幹細胞送達を用いた脊髄損傷の併用療法の開発

サマリー

この研究では、脊髄損傷修復のための脂肪由来幹細胞の再生促進挙動を調査し、活用するために利用できる神経模倣複合ハイドロゲルが開発され、特徴付けられました。

要約

外傷性脊髄損傷 (SCI) は、損傷部位の下に永久的な感覚運動障害を誘発します。米国では約25万人が罹患しており、公衆衛生上の懸念は計り知れません。効果的な治療法を提供するための研究が行われてきました。ただし、SCIは損傷部位の複雑な性質のため、依然として不治の病と考えられています。薬物送達、細胞移植、注射可能な生体材料など、さまざまな戦略が検討されていますが、1つの戦略だけでは再生の有効性が制限されます。そのため、最近、損傷の多面的な特徴を標的とすることができる併用療法が注目を集めています。細胞外マトリックス(ECM)は、SCIの細胞移植の有効性を高める可能性があることが示されています。この目的のために、脱細胞化脊髄(dSC)と坐骨神経(dSN)からなる3Dハイドロゲルを異なる比率で開発し、特性評価しました。dSCおよびdSNの組織学的解析により、細胞および核成分の除去が確認され、脱細胞化後も天然の組織構造が保持されました。その後、複合ハイドロゲルを異なる体積比で作製し、濁度ゲル化速度、機械的特性、および埋め込まれたヒト脂肪由来幹細胞(hASC)の生存率の分析を行いました。ハイドロゲルと脱細胞化脊髄マトリックスの比率の違いにより、機械的特性に有意差は認められませんでした。ゲルに埋め込まれたヒトASCは、14日間の培養を通じて生存率を維持しました。この研究は、神経特異的なECMおよび再生促進性間葉系幹細胞を提示する組織工学的コンビナトリアルハイドロゲルを生成する手段を提供します。このプラットフォームは、SCI後の神経再生戦略と将来の研究に関する新たな洞察を提供することができます。

概要

約296,000人が外傷性SCIに苦しんでおり、毎年約18,000人の新しいSCI症例が米国で発生しています¹。外傷性SCIは、一般的に転倒、銃創、車両事故、スポーツ活動によって引き起こされ、多くの場合、損傷部位の下の感覚運動機能の永久的な喪失を引き起こします。SCI治療の推定生涯費用は、個人あたり100万ドルから500万ドルの範囲であり、平均余命は大幅に短くなっています¹。しかし、SCIはまだよく理解されておらず、主に損傷後の複雑な病態生理学的結果のために、ほとんどが不治の病^です2。細胞移植や生体材料ベースの足場など、さまざまな戦略が研究されています。細胞や生体材料の移植は可能性を示していますが、SCIの多面的な性質は、組み合わせアプローチがより有益である可能性があることを示唆しています³。その結果、多くの組み合わせ戦略が研究され、個々のコンポーネントよりも優れた治療効果が実証されています。しかし、細胞や薬物を送達するための新しい生体材料を提供するためには、さらなる研究が必要です³。

天然ハイドロゲルを作製するための有望なアプローチの1つは、組織の脱細胞化です。脱細胞化のプロセスでは、イオン性、非イオン性、物理的、および組み合わせ的な方法を利用して、ECM成分を維持しながら、すべてまたはほとんどの細胞および核物質を除去します。細胞成分のすべてまたは大部分を除去することにより、ECM由来のハイドロゲルは、移植/注入後の宿主に対する免疫反応性が低くなります⁴。脱細胞化組織の品質を評価するために測定すべきいくつかのパラメータがあります:細胞/核内容物の除去、機械的特性、ECMの保存。有害な免疫反応を避けるために、次の基準が確立されています:1)ECM乾燥重量mgあたり50 ngの二本鎖DNA(dsDNA)未満、2)DNA断片の長さが200 bp未満、および3)4'6-ジアミジノ-2-フェヌイリンドール(DAPI)⁵で染色された目に見える核物質がほとんどまたはまったくないこと。機械的特性は、引張試験、圧縮試験、および/またはレオロジー試験によって定量化でき、それらは元の組織⁶と同様であるべきである。さらに、タンパク質の保存は、脱細胞化組織の主要成分、例えば、ラミニン、グリコサミノグリカン(GAG)、脊髄のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)に焦点を当てたプロテオミクスまたは定量アッセイによって評価することができます^7,8。検証済みのECM由来ハイドロゲルは、細胞ベースの治療を支援するために、さまざまな種類の細胞で再細胞化することができます⁹。

SCI修復については、シュワン細胞、嗅覚被覆細胞、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)、神経幹細胞/前駆細胞など、さまざまな細胞タイプが研究されています10,11,12。しかし、これらの細胞の臨床使用は、倫理的な懸念、隣接する細胞/組織とのまばらな統合、高収量のための組織源の欠如、自己更新が不可能であること、および/または増殖能力が限られていることなどにより、制限されている13,14,15。これらの細胞型とは異なり、ヒト脂肪由来MSC(hASC)は、脂肪吸引物を用いて低侵襲的に容易に単離でき、多数の細胞を得ることができるため、魅力的な候補である¹⁶。さらに、hASCは、神経保護、血管新生、創傷治癒、組織再生、および免疫抑制の可能性を有する成長因子およびサイトカインを分泌する能力を有する17,18,19,20,21。

説明したように、複数の研究が実施されてきました 22,23,24、そしてそれらから多くのことが学ばれてきましたが、SCIの不均一な特性は、機能回復を促進する上での有効性を制限しています。そのため、SCIの治療効果を高めるために、組み合わせアプローチが提案されています。本研究では、脱細胞化した脊髄と坐骨神経を組み合わせて複合ハイドロゲルを作製し、3次元(3D)hASC培養を行いました。脱細胞化の成功は、組織学的およびDNA分析によって確認され、神経複合ヒドロゲルの異なる比率は、ゲル化速度論および圧縮試験によって特徴付けられました。神経複合ハイドロゲルにおけるhASCの生存率を調査し、このハイドロゲルが3D細胞培養プラットフォームとして利用できることを証明しました。

プロトコル

ブタの組織は商業的に入手されたため、動物倫理委員会による承認は必要ありませんでした。

1. ブタの脊髄の脱細胞化(推定期間:5日間)

注:以前に確立されたプロトコルを使用して、^修飾25,26を使用して脱細胞化を実行します。すべての手順は、特に明記されていない限り、室温の滅菌バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。すべての溶液は、ボトルトップフィルター(0.2 μmの細孔サイズ)を使用してオートクレーブ滅菌ボトルに滅菌ろ過する必要があります。37°Cで実施する手順は、インキュベーター内または37°Cに設定された清潔なオーブン内で行うことができます。

1. 脱細胞化溶液の調製
   注:すべての溶液は1 Lで計算され、ユーザーは実験のニーズに応じて最終的な必要量を調整する必要がある場合があります。
   1. 500 mLの0.05%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を500 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、0.025%トリプシン/ EDTAを作成します。.
   2. 10% Triton X-100 300 mL を PBS 700 mL で希釈して、3% Triton X-100 を調製します。0.56 gのNaCl、1.31 gのNaH₂PO₄H₂O、および10.85 gのHNa₂O₄P·7H₂Oを1 Lの脱イオン水に混合して、100 mM Na/50 mMのphosバッファーを調製します。
   3. 1Lの脱イオン水に32.4gのスクロースを混ぜて、1Mのスクロースを作ります。40 gのデオキシコール酸ナトリウム(SD)を1 Lの脱イオン水に混合して、4%SD溶液を作ります。6.7 mLの15%過酢酸を993.3 mLの4%エタノールで希釈します。.
2. ブタの脊髄の調製
   注:脊髄は溶液なしで冷凍され、使用するまで-80°Cに保たれました。
   1. 脊髄を冷蔵庫で4°Cで18〜24時間解凍してから脱細胞化します。滅菌ハサミを使用して、硬膜を慎重に取り除きます。
   2. 脊髄を小片(長さ約1cm)に切ります。1個を15mLのチューブに入れるか、最大3個を50mLのチューブに入れます。
3. 脊髄の脱細胞化
   注:各ステップの後、脱細胞化溶液を大きなビーカーに手動で注ぎ、廃棄します。小型のオートクレーブ可能なステンレス製ストレーナーは、各ステップに必要な組織を失うことなく、脱細胞化溶液を廃棄するために使用できます。脊髄は、特に明記されていない限り、83rpmで攪拌しました。
   1. 脊髄を脱イオン水で4°Cおよび60rpmで18〜24時間すすぎます。
   2. 脊髄を0.025%トリプシン/EDTAで37°C、40rpmで1時間すすぎます。次に、脊髄をPBSで15分間、2回すすぎます。
   3. 脊髄を3% Triton X-100で2時間洗い流します。脊髄を100 mM Na/50 mM phosバッファーで15分間、2回すすぎます。
   4. 脊髄を1Mショ糖で1時間洗い流します。次に、脊髄を脱イオン水で1時間すすぎます。
   5. 脊髄を4%SDで2時間すすぎます。次に、脊髄を100 mM Na/50 mM phosバッファーで15分間、2回すすぎます。
   6. 脊髄を4%エタノール中の0.1%過酢酸で4時間すすぎます。次に、脊髄をPBSで1時間すすぎます。
   7. 脊髄を脱イオン水で1時間、2回すすぎます。次に、脊髄をPBSで1時間すすぎます。
   8. 脊髄を0.01 mbarおよび-56°Cで3日間凍結乾燥し、使用するまで乾燥させて保存します。

2. ブタ坐骨神経の脱細胞化(推定期間:5日間)

注:以前に確立されたプロトコル²⁷を使用して脱細胞化を実行します。すべての手順は、特に明記されていない限り、室温の滅菌バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。すべての溶液は、ボトルトップフィルター(0.2 μmの細孔サイズ)を使用してオートクレーブ滅菌ボトルに滅菌ろ過する必要があります。37°Cで実施する手順は、インキュベーター内または37°Cに設定された清潔なオーブン内で行うことができます。

1. 脱細胞化溶液の調製
   注:すべての溶液は1 Lで計算され、ユーザーは実験のニーズに応じて最終的な必要量を調整する必要がある場合があります。
   1. 1 Lの脱イオン水に1.86 gのNaCl、0.262 gのd NaH₂PO₄H₂O、および2.17 gのHNa₂O₄P·7H₂Oを混合して、50 mM Na/10 mM phosバッファーを調製します。
   2. 125 mM スルホベタイン-10 (SB-10) 溶液を調製するには、38.4 g の SB-10 を 1 L の 50 mM Na/10 mM phos バッファーに混合します。
   3. 50 mM Na/10 mM phos緩衝液1 L中に30 gのSDと0.24 gのSB-16を混合して、3 % SD/0.6 mM sulfobetaine-16 (SB-16)溶液を調製します。
2. ブタ坐骨神経の調製
   注:坐骨神経はPBSで凍結され、使用まで-80°Cに保たれました。
   1. 脱細胞化の18〜24時間前に冷蔵庫で4°Cで坐骨神経を解凍します。
   2. 坐骨神経を小片(長さ約1cm)に切ります。1個を15mLのチューブに入れるか、最大3個を50mLのチューブに入れます。
3. 坐骨神経の脱細胞化
   注:各ステップの後、脱細胞化溶液は廃棄される大きなビーカーに手動で注がれ、小さなオートクレーブ可能なステンレス鋼ストレーナーを使用して、各ステップに必要な組織を失うことなく脱細胞化溶液を廃棄することができます。坐骨神経は、特に明記されていない限り、15rpmで動揺されました。
   1. 坐骨神経を脱イオン水で7時間洗い流します。次に、坐骨神経を 125 mM スルホベタイン-10 (SB-10) で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 18 時間洗い流します。
   2. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間洗い流します。次に、坐骨神経を 3% SD/0.6 mM スルホベタイン-16 (SB-16) で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 2 時間すすぎます。
   3. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間、3回すすぎます。次に、坐骨神経を 125 mM SB-10 で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 7 時間すすぎます。
   4. 坐骨神経を100 mM Na/50 mM phos緩衝液で15分間洗い流します。次に、坐骨神経を 3% SD/0.6 mM SB-16 で 50 mM Na/10 mM phos バッファーで 1.5 時間すすぎます。
   5. 坐骨神経を50 mM Na/10 mM phos緩衝液で15分間、3回洗い流します。次に、坐骨神経を75 U / mLのデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)で3時間攪拌せずにすすぎます。.
   6. 坐骨神経を50 mM Na/10 mM phosバッファーで1時間、3回すすぎます。次に、坐骨神経を0.2 U / mLのコンドロイチナーゼABCで37°Cで16時間攪拌せずにすすぎます。.
   7. 坐骨神経をPBSで3時間、3回すすぎます。坐骨神経を0.01 mbarおよび-56°Cで3日間凍結乾燥し、使用するまで乾燥させて保存します。

3. 脱細胞化組織の消化と複合ハイドロゲルの作製(所要時間:4日)

1. 脱細胞化した組織をハサミまたはホモジナイザーを使用して粉末に切り刻むか粉砕します。ツールを滅菌して、オートクレーブを使用して121°Cで45分間組織を刻むか粉砕します。エチレンオキシド法も適用可能です。
2. 1 mg/mL の濃度で 1 mg/mL のペプシンを含む 0.01 N 塩酸 (HCl) 溶液で組織を別々に消化します。脱細胞化脊髄と坐骨神経の推定重量は、それぞれ1個あたり50〜100mgと100〜150mgです。
3. マグネットバーを置き、500rpm、4°Cで少なくとも4日間攪拌してプレゲル溶液を生成します。
4. 坐骨神経と脊髄プレゲルを次の体積比で混合します:2:1、1:1、および1:2。1 Nの水酸化ナトリウム(NaOH)とHClを使用してpH 7.4を調整し、M199培地と1x PBSを使用して目的の濃度に希釈します。37°Cで30分間インキュベートします。
   注:NaOHを一度に1μLずつ加えます。M199培地は、pHが7.4のときに淡いピンク色に変わるため、pH指示薬として使用できますが、pHレベルを確認するためにpHストリップを使用する必要があります。

4. 脱細胞化の検証

1. ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E;所要時間:8日)
   注:各すすぎステップの後、溶液は手動で大きなビーカーに注がれて廃棄されます。
   1. 新鮮で脱細胞化された脊髄と坐骨神経を3.7%ホルムアルデヒドに4°Cで18時間固定します。15mLのチューブに1個を入れます。
   2. ホルムアルデヒドを除去し、組織を10%ショ糖に1日間置きます。10%スクロースを取り除き、組織を30%スクロースに6日間置きます。
   3. 適切なサイズのクライオモールドを最適な切断温度(OCT)で半分まで充填します。脱細胞化した組織を留置し、OCTで覆い、OCTを1日間吸収させます。
   4. 1日後、組織を-80°Cで一晩凍結します。 クライオスタットを使用して、組織を厚さ10μmで凍結切片します。
   5. 1x PBSで5分間、2回すすぎます。その後、水道水で5分間すすぎます。
   6. ヘマトキシリン溶液で1分間染色します。水道水で1分間、3回すすいでください。
   7. エオシン溶液で1分間染色します。95%エタノールで1分間、2回、100%エタノールで1分間、3回すすぎます。
   8. キシレンで1分、2分、1分ですすいでください。スライドを5分間乾かします。
   9. 綿棒を使用して、3〜4滴のジブチルフタル酸ポリスチレンキシレン(DPX)マウント溶液をスライドに滴下します。カバーガラスをDPXで覆われたスライドの上に置きます。スライドを一晩乾かします。
2. DNA解析(所要時間:1時間)
   1. 脱細胞化組織と凍結乾燥組織を秤量します。製造元の指示に従って、市販のキットを使用してDNAを単離および定量します。

5. 複合ハイドロゲルの特性評価

1. ゲル化濁度試験(推定時間:1時間)
   1. 氷上の96ウェルプレートの各ウェルに100 μLのプレゲル溶液を入れます。プレートリーダーを使用して、2分ごとに405nmの吸光度を45分間読み取ります。
   2. 次の式を使用して正規化された吸光度を計算します。
      (吸光度 -_初期吸光度) / (_最大吸光度 -_初期吸光度)
   3. 曲線の傾きと、50%と95%のゲル化を達成するまでの時間、それぞれt_1/2 とt₉₅を計算します。
2. 圧縮試験(推定時間:ハイドロゲルあたり1分)
   1. 12 mg/mL の濃度で、直径 8 mm、高さ 2 mm の複合ハイドロゲルを作製します。
   2. レオメータを使用して、ステンレス製平行プレート間に250 Nの負荷でサンプルを圧縮し、サンプル高さ/分の10 %のひずみ速度で圧縮します。レオメータの読み取り値を提供するソフトウェアは、力を加えてヒドロゲルが壊れるまでひずみを測定することにより、応力-ひずみ曲線を提供します。
   3. ヤング率は、応力-ひずみ曲線の線形領域の傾きから計算します。

6. 神経複合ハイドロゲルにおけるヒトASCの三次元培養

1. 3次元(3D)プラットフォームの準備(所要時間:3時間)
   1. シリコンウェーハにSU-8フォトレジストをエッチングし、深さ200μm、直径4mmの円形パターンを作製します。
   2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)塩基と硬化剤を10:1の比率で混合します。混合物をシリコンウェーハに注ぎ、20分間放置して、PDMSベースと硬化剤の混合から発生するすべての気泡を取り除きます。
   3. オーブンに入れ、70°Cで2時間硬化させます。 硬化したPDMSシートを型から外し、直径8mmのバイオプシーパンチを使用してパンチアウトし、PDMSマイクロウェルを作製します。
   4. マイクロウェルを96ウェルプレートに入れ、ウェルプレートをエアプラズマクリーナーに入れてPDMSマイクロウェルを滅菌します。
   5. PDMSマイクロウェルを1%ポリエチレンイミン(PEI)および0.1%グルタルアルデヒド(GA)でそれぞれ10分間および20分間官能基化します。マイクロウェルを蒸留水で2回洗浄します。
2. hASCの調製(予定時間:7日)
   1. hASC増殖培地(hASCs基礎培地にウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Pen-strep)を添加)で2〜5継代、継代細胞をコンフルエントになるまで培養します。血球計算盤またはセルカウンターを使用して細胞数を継代し、計算します。
3. ASCを含んだ神経複合ハイドロゲル(推定時間:2時間)
   1. 坐骨神経と脊髄プレゲルを2:1、1:1、1:2の体積比で混合し、坐骨神経プレゲルを混合せずに脊髄のみのハイドロゲルを調製します。
   2. M199培地を添加し、1 N NaOHおよびHClを使用してpH 7.4に調整し、hASCを増殖培地と共にプレゲル内に1 x 10⁶ 細胞/mLの密度で再懸濁します。
      注:M199および細胞懸濁液の量は、プレゲルの10%であるべきである。
   3. 1x PBSを使用してプレゲルを12 mg/mLに希釈します。プレゲルをマイクロウェルに置き、30分間インキュベートします。ASCを多く含むハイドロゲルをhASC増殖培地で培養します。
4. 細胞生存率試験(推定時間:1日あたり4時間)
   1. 製造元の指示に従って、市販の試薬を使用して生存率試験溶液を調製します。
   2. 1日目、4日目、7日目、14日目に培地を吸引します。試薬をウェルに添加し、製造元の指示に従って37°Cで3時間インキュベートします。
   3. プレートリーダーを使用して、560/590 nmの励起/発光で蛍光を読み取ります。次の式を使用して差の割合を計算します。
      [(蛍光_試料-蛍光_ブランク)/蛍光_ブランク]×100

結果

脱細胞化組織は、わずかに変更を加えた以前に確立されたプロトコルを使用して調製されました^26,27。脱細胞化、凍結乾燥、消化後、SN:SC = 2:1、1:1、1:2の比率の神経複合ハイドロゲル、および脊髄のみのハイドロゲルを作製しました(図1)。核成分の除去は、H&E染色によって確認されました(図2A)。脱細胞化を定量的に評価するために、ECM内で残留DNAを測定しました。新鮮硬膜のdsDNA含量は132.6 ± 21.3 ng dsDNA/mg乾燥組織であったのに対し、新鮮および脱細胞化脊髄実質は、それぞれ22.6 ± 8.3 ng dsDNA/mg乾燥組織および23.74 ± 6.69 ng dsDNA/mg乾燥組織を含んでいました(図2B)。それは、脱細胞化の前に硬膜を切除することを示していました。新鮮坐骨神経と脱細胞化坐骨神経のdsDNAの量は、それぞれ222.5 ±ng 42.65 and 0.63 ng dsDNA/mg乾燥組織でした(図2C)。

神経複合ヒドロゲルのゲル化速度論を評価して、ゲル化の速度(S)と最終濁度の50%および95%に達するまでの時間(t_1/2 およびt₉₅)を決定しました。ゲル化速度論は、すべてのハイドロゲル基でシグモイド形状を示しました(図3A)。すべてのハイドロゲル基におけるゲル化速度(S)は、互いに有意差はありませんでした。最終濁度の半分に達するのに必要な時間は、SN:SC= 2:1、1:1_、1:2、および脊髄のみのハイドロゲルで、それぞれ11.32 ± 0.57分、13.33 ± 0.6分、15.7 ± 0.92分、17.23 ± 1.13分でした。最終濁度の95%に達するのに必要な時間_t95は、SN:SC= 2:1、1:1、1:2、脊髄のみのハイドロゲルで、それぞれ13.8 ± 0.83分、15.53 ± 0.83分、18.38 ± 0.79分、19.62 ± 1.27でした。これらの結果は、坐骨神経含有量が多いハイドロゲルが定常状態により早く到達し、坐骨神経ECMがハイドロゲルの集合を促進する可能性があることを示しています。圧縮試験の結果は、脊髄含有量の多いハイドロゲルが剛性を高める傾向を示しました。それにもかかわらず、複合ハイドロゲルのすべての異なる比率で有意差はありませんでした(図3B)。

最後に、すべてのハイドロゲル基におけるhASCの細胞生存率を決定するために、 図4に示すように、微細加工されたPDMSマイクロウェルを使用して3D培養を設定しました。14日間の培養全体を通じて、ASCの生存率は、市販の細胞培養培地ベースの比色および蛍光代謝アッセイを使用して測定され、読み取り値とのパーセンテージ差は、1日目、4日目、7日目、および14日目の4つの異なる時点で計算されました(図5)。パーセンテージ差の値は、時点が増加するにつれて増加し、脊髄のみのハイドロゲルの値は、1日目、4日目、および14日目に他のグループよりも低かった。これらのデータを総合すると、hASCの生存率は、細胞増殖と細胞代謝活性の増加により、培養期間とともに増加したことが示唆されます。

図1:神経複合ハイドロゲルの作製。 ブタの脊髄と坐骨神経を脱細胞化し、凍結乾燥し、消化してプレゲル溶液を得ました。坐骨神経と脊髄のプレゲル溶液を2:1、1:1、1:2の割合で混合し、脊髄のみのプレジェルも調製した。すべてのプレゲル溶液を37°Cでインキュベートして、神経複合ヒドロゲルを作製しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:脱細胞化の検証 (A)新鮮および脱細胞化したブタの脊髄および坐骨神経のH&E染色。矢印は、組織内の細胞の存在を示します。スケールバー = ワイドビュー画像の場合は 1 mm、ズームイン画像の場合は 500 μm (ズームイン脱細胞化坐骨神経画像の場合は 200 μm)。(B)新鮮硬膜、実質、および脱細胞化脊髄のDNA分析(それぞれn = 10、16、および6)。(C)新鮮坐骨神経と脱細胞化坐骨神経のDNA分析(それぞれn = 8と3)。エラーバーは標準偏差を表します。統計分析は、(B)のテューキーの事後検定と(C)のt検定を使用して、一元配置分散分析によって行われました。略語: ns = 重要ではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:神経複合ハイドロゲルの特性評価(A)神経複合ハイドロゲルの正規化吸光度(n = 5)。(B)脱細胞化脊髄および神経複合ヒドロゲルのヤング率(脱細胞化脊髄でn=4、複合ヒドロゲル群ごとにそれぞれ3)。エラーバーは標準偏差を表します。統計分析は、Tukeyの事後検定を使用した一元配置ANOVAを介して行われました。略語: ns = 重要ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:3D培養の模式図(A)PDMSマイクロウェルは、SU-8コーティングされたシリコンウェーハ上に作製されました。各マイクロウェルは、8mmの生検パンチを使用して打ち抜きました。(B)脱細胞化脊髄および坐骨神経を異なる比率で、pHを7.4に調整し、hASCsで再懸濁し、プレゲルをマイクロウェル上に置き、37^°Cで30分間インキュベートする。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5:細胞生存率アッセイ。 1日目、4日目、7日目、14日目に神経複合ヒドロゲルで培養したhASCの差の割合(n = 3)。エラーバーは標準偏差を表します。統計分析は、Tukeyの事後検定を使用した一元配置ANOVAを介して行われました。* p<0.05;** p<0.01;ペ<0.005;p<0.001;NS:重要ではありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

SCIの病態生理学は複雑で多面的であると広く信じられています。細胞移植、薬物送達、生体材料などの単一の治療法がそれぞれSCIに貴重な洞察を提供してきたにもかかわらず、SCIの複雑な性質は個々の有効性を制限する可能性がある28,29,30,31。そのため、効果的なコンビナトリアル治療薬を開発する取り組みが増加しています。この研究で説明した神経複合ヒドロゲルは、細胞や薬物の効果的な送達手段として機能する可能性があります。細胞に関しては、ASCは細胞移植の有望な候補の1つです。ASCは、インターロイキン-10(IL-10)やトランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)などの免疫調節因子を分泌するほか、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)などの神経栄養因子を分泌し、後根神経節神経突起伸長の増加とin vivoでの機能回復をもたらす17,19,32,33^。34.水溶液で送達されたASCは、ラットおよびヒトのSCI後の機能回復を促進しました。しかし、ASCの移動、分化、生存、分化の仲介に関する課題が指摘された35,36,37。さらに、移植されたASCの腫瘍形成の可能性については相反する報告があります。いくつかの研究は、ASCがさまざまな種類の癌の増殖と転移に寄与する可能性があることを示しましたが、他の研究も抗腫瘍形成の可能性を示しています38,39,40,41したがって、神経複合ハイドロゲルにおけるASCの長期的な安全性プロファイルは、将来調査する必要があります。ここでは、脱細胞化した脊髄と坐骨神経を別々に研究し、SCI修復を行っています。

脱細胞化した脊髄をSCIのラットモデルに注入し、病変への軸索内成長を刺激し、機能回復を促進しました。しかし、急速な進行により嚢胞が形成され^、治療の4-8週間後に回復が減少した4^{, 42}。無細胞脱細胞化坐骨神経ハイドロゲルをSCIラットに注射し、神経再生を促進したが、急速な分解によりハイドロゲルの有効性は限定的であった²⁴。そこで、近年、脱細胞化組織を用いたコンビナトリアルなアプローチが注目されています。脱細胞化した脊髄ハイドロゲルは、神経幹細胞/前駆細胞の増殖、移動、およびニューロンへの分化を促進することが報告されています⁴。また、N1E-115神経芽腫細胞からの3D神経突起伸長を促進し、脱細胞化した脊髄ハイドロゲルが軸索再生を促進する魅力的な足場である可能性を示している²⁶。脱細胞化した坐骨神経は、シュワンカプセル化で研究されており、SCI⁴³ 後の神経移植片としての可能性が示されています。まとめると、脱細胞化した脊髄と坐骨神経の組み合わせは、軸索再生と組織回復の両方を促進することが期待されます。現在の研究には、ASCを含んだ神経ハイドロゲルの治療効果の評価も含まれていません。したがって、in vitroおよびin vivo研究を通じて、プラットフォームの血管新生促進作用や神経栄養促進作用などの再生能を評価することが不可欠です。さらに、神経複合ヒドロゲルは、シュワン細胞、嗅覚幹細胞、神経幹細胞などの他の細胞タイプをカプセル化するために簡単に適用でき、細胞移植の治療効果を向上させることができます。SCIのさまざまな段階で、神経複合ヒドロゲル内のさまざまな細胞タイプの安全性と有効性を調査することは興味深いでしょう。

複合ハイドロゲルを作製する上で重要なステップの1つは、適切な量の組織、特に脊髄を調製することです。脱細胞化脊髄の収量は、プロトコル(50〜100 mgの脊髄片および100〜150 mgの坐骨神経片)に記載されているように、著しく低いです。したがって、マウスやラットなどの小動物から脊髄を採取または取得することは推奨されません。ウサギなどの少なくとも中型の動物は、かなりの量の脊髄マトリックスを獲得することが推奨されています。また、組織の添加により、必要なペプシン活性化範囲である約1.5-2を超えてpHがシフトする可能性があるため、脱細胞化組織を消化する際にはpHを確認することが重要です。脊髄の脱細胞化のための攪拌時間は、現在のプロトコルでは攪拌速度が遅いため、以前に確立された方法²⁶ よりも長くなります。このプロトコルで使用されるローテーターは最大83rpmを提供しますが、以前に確立された方法では最大200rpmが使用されました。そのため、攪拌時間を2回に増やし、細胞の破片を全て徹底的に洗浄しました。すべての脱細胞化溶液が組織に浸透し、すべての細胞および核内容物を洗浄できるようにするには、ユーザー側の組織学またはDNA分析を使用して、攪拌時間と速度を最適化する必要があります。組織と脱細胞化溶液の比率は、最低1:15 [w / v]であることが示唆されています。以前に確立されたプロトコル²⁶ の脱細胞化組織を室温で消化/攪拌しました。しかし、このプロトコールでは、攪拌板上の磁気バーで4°C、500rpmで4日間消化しました。攪拌板モーターは熱を発生させ、それをプレゲル溶液に導入することができます。そのため、低温で消化するか、温度制御可能な攪拌板を使用することをお勧めします。

DNA分析(図2B)で述べたように、硬膜内にはかなりの量のDNAが見られるため、脊髄の硬膜を切除することが重要です。硬膜は、脊髄実質とは異なり、線維組織で構成されています。したがって、以前に文書化された^44,45のように、異なる脱細胞化方法を利用する必要があります。脱細胞化組織のH&E染色とDNA分析は、脱細胞化プロセスの有効性を検証するために利用されています。脱細胞化を成功させる目標を達成するためには、以下の基準を満たす必要があります: 1. dsDNA/mg ECM乾燥重量が50 ng未満であること、2. DNA断片の長さが200 bp未満であること、3. 組織切片またはH&Eに核物質が不足していること⁵.脱細胞化後のH&E染色の定性分析では、核染色の欠如が示され、細胞の除去が成功したことが示唆されました。さらに、コラーゲンや他のマトリックスタンパク質などのECMの成分は保持され、脱細胞化後に染色強度が低下しました。これは、細胞物質の除去を反映しています。脱細胞化後、DNA含量はECM乾燥重量mgあたり坐骨神経で0.63 ng、脊髄で23.74 ± 6.69 ngであり、これはin vivo適用の許容閾値を下回っています。

この研究で作成した神経複合ヒドロゲルなどの軟質材料の機械的特性を分析するには、高圧縮力のレオメータや引張試験機を使用できないため、複合ハイドロゲルのレオロジー測定は慎重に設計する必要があります。サンプルを引張試験機で把持すると、サンプルは引き裂かれたり引き裂かれたりし、高い力で圧縮すると、分析するのに十分な感度のデータが得られません。この研究では、圧縮力が250Nのレオメータを使用しましたが、ユーザーの目的に合わせて同様の力または適切な力を持つ装置を見つけることをお勧めします。別の方法として、振動せん断測定などのさまざまなレオロジー測定が、貯蔵弾性率と損失弾性率の決定に役立つ場合があります。脱細胞化後の機械的特性の低下は、この研究の限界です。すべてのハイドロゲル基のヤング率は脱細胞化脊髄のそれと似ていますが、新鮮な脊髄とは大きく異なります(データは示していません)。比較的柔らかい材料で培養した神経幹細胞およびMSCは、それぞれニューロンの分化およびβ-IIIチューブリン発現の増加を示した^46,47。ただし、脱細胞化した材料をアルギン酸、ポリ(エチレングリコール)、ゲニピン、グルタルアルデヒドなどの他の材料で補強または架橋することは可能です48,49,50,51。ハイドロゲルの機械的特性を強化するためのこれらの戦略が細胞の挙動や生存率に影響を与えないようにするには、最適化が必要になります。

神経複合ハイドロゲルのバッチ間のばらつきは、動物の年齢、性別、体重、および種の違いによって部分的に観察される場合があります。同じ種類の動物を制御され、一貫して使用することで、ばらつきを軽減するのに役立つ可能性があります。異なる動物からの組織サンプルをプールすることも、バッチ⁵²間のばらつきを減らすのを助けることができる。この研究を臨床応用に変換する際の潜在的な課題の 1 つは、スケーラビリティです。脊髄の脱細胞化の収率が低いと、大量の脱細胞化組織の産生が妨げられます。より多くの組織を生成するために新しい方法を開発/最適化するか、脱細胞化後の収量を増やすために硬膜を一緒に脱細胞化することができます。もう一つの潜在的な課題は、規制当局の認可です。米国では、FDAが細胞ベースの治療薬の規制当局の承認を担当しています⁵³。韓国の規制当局は、膝軟骨欠損治療のための同種臍帯血由来MSCと4%のヒアルロン酸ハイドロゲルからなるMSCベースの製品であるCARTISTEMの市場参入を承認した⁵⁴。このような判例は、安全性と効率性のデータを提供することで、規制当局の審査プロセスを合理化するのに役立つ可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-(デシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸塩	シグマ・オルドリッチ	D4266	坐骨神経脱細胞化、SB-10の際に使用
3-(N,N-ジメチルパルミティ・アンモニオ)プロパンスルホン酸塩	シグマ・オルドリッチ	H6883	坐骨神経脱細胞化の際に使用されるSB-16
AlamarBlue試薬	フィッシャー・サイエンティフィック	DAL1100	AlamaBlueセルビアビルティテストでの使用
コンドロイチナーゼABC	シグマ・オルドリッチ	C3667	坐骨神経の細胞脱細胞化時に使用
クライオスタット	ライカ	CM1860
デオキシリボヌクラエース	シグマ・オルドリッチ	D4263	坐骨神経の細胞脱細胞化時に使用
リン酸二ナトリウム リン酸塩七水和物	VWR	BDH9296	100 mM Na/50 mM phosおよび50 mM Na/10 mM phosバッファーの化学物質
DNeasy 血と血ティッシュキット	キアゲン	69506	DNA分析時に使用
組織学用DPXマウントト、スライドマウント培地	シグマ・オルドリッチ	6522	H&で使用されましたE染色
エオシン	シグマ・オルドリッチ	HT110216	H&で使用されましたE染色
エタノール	VWR	89125-172
ホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	252549	H&で使用されましたE染色
グルターアルデヒド(ジョージア州)	シグマ・オルドリッチ	G6257	PDMS表面機能化における使用
hASC成長培地	ロンザ	PT-4505	胎児用牛血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むhASC培養に使用されました
ヘマトキシリン	VWR	26041-06	H&で使用されましたE染色
ヒト脂肪由来幹細胞	ロンザ	PT-5006
塩酸(HCl)	シグマ・オルドリッチ	320331	脱細胞組織の消化やプレゲル溶液の調整に使用されます
M199メディア	シグマ・オルドリッチ	M0650	プレゲルを希望の濃度まで希釈するために使われます
最適な切削温度化合物	ティッシュテック	4583
ペプシン	シグマ・オルドリッチ	P7000	細胞分離組織の消化に使われます
過酢酸	ラボ・アレー	PAA1001	脊髄細胞脱細胞化の際に使用
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	VWR	97062-948
プレートリーダー	バイオテック・インスツルメンツ	シナジーMx
ポリエチネイミン(PEI)	シグマ・オルドリッチ	181978	PDMS表面機能化における使用
豚の坐骨神経	ティッシュ・ソースLLC		生きた豚で、識別可能な情報も追跡性もない
豚の脊髄	ティッシュ・ソースLLC		生きた豚で、識別可能な情報も追跡性もない
QuantiFluor dsDNAシステム	プロメガ	E2670	DNA成分の解析に使用されます
レオメーター	TAインスツルメンツ	DHR 2
頑丈な回転子	グラスコ	099A RD4512	脊髄細胞脱細胞化の際に使用
塩化ナトリウム(NaCl)	VWR	BDH9286	100 mM Na/50 mM phosおよび50 mM Na/10 mM phosバッファーの化学物質
デオキシコール酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	D6750
二水素リン酸ナトリウム一水和物	VWR	BDH9298	100 mM Na/50 mM phosおよび50 mM Na/10 mM phosバッファーの化学物質
水酸化ナトリウム溶液(NaOH)	シグマ・オルドリッチ	415443	プレゲル溶液の調整に使用されます
SU-8	カヤクアドヴナス素材	SU8-100	シリコンウェハーのコーティングに使用
蔗糖	シグマ・オルドリッチ	S8501	脊髄細胞脱細胞化の際に使用
Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット	ダウ	1317318	ポリジメチルキシロキサン(PDMS)塩基および硬化剤
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	X100	脊髄細胞脱細胞化の際に使用
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド	サーモ・フィッシャー	25300062	hASCの処理および脊髄脱細胞化の際に使用
チューブリボルバーローテーター	サーモ・フィッシャー	88881001	坐骨神経の細胞脱細胞化時に使用
キシレン	VWR	MK866816	H&で使用されましたE染色