速に減少し始めるのに対し、修飾された生基質によって生成される発光は、基質添加の約1.5時間後に達成可能な最高点に到達し、24時間以上連続したままである。このような反応速度の変化により、マルチウェルプレートでの発光の測定が容易になり、ハイスループットスクリーニングに非常に役立ちます。さらに、保護された基板が長期的に一定のままであることによって生成される発光により、さまざまな時点で使用される複数のサンプルセット(サンプルごとに1つのポイント)を測定するのではなく、複数の時点で単一のサンプルセットを測定することができます。

この更新バージョンのsplit-Rlucコンストラクトを使用して、RHO、RAC、およびCDC42 GTPaseがER-Mitoコンタクト形成に関与しているかどうかをテストしました。split-Rluc成分を発現するHEK293T細胞に、GTPase阻害剤であるRhosin(RHO阻害剤)、Ehop-016(RAC阻害剤)、ZCL278(CDC42阻害剤)を添加しました。私たちのアッセイ結果は、ZCL278がER-ミトコンドリア接触形成の最も強力な阻害剤であり、Ehop-016が次に重要な阻害剤であることを示していますが、Rhosinはそれらの接触に影響を与えませんでした。これらのデータは、CDC42を介したアクチン重合(およびRACを介したアクチン重合)が細胞内のER-ミトコンドリア接触を維持するために必要であるのに対し、RHOを介したアクチン重合はおそらく重要ではないことを示唆しています。

効率を最大限に高めるためには、このプロトコルで考慮しなければならない多くの重要なステップがあります。何よりもまず、DNAが多すぎると細胞に毒性影響を与える可能性があるため、トランスフェクションされるコンストラクトの量をテストする必要があります。次に、細胞の数は測定されるルシフェラーゼレベルに大きな影響を与える可能性があるため、プロトコルに記載されているものに近い細胞密度を維持することは、アッセイ時までに細胞の理想的で一貫した80%の密度を確保するために重要です。化学物質への曝露時間中に細胞がコンフルエントに達すると、コンフルエントな細胞は一般的にタンパク質の産生が少なくなるため、発光が減少する可能性があります。第三に、化学物質や基質の添加中に細胞が剥がれ落ちないように、Poly-D-Lysineでプレコートされた96ウェルプレートを使用します。第四に、このプロトコールで使用される化合物(基質を含む)については、アリコート中で-20°C以下(-70°C)に保ち、解凍した細胞に直ちに添加することが重要です。最後に、ルシフェラーゼ活性に影響を与える可能性のある温度変動のため、プレートの最も内側のウェルを使用し、プレートの外側に裏打ちされているウェルを無視することを選択するのが最善かもしれません。

split-Rluc8アッセイは、ERミトコンドリアの接触を測定するための簡単で堅牢な方法を提供し、ハイスループットスクリーニングに最適です。ただし、注意が必要な制限事項がいくつかあります。細胞生理学では、コンストラクトDNAの絶え間ない過剰発現による細胞挙動の変化という問題があります。現在、私たちは、絶え間ない過剰発現による細胞生理学の潜在的な変化に対抗するための誘導性プロモーターを用いた構築物に取り組んでいます。さらに、このアッセイをスクリーニング目的で使用する場合、偽陽性の結果は、i)発現レベル、ii)前記タンパク質断片のオルガネラ標的化効率、またはiii)再構成されたルシフェラーゼの酵素活性に対する薬物の間接的な影響から生じる可能性があることに留意すべきである。これらの制限により、このアッセイは、結果をさらに検証するために、他の方法と組み合わせてテストする必要があります。表1は、これらの接触部位をテストするさまざまな方法とともに、それらの長所と短所を示しています。私たちは、タンパク質間の近接を検出する近接ライゲーションアッセイ(PLA)や、細胞小器官の接触を明確に可視化できる透過型電子顕微鏡法(TEM)などの他の方法を利用し、split-Rlucアッセイと組み合わせて、結果として生じるRLUの変化が実際にER-ミトコンドリア接触部位の変化によるものであることを検証しました(図4およびLim et al.24).また、ER-ミトコンドリア接触の変化と、カルシウム移動やミトコンドリア分裂などの機能パラメータとの間に相関関係があることも示しました(図4およびLim et al.24)。split-Rluc活性に対する薬物の効果がsplit-Rluc遺伝子の発現増加によるものではないことを確認するために、転写阻害剤または翻訳阻害剤を以前に行ったように薬物と一緒に追加することができます24。

トランスフェクション率が低い培養中の分化ニューロンにsplit-Rlucシステムを適用するには、ウイルス感染(split-Rluc成分を発現するレンチウイルスによる)が代替アプローチになります。その使用を拡張して、細胞(例えば、ヒト人工多能性幹細胞)が、ウイルス感染またはCRSPRを介した遺伝子編集によって、split-Rluc、MitoRlucN 、 およびRlucCERの各成分を安定して発現するように操作されるスクリーニングシステムを作成することができます。しかし、安定した発現システムを得るためには、split-Rlucシステムによりよく耐える細胞には選択圧が存在する可能性があり、これは正常な生理学的状態を表していない可能性があることに注意する必要があります。この適応または選択により、実験結果にバイアスが生じる可能性があります。

要約すると、上記のいくつかの制限にもかかわらず、split-Rlucは、以前の薬物スクリーニング研究で示されているように、細胞内のオルガネラ間接触を調節する小分子または遺伝子のハイスループットスクリーニングのための迅速、簡単、かつ強力なアッセイです24。

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者らは、原稿の批判的なレビューについて、Jeffrey Golden博士(Cedars-Sinai Medical Center)に感謝しています。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS, R01NS113516)から一部資金提供を受けた。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7 mL SafeSeal 微量遠心チューブSorenson16070
6 ウェルプレート TC 処理済みUSA ScientificCC7682-7506
10 mL ピペットチップ OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μLピペットチップOneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μL 斜めの先端 OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL ポリプロピレン コニカル チューブFalcon352070
96 ウェル フリッパー マイクロチューブ ラックThermoFisher Scientific8770-11
96 ウェル プレート TC 処理済み USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC処理ディッシュUSA ScientificCC7682-3394
1250 μLのヒントOneTipUSAサイエンティフィック1112-1720
遠心分離機5910 RI - 冷蔵遠心分離機エッペンドルフ5943000131
ジメチルスルホキシド、無水、≥99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM、高グルコース ThermoFisher Scientific11965092
DPBS、カルシウム、マグネシウムなしThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248DMSO に溶解; -70 °C;C
EnduRen Live Cell SubstratePromegaE6481アリコートを-70°Cで保存します。C
エッペンドルフ 2-20 μLピペットEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μLピペットEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µLピペットEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12チャンネルEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μLピペットエッペンドルフ 
ウシ胎児血清、認定、USDA承認地域ThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 インキュベーター、184 L、ポリッシュステンレススチールThermoFisher Scientific381
ハンドタリーカウンターSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting ChamberLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
顕微鏡ツァイスAxiovert 25 CFL
ミニ遠心分離ベンチマークサイエンティフィックC1012
マルチチューブラック50mlコニカル、15mlコニカル、およびマイクロ遠心チューブ用Boekel Scientific120008
PEI MAX-トランスフェクショングレードリニアポリエチレンイミン塩酸塩(MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poly-D-lysine 臭化水素酸塩Sigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin 塩酸塩Bio-Techne Tocris5003DMSO に溶解; -70 °C で保存;C
トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25300054
Varioskan LUX マルチモードマイクロプレートリーダーサーモフィッシャーサイエンティフィックVL0000D0
ボルテックサーモフィッシャーサイエンティフィック2215365レベル 8
VWR 真空吸引システムVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794DMSOに溶解し、-70°Cで保存します。ハ
3123000055機ス

参考文献

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生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ
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